专利名称：一种以植物为生物反应器生产治疗艾滋病药物人溶菌酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的制备方法。具体地说是涉及以植物为“生物反应器”生产人溶菌酶蛋白的方法。
2.
背景技术：
艾滋病(AIDS，acquired immunodeficiency syndrome)是由人类免疫缺陷病毒(HIV，human immunodeficiency virus)，也就是艾滋病病毒所引起的传染病。艾滋病病毒进入人体后要经过数年，甚至长达10年或更长的潜伏期以后才发病。艾滋病病毒严重破坏人体免疫功能，病人因抵抗疾病的能力极度下降而重复感染多种疾病，如带状疱疹、口腔霉菌感染、肺结核，特殊病原微生物引起的肠炎、肺炎、脑炎及其他感染，后期常常发生恶性肿瘤。最终因体力长期消耗，全身衰竭而死亡。据统计，按艾滋病目前的流行趋势，每天新增加16000例HIV感染者，其中90％新感染者都在发展中国家，预计下个十年末，全球艾滋病的患病人数即将突破一亿，我国在今后10-15年将进入艾滋病高发期。被称为″当代瘟疫和超级癌症″的艾滋病已引起世界卫生组织(WHO)及各国政府的高度重视，无论是人员和经费的投入均放在首位；我国已将其列入乙类法定传染病，并为国境卫生监测传染病之一。由于至今还没有治疗艾滋病的特效药，也没有可用于预防的有效疫苗。一旦发病，在我国当前的医疗条件下，患者都会在不长的时间内死亡。所以目前艾滋病还是一种病死率高达100％的极为严重的传染病(陈胜昔，国外医药抗生素分册，2000，23(4)155-157.)。
对于艾滋病的治疗，在药物治疗方面，第一类是核苷类逆转录酶抑制剂，现有6个品种齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定和Abacavir，该类药物可以和脱氧核苷竞争性地与逆转录酶结合，从而抑制HIV的复制；第二类是非核苷类逆转录酶抑制剂，可以通过与逆转录酶的非底物结合部位结合而抑制HIV逆转录酶的活性，主要有奈韦拉平、地拉韦啶及Efavirenz(Adkins JC et al.1998；陈胜昔，国外医药抗生素分册，2000，23(4)155-157.)；第三类是HIV水解酶抑制剂，可完全抑制HIV水解酶的活性或将此酶的活性降到极低的水平，从而抑制病毒的包装过程，主要有沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、Nelfinavir、Amprenavir及Lopinavir(Noble S，Goa KL，Drugs，2000，60(6)1383-1385.；陈胜昔，国外医药抗生素分册，2000，23(4)155-157.)。在HIV病毒疫苗方面，已研制出ALVAC疫苗、gp120疫苗、HIV DNA疫苗和HIV活疫苗(Peters BS，Antivir Chem Chemother，2000，11(5)311-313.；O’HaganD et al.，2001；Rose NF et al.，2001；Re MC et al.，2001)。目前国际上对艾滋病的治疗方案趋向联合治疗(鸡尾酒疗法)，但已有的药物对体内的HIV病毒难以根除，所以一旦感染HIV，需要终身服药。而目前抗艾滋病药物不仅价格昂贵，使普通患者无力承担，更难以在发展中国家推广，而且易引起过敏反应、胰腺炎、肝肾损伤、脂肪变性和神经系统病变等不良反应，用药量过大和长时间用药可使不良反应增加，甚至引起死亡。而另一方面，由于HIV病毒极易变异，加之缺少与人类AIDS发病机制完全一致的免疫动物模型，使得HIV病毒疫苗的研究与临床验证受到限制，至今还没有任何一个HIV病毒疫苗能真正应用到临床(魏文青，国外医药学药学分册，2001，28(5)294-297.)。所以，人们一直在继续寻找价格低廉、安全有效的抗艾滋病药物。
1999年3月，纽约大学医学院生物化学系教授李小枫等人的人类的研究小组发现溶菌酶，这种广为人知的大量存在于孕妇的眼泪和尿液中的蛋白质，是一种有效的抗HIV物质。这一成果为目前的艾滋病研究提供了新的方向，它解释了为何接吻与握手不会传染艾滋病，染上艾滋病的母亲不一定会将病毒传染给胎儿这一疑惑。同时，这一突破也揭示了人体蛋白质的新功能，为治疗艾滋病提供了新的途径(Lee-Huang S，et al.，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(6)2678-2681.)。随后的研究表明，溶菌酶可以和体内的DNA和RNA结合，证实了溶菌酶可以作为抗艾滋病的“杀手蛋白”(Steinrauf LK，Biochem Biophys Res Commun，1999，266(2)366-370.)。
