一种特异性检测egfr的方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异性检测EGFR的方法，根据EGFR的mRNA序列，设计PCR引物，在下游PCR引物的5’端加上脱氧核酶的反义序列，并在反应体系中加入该脱氧核酶的特异标记底物，该特异标记底物的上下游分别标记了荧光发射基团和荧光淬灭基团；PCR扩增产生脱氧核酶的正义序列，产生具有切割活性的脱氧核酶并切断特异标记底物，使淬灭作用消失，产生荧光信号；根据荧光信号与PCR产物之间的对应关系，对EGFR进行定量或突变检测。该方法具有特异性强、灵敏度高及自动化程度高的特点。
【专利说明】一种特异性检测EGFR的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体涉及一种特异性检测EGFR的新型分子技术，可进行EGFR基因表达水平和基因突变检测，主要用于临床诊断、实验室研究、药效监测等领域。
【背景技术】
[0002]肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展显示，肿瘤存在高度复杂的基因变异与异质性。肿瘤的靶向治疗是利用肿瘤细胞与正常细胞的分子生物学差异进行专一性药物开发，作用于肿瘤细胞特异靶标，从而靶向杀伤肿瘤细胞。近年来在靶向治疗的基础上，个体化治疗(Personalized Medicine)通过检测患者体内的有关药物作用的祀位，评价药物可能的作用，从而提高治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用(Gonzalez-Angulo AM 等，J Clin Oncol.，2010，28:2777-83)。
[0003]随着对恶性肿瘤基础研究的不断深入，针对癌细胞异常通路和靶点的分子药物有着广阔的应用前景。研究发现，肿瘤细胞中表皮生长因子(epidermal growth factorreceptor, EGFR)高表达或突变以后异常活跃，导致细胞无限制增殖，最终发生肿瘤的局部浸润和远处转移。临床患者中已证实EGFR的过表达与肿瘤的恶性程度、浸润转移情况、不良预后均有密切关系，是一个重要的分子靶点。目前，针对EGFR分子靶向治疗已广泛应用于各类肿瘤的治疗，相对于传统化疗药物已显现出其独特的优势。EGFR是具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase , TK)的细胞膜表面受体，由原癌基因c-erbB_l所编码，分子量为170KD。EGFR结构包括三个区域:胞外区、跨膜区和具有TK活性的胞内区。EGFR的配体如EGF与受体结合后，可以使受体发生二聚体化并改变了受体的构象，然后激