溶菌酶(Lysozyme)国际编号为E3.2.1.17.，正式定名为N-乙酰己糖胺酶(N-acetylhexosaminodase)，属胞壁质酶(muramidase)，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramic glycanchydrolase)。它在1922年由英国细胞学家弗莱明(Alexander Fleming)于鼻黏液中首次发现，1937年Abrabam从卵清中分离、制出晶体。溶菌酶广泛存在于自然界中的各种微生物、原生动物、人和动、植物组织中。但不同来源的溶菌酶，其抗菌谱也不尽相同。传统研究表明(Holer E et al.，1975；Valerie AP，Cunningham FE，Food Science andNutrition，1988，26(4)359-395.；张宗岩，1995)，溶菌酶是一种能分解粘多糖的多肽酶，可以溶解革兰氏阳性细菌的细胞壁而具有溶菌作用，其原因在于它能水解N-乙酰葡萄糖胺与H-乙酪胞壁酸之间的β-1，4糖苷键。这是溶菌酶一般应用的基础，也是它得名的原因。
从目前来看，溶菌酶在医疗临床上具有很高的实用价值。可与血液中的病菌或病毒结合，而具有抗菌、抗病毒、止血、消肿及加快组织恢复功能等作用。临床上可用于慢性鼻炎、急性、慢性咽喉、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等的治疗。对预防龋齿也有一定的效果。溶菌酶还是人体内的非特异性免疫因子，可提高肌体的免疫力，并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子有很好的协同作用。有关溶菌酶抗肿瘤的药理研究结果表明，溶菌酶可作为一种较强的免疫调节因子用于预防和治疗恶性肿瘤，甚至对恶性肿瘤晚期患者仍有一定疗效(张云波等，2001)。
根据人溶菌酶的生物学特性，将人溶菌酶作为抗艾滋病药物，与目前上市的传统型抗艾滋病药物相比，有以下优点1.人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药效，针对艾滋病这类复杂的免疫系统疾病具有一定优势。2.人类的分泌物成了艾滋病病原的克星，制成的药物就不太可能产生抗体的副作用，这对治愈艾滋病更为有效。3.人溶菌酶是人体天然产物，不产生耐药性，可解决抗生素带来的耐药性难题。4.人溶菌酶本身是一种天然蛋白质，安全无毒性，易被人体吸收，不在体内残留。
但因人溶菌酶来源困难，目前国际上尚无工业化生产。利用植物作为反应器，产生人溶菌酶用作为抗艾滋病药物，至今未见国内外报道。
而植物基因工程的迅猛发展，为人溶菌酶的大规模工业化生产奠定了良好的基础。在国际上，植物基因工程研究的一个新发展趋势就是利用转基因植物生产药物，通过把重组的编码活性多肽的基因导入植物，利用植物作为反应器，大量产生这些药物蛋白。在细菌、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、转基因动物和植物等众多的表达体系中，转基因植物作为新兴的生物反应器具有其自身的优势。
首先转基因植物作为生物反应器进行外源蛋白的生产其产量高。测试各表达系统对130种蛋白的表达情况的结果显示，在转基因植物中外源基因产生的蛋白表达量能达到可溶性蛋白的4-5％。
其次，利用转基因植物作为生物反应器进行生产的过程简单、快速、灵活、成本低。这一点对于大规模商业化生产而言是非常有利的。尤其可以降低目前居高不下的抗爱滋病药物的生产成本。一棵转基因植物就是一个植物生物反应器。而且可利用现有的一套耕种、收获、加工、储藏的农业基础设施。
第三、利用转基因植物生产一些工业和医用蛋白的另一个突出优点是植物材料的收获，长期贮存和运输非常的方便，尤其是植物的种子贮存和运输是基本上不需要任何复杂的管理和监控的。
第四、我们知道，蛋白质的三维构型决定着蛋白的功能。由于转基因植物是真核表达系统，可以进行基因正确的转录、翻译、加工，使外源蛋白形成正常的三维构型，从而保证了蛋白的功能不受影响。
总之，无论从生产成本、生产的管理、以及安全性方面，利用植物生物反应器生产抗爱滋病药物蛋白，都具有着无可比拟的优势。而作为叶菜的代表，叶用莴苣的叶片占全株的比例较大，其叶可直接生食，利用莴苣转化植株来表达外源基因，其表达产物不仅可以大量提取，而且可以通过直接食用的方式加以利用，这对所表达的抗爱滋病药物蛋白十分有利。
本发明还提供了一种利用植物作为反应器生产重组人溶菌酶的方法，可以用来大量产生抗肿瘤和抗爱滋病病毒药物。
对于构建人溶菌酶cDNA的植物表达载体，国内外尚未见报道。
本发明所构建的人溶菌酶cDNA(序列如SEQ IN NO 1所示)的植物表达载体，重组人溶菌酶基因是在植物核强启动子35S下游，并且在35S和该基因之间有一个起增强作用的Ω序列，可以增强转化后的基因表达。在所构建的植物转化载体中，同时包含了筛选标记基因的表达盒和标记基因绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达盒。含有这两个表达盒的农杆菌能在卡那霉素培养基上生长并在兰光激发下发出绿色荧光，而且GFP基因本身又是以一种融合蛋白的形式表达，因此，作为安全有效的报告基因用于植物的遗传转化则更为快捷，它能很方便地进行转化植株的检测。筛选标记基因来自于细菌的NPTII基因编码新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphtransferase)，能赋予细胞抗卡那霉素的能力，这是转化中常用的一种筛选标记。
4.
图1.人溶菌酶cDNA的大肠杆菌表达载体的构建图2.人溶菌酶cDNA的植物表达载体的构建HHindIII；BBamHI；NNcoI；SSalI；EEcoRI；5.
具体实施例方式实施例1.重组人溶菌酶cDNA在大肠杆菌中的表达1、重组人溶菌酶cDNA的大肠杆菌表达载体的构建(1)溶菌酶cDNA的克隆从人胎盘中提取总mRNA，进行RT-PCR反应。根据Genebank公开的溶菌酶基因序列(HSU25677)设计引物(北京奥科生物工程公司合成)引物15’-GCGGCTAGCGATGAAGGCTCTCATTGTTCTG-3’引物25’-GCGCTCGAGGCTTACACTCCACAACCTTGA-3’得到编码人溶菌酶成熟蛋白的cDNA片段。
(2)将该人溶菌酶成熟蛋白cDNA片段构建到含有Lac启动子的pET-28a(Novegon公司产品)中先将人溶菌酶成熟蛋白的cDNA片段经NcoI/EcoRI酶切，连入同样经NcoII/EcoRI酶切的大肠杆菌表达质粒pET-28a中。
(3)将上述连接的重组载体采用氯化钙法导入大肠杆菌BL21(购自北京鼎国生物公司)，筛选重组转化子。(见Sambrook《分子克隆》试验指导)(3)对克隆的重组片段进行测序测序采用Sanger双脱氧终止法在ABI377 DNA测序仪上进行序列测定，得到编码人溶菌酶成熟蛋白的cDNA片段为456个碱基对，具体核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并推导出其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。由此，证明了目的片段已正确插入大肠杆菌克隆表达质粒pET-28a，将该质粒载体命名为pET-lyz；将pET-lyz用EcoRI/SalI酶切，与同样EcoRI/SalI酶切的GFP基因(Genebank，Cloning vector pGreen A19 complete sequence.U56997，2942bp DNA circular的有效编码片段，序列见SEQ ID NO 3)的PCR产物连接，构成人溶菌酶cDNA的另一个原核表达质粒载体pET-lyzg(图1)。
2、溶菌酶cDNA在大肠杆菌中的诱导表达1)表达质粒的转化将原核表达载体pET-lyz、pET-lyzg转化大肠杆菌BL21D。
2)用接菌环从平板上挑取转化了pET-lyz、pET-lyzg的单克隆重组菌落，接种于1ml含氨苄青霉素的LB培养基中，放入恒温空气摇床中，37℃振荡培养12小时。
3)吸取过夜培养的菌液50ul，接种于5ml卡那霉素LB培养基中，接种比率为1％，37℃剧烈振荡培养，2-4小时，使细菌处于对数生长中期，OD600值约为0.6-1.0。
4)从5ml对数生长期菌液中取1ml做对照，向其余4ml菌液中加入1mol/L IPTG溶液4ul，使其最终浓度为1mmol/L。
5)继续培养1-4小时，每隔1小时取1ml，1000Xg离心10min，取上清与沉淀分别保存待用。最后离心收获细菌。
6)分离纯化蛋白，用SDS-PAGE，考马斯亮兰R-250染色(以上各步骤均参考Sambrook，《分子克隆实验指南》一书进行)，鉴定表达产物的分子量和表达水平，结果表明，表达产物以包含体的形式存在于胞内，诱导3小时达到表达量的最高峰，pET-lyz、pET-lyzg表达的重组蛋白表达水平都占菌体总蛋白的20％左右。表明目的基因可以实现高效表达。
3.重组人溶菌酶的分离纯化与鉴定(1)使用Novegon公司的组氨酸标蛋白分离纯化试剂盒进行分离纯化，步骤按说明书操作。
(1)上述所得产物按常规方法透析、冷冻干燥，得到人溶菌酶干粉。
(2)0.9％的氯化钠溶解人溶菌酶干粉，按《分子克隆实验指南》所述方法做Northern杂交，证明确为人溶菌酶。
4.重组人溶菌酶的活性检测参照陈凤珍等的方法检测(广东蚕丝通讯，1988(3)35-42)pET-lyz、pET-lyzg表达的重组蛋白，底物为Sigma公司的溶壁微球菌的菌粉，用0.1MPH6.2磷酸缓冲液制成悬浊液，标准酶液为Sigma公司的卵清溶菌酶(43000单位/mg蛋白)，按公式溶菌酶活力(U/mg)＝OD450nm/(0.001*mg酶/ml反应液)计算溶菌酶活力，测得平均溶菌酶活力为41500单位/mg蛋白，完全可用于药用。实施例2.人溶菌酶基因的植物表达载体的构建在本实施例中，将编码人溶菌酶的基因连接在植物核强启动子35S下游，并且在35S和该基因之间有一个起增强作用的Ω序列，可以增强转化后的基因表达。在所构建的植物转化载体中，同时包含了筛选标记基因的表达盒和标记基因绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达盒。
A、用于基因枪转化的植物表达载体pBlyzg的构建1.质粒pUC-18用BamHI和Sal I双酶切，电泳回收切开的线性质粒。
2.植物核转化质粒pBTu(以pBluescript SK(+)为基本质粒，构建上所需的多克隆位点，并包含植物核强启动子35S，起增强作用的Ω序列，筛选标记卡那霉素基因的表达盒。)也用BamHI和SalI双酶切，电泳回收切下的1.1kb片段。
3.利用T4DNA连接酶将上述两回收片段连接，得到中间载体前体质粒pPB1，该质粒在BamHI和SalI之间有一个NcoI切点。
4.利用NcoI和SalI双酶切该中间载体前体质粒pPB1，电泳回收2.7kb载体片段。之所以这么做是由于pBTu作为植物表达载体，但其上有多个NcoI的切点，无法直接利用，所以只能先从质粒pBTu上用BamHI和SalI切下一个片段，将pBTu上用BamHI和SalI切下的1.1kb片段与同样酶切的pUC-18质粒连接后，获得中间前体质粒pPB1，然后利用其在BamHI酶切点下游紧接着的一个NcoI切点，再用NcoI和SalI酶切中间载体pPB1，这样就可将目的基因插入到pPB1的主体为pBTu质粒的大小为2.7kb的NcoI和SalI的酶切点间，从而构建出所需要的载体质粒。
5.将上述2.7kb载体片段与用NcoII/SalI从大肠杆菌表达质粒pET-lyzg切下人溶菌酶基因(含GFP片段)利用T4DNA连接酶连接，获得构成重组人溶菌酶基因的可以用于基因枪转化的真核表达载体pBlyzg。(见图2)B、农杆菌转化法植物表达载体的构建1.采用小量碱法提取植物核表达载体质粒PBG质粒(本实验室基于pBI121构建的农杆菌真核表达载体，包含植物核强启动子35S，起增强作用的Ω序列，筛选标记卡那霉素基因的表达盒，外源基因部分均在pBI121的T-DNA上)和上述质粒pBlyzg，利用BamHI和SalI双酶切这些质粒，电泳回收质粒PBG切下的约10kb的载体片段和含重组人溶菌酶基因的载体pBlyzg1,200bp的基因片段。
2.利用T4DNA连接酶将上述回收的PBG载体片段和重组人溶菌酶基因片段连接，从而可获得重组人溶菌酶基因的用于基因枪转化的表达载体质粒PBGlyzg。实施例3.转基因植物的获得1.农杆菌转化法将溶菌酶基因导入莴苣
A将质粒PBGlyzg转化农杆菌(1)农杆菌LBA4404的感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml YEP(含利福平20mg/L，链霉素30mg/L)的培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜。
将2ml过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的YEP培养基，28℃，220rpm快摇3-4h，使OD600＝0.5。
5000rpm离心5min，去上清，加入10ml 0.15mol/L NaCl悬浮细胞，冰浴20min。
4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入1ml预冷的20mmol/L CaCl2重悬细胞(15％丙三醇)，分装于1.5ml Eppendorf管中(200μl/管)保存于-70℃待用。
(2)农杆菌LBA4404的转化反应采用冻融法转化农杆菌。
取5μl含目的DNA的质粒pBGlyzg加入到200μl LBA4404感受态细胞中，冰浴30min。
液氮中速冻5min，37℃融化5min。
加入1ml YEP培养基，28℃ 150rpm轻摇2-3h。
收集菌体涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(100mg/L)的YEP平板上，28℃培养2-3天。
(3)转化了质粒pBGlyzg的农杆菌转化子的鉴定选取单菌落，液体培养后小量制备质粒，电泳检查质粒pBGlyzg的大小，并进一步利用GFP引物进行PCR扩增以确定pBGlyzg的已转入农杆菌。
PCR检测方法PCR体系10ul PCR预混液Master(Premix Extaq大连宝生公司)，GFP3’引物和GFP5’引物各30ng，10ng质粒DNA，加水到20ulPCR程序变性94℃2分钟后接25循环体94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟，72℃延伸5分钟。
PCR在BioMetre PCR仪上进行。
B.利用含有溶菌酶基因的农杆菌转化莴苣(1)受体材料的培养及预处理将莴苣种子用20％次氯酸钠消毒15分钟后，播种在MS培养基上待其发芽生长，生长条件为2000lux光照(16小时/天)，1个月后剪取其真叶叶片和叶柄作为受体植物。
(2)用农杆菌介导法将溶菌酶基因导入莴苣挑取上述转化了质粒pBGlyzg的农杆菌转化子(单菌落接种于含Kam50的YEP平板上，28℃培养24小时后刮取少量菌苔，放入小离心管中，用适量YEP液体培养基稀释，利用1mL无菌的注射器吸取稀释好的转化了质粒pBGlyzg的农杆菌的菌液感染莴苣的真叶叶片、叶柄，然后放于普通MS培养基上暗培养2天，然后将共感染农杆菌的叶片和叶柄转入加有50mg/L的卡那霉素和500mg/L的羧苄青霉素MB2培养基上光照培养，4周后转入附加卡那霉素100mg/L和羧苄青霉素250mg/L的MB5培养基上光照培养。
抗卡那霉素的再生植株显示出绿色。将绿色植株筛选出来后，再次接种到筛选培养基上，继续培养，最终得到稳定的绿苗。将绿苗进行基因组DNA的PCR扩增检测及Southern杂交检测均显示出阳性反应，这表明目的基因已整合到莴苣基因组中。由此利用农杆菌转化法生产出转化了人溶菌酶基因的莴苣2.基因枪转化法将溶菌酶基因导入莴苣(1)外植体准备无菌苗将莴苣种子用0.1％升汞消毒15分钟后，播种在MS培养基上待其发芽生长后，取其嫩叶平铺于MS培养基上培养2-3天备用。
消毒叶片水培莴苣嫩叶用4％次氯酸钠消毒15分钟后，平铺于MS培养基上培养5天备用。
愈伤组织无菌苗叶片放于MB2培养基上连续诱导培养30天以上形成的绿色愈伤组织(2)质粒大量制备用于基因枪转化的真核表达载体pBlyzg，用100mlLB液体培养基扩增培养过夜后，收集菌体并用碱裂解法提取质粒DNA，提取质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测纯度及浓度。
3.植物培养基MSMS基本成分、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，PH5.8。
MB1MS+6-BA 1mg/L，pH5.8MB2MS基本成分+6-BA0.2mg/L+IAA1.0mg/L、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，PH5.8。
MB5MS基本成分+6-BA0.5mg/L+IAA1.0、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，PH5.8。
MB6MS基本成分+6-BA 6mg/L，pH5.8MN蔗糖3％、无机盐用1/2MS、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，PH5.8。
4.基因枪子弹制备(1)钨粉悬液的制备60mg钨粉(Φ0.8UW)放在离心管中加无水乙醇，用超声波粉碎机30秒一次间隔1分钟至温度发烫，静置5分钟，离心10000rpm5分钟去上清；加1ml无水乙醇涡旋5分钟，静置1分钟，离心10000rpm5分钟去上清；加入1ml无菌水涡旋3分钟，离心10000rpm5分钟去上清(重复3次)；在沉淀的钨粉中加入50％甘油1ml，震荡成为悬浮液，分装50μl/管，放于4℃保存。
(2)微弹的制备取1管50μl钨粉加入5μl质粒LBG-A震荡30秒，加20μl亚精胺(0.1M)震荡30秒，加50μlCaCl2(2.5M)涡旋60秒，静置1分钟离心3000rpm30秒去上清，加入150μl70％乙醇洗沉淀，离心3000rpm10秒去上清，加入无水乙醇150μl不破坏沉淀静止1分钟去上清，加入60μl无水乙醇重悬。轰击时每枪取10μl。
5.基因枪转化基因枪是由美国BIO-RAD公司生产的PDS-1000/He Biolistic particledelivery system。所采用的参数为真空度28inches.Hg、轰击距离9cm、氦气压力1100psi，进行转化。轰击后外植体放于普通MS培养基上2天，然后转化含有卡那霉素培养基上培养，首先用的是MB2培养基，经过约2-4周时间的诱导和筛选培养，或外植体有愈伤组织出现时转入MB5培养基上，继续培养，三周后将得到的抗性绿色芽丛转入MB6附加卡那霉素的筛选分化培养基，在此培养基上连续继代两次，每次三周。然后将获得的绿芽转入MB1附加卡那霉素的分化培养基，在此培养基上长大的再生苗转入MN附加卡那霉素的生根培养基，根系发育良好的植株栽入盆土中。取诱导出的诱导芽，在长波紫外灯下或在荧光显微镜(OlmpusBX51)下用兰光激发可发出绿色荧光，证明外源基因在植株中得到表达，分子生物学检测结果也证实了这一点将绿苗进行基因组DNA的人溶菌酶基因片段PCR扩增检测及Southern杂交检测均显示出阳性反应，这表明目的基因已整合到莴苣基因组中。实施例4.转基因植物表达蛋白的检测1.阳性抗源制备将原核表达载体质粒pET-lyzg，参照相关pET产品说明书将转化子菌体进行诱导培养，收集菌体，分离产物经SDS蛋白电泳检测纯度后为阳性抗源。另外蛋白还可从SDS-PAGE胶上切下，干燥粉碎后注射兔子获得相应的抗血清。
2.Western blotting分析(1)从转基因莴苣中提取表达的人溶菌酶植物表达蛋白的提取取100mg植物材料转基因莴苣，加研磨缓冲液(10mM Tris.Cl，0.02NaN，0.001％PMSF，pH8.0)200μl，冰浴中研成匀浆，5000rpm室温下离心10分钟，取上清，-20℃保存待用。
(2)SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳检测对表达产物人溶菌酶按常规方法进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度8％，考马斯亮兰R-250染色，甲醇-乙酸脱色。
结果表明，所提蛋白大小在44KD，确认是目的蛋白。
(3)溶液的配制电转移缓冲液含39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·HCL(pH6.8)，037％SDS，20％甲醇。
配制1000mL称取甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS0.37g，溶解于750mL重蒸水后，加入200mL甲醇，定容至1000mL。
洗液溶液150mmol/L NaCL，50mmol/L Tris·HCL pH7.5；封闭液10mL PBST+0.3g BSA；0.5％氨基黑10B染液称取氨基黑10B 0.5g，加入甲醇45mL，冰乙醇10mL，重蒸水45mL；
氨基黑漂洗液45mL 95％的乙醇，5mL冰乙酸，50mL无离子水；底物溶液(30mL)30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)和9mg CoCL2，再加入10μL 30％H2O2。
(4)电转移剪6张与上述电泳凝胶大小一致的滤纸及一张NC膜，并用转移缓冲液浸泡3-5min。依次将海绵、滤纸3张、凝胶、NC膜、滤纸3张、海绵放好，然后用筛孔板固定好，插入电转移槽中，加入转移缓冲液，确定凝胶在阴极，NC膜在阳极方向。接通电源，电压为50-100V，4℃下电泳2-3h。电转移完毕，取出NC膜，用铅笔或剪去一角以标记膜的方向。切下标准分子量Marker，置氨基黑染液浸染5min，取出后用漂洗液脱色，直至蓝色背景脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加10mL封闭液浸泡，室温震荡1-3h，以封闭未吸附蛋白质的位点。
(5)免疫学检测封闭结束后，将转了目的蛋白的NC膜用PBS漂洗液漂洗4-5次，每次5min。将NC膜转至一塑料袋内，加入测试抗体—兔抗人溶菌酶抗血清(利用阳性蛋白注兔子产生的)10mL(0.1mL/cm2)，封口。37℃轻微震荡结合1.5hr，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。然后加入1∶800稀释的兔抗羊IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1h，取出用PBST冲洗3-4次，每次10min。以除去未结合的二抗。
将NC膜转入到底物溶液，室温避光轻摇5-10min，观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液终止反应。结果证实重组人溶菌酶基因确实在莴苣中得到了表达。
SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)长度456个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性序列描述SEQ ID NO 11 ATGAAGGCTC TCATTGTTCT GGGGCTTGTC CTCCTTTCTG TTACGGTCCA GGGCAAGGTC61 TTTGAAAGGT GTGAGTTGGC CAGAACTCTG AAAAGATTGG GAATGGATGG CTACAGGGGA121 ATCAGCCTAG CAAACTGGAT GTGTTTGGCC AAATGGGAGA GTGGTTACAA CACACGAGCT181 ACAAACTACA ATGCTGGAGA CAGAAGCACT GATTATGGGA TATTTCAGAT CAATAGCCGC241 TACTGGTGTA ATGATGGCAA AACCCCAGGA GCAGTTAATG CCTGTCATTT ATCCTGCAGT301 GCTTTGCTGC AAGATAACAT CGCTGATGCT GTAGCTTGTG CAAAGAGGGT TGTCCGTGAT361 CCACAAGGCA TTAGAGCATG GGTGGCATGG AGAAATCGTT GTCAAAACAG AGATGTCCGT421 CAGTATGTTC AAGGTTGTGG AGTGTAACGA GTCGACSEQ ID NO 2的信息序列特征(A)长度148个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性序列描述SEQ ID NO 21 M K A L I V L G L A L L S V T V Q G K V21F E R C E L A R T L K R L G M D G Y R G41I S L A N W M C L A K W E S G Y N T R A61T N Y N A G D R S T D Y G I F Q I N S R81Y W C N D G K T P G A V N A C H L S C S101 A L L Q D N I A D A A A C A K R V V R D121 P Q G V R A W A A W R N R C Q D R D V R141 Q Y V Q G C G VSEQ ID NO 3的信息序列特征(A)长度2942个碱基对(B)类型核苷酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性序列描述SEQ ID NO 31 ttatttgtat agttcatcca tgccatgtgt aatcccagca gctgttacaa actcaagaag61 gatcatgtga tctctctttt cgttgggatc tttggaaagg gcagattgtg tggacaggta121 atggttgtct ggtaaaagga cagggccatc gccaattgga gtattttgtt gataatggtc181 tgctaattga acgcttccat ctttaatgtt gtgtctaatt ttgaagttaa ctttgattcc
241 attctttggt ttgtctgcca tgatgtatac attatgtgag ttatagttgt attccatttt301 gtgtccaaga atgtttccat cttctttaaa atcaatacct tttaactcga ttctattaac361 aagggtatca ccttcaaact tgacttcagc acgtgtcttg tagttcccgt catctttgta421 aaatatagtt ctttcctgta cataaccttc gggcatggca ctcttgaaaa agtcatgctg481 tttcatatga tctgggtatc ttgaaaagca ttgaacaccg taagcgaaag tagtaacgag541 tgttggccat ggaacaggta gcttcccagt agtgcaaata aatttaaggg taagttttcc601 gtatgttgca tcaccttcac cctctccact gacagagaat ttttgcccat taacatcgcc661 atctaattca acaagaattg ggacaactcc agtgaaaagt tcttctcctt tactggaatt721 cgagctcggt acccggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat781 catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac841 gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa901 ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat961 gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc1021 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg1081 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag1141 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc1201 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag1261 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga1321 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc1381 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg1441 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt1501 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca1561 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca
1621 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag1681 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca1741 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg1801 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa1861 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta1921 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag1981 cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga2041 tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac2101 cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc2161 ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta2221 gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac2281 gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat2341 gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa2401 gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg2461 tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag2521 aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc2581 cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct2641 caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat2701 cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg2761 ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc2821 aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta2881 tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg2941 tc
权利要求
1.一种人溶菌酶基因，具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列。
2.一种人溶菌酶基因编码的多肽，具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
3.一种包含权利要求1所述的人溶菌酶基因的原核表达载体。
4.一种将权利要求3所述的原核表达载体转化到大肠杆菌中表达的多肽，其特征在于该表达的重组人溶菌酶多肽的平均溶菌酶活力为13000-50000单位/mg蛋白。
5.一种如权利要求4所述的重组人溶菌酶多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
6.一种产生权利要求4或5所述的重组人溶菌酶多肽的方法。
7.一种如权利要求4或5所述多肽的用途，其特征在于该表达的活力为13000-50000单位/mg蛋白的重组人溶菌酶多肽作为药用。
8.一种真核表达载体，其特征在于，该表达载体包含人溶菌酶基因。
9.一种如权利要求8所述的真核表达载体，其特征在于，该表达载体包含的人溶菌酶基因具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列。
10.一种如权利要求8所述的真核表达载体，其特征在于，该表达载体包含的人溶菌酶基因编码SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
11.一种以植物为生物反应器生产重组人溶菌酶多肽的方法，其特征在于，将权利要求8-10任意一项所述的植物表达载体导入植物中，使其产生编码人溶菌酶的多肽。
12.一种如权利要求11所述以植物为生物反应器生产重组人溶菌酶多肽的方法，其特征在于，该植物为莴苣。
13.一种人溶菌酶多肽，其特征在于，该多肽是通过权利要求11或12的方法获得的。
14.一种权利要求13所述的人溶菌酶多肽的用途，该多肽可用于治疗艾滋病，肿瘤及病毒病等。
全文摘要
本发明提供了一种以植物为“生物反应器”生产人溶菌酶的方法。本发明从人胎盘中克隆了人溶菌酶基因，并将该基因构建到原核表达载体中，使该基因在原核中高效表达。然后又构建了植物表达载体，并将其成功地导入了莴苣(生菜)核基因组中，实现了人溶菌酶基因在高等植物中的表达，得到了一种含有人溶菌酶的莴苣。用这种方法大量生产的溶菌酶，可用于治疗艾滋病，肿瘤及病毒病等。
文档编号C12P21/02GK1468960SQ0310058
公开日2004年1月21日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者周长生, 谢小冬, 陈正华 申请人:甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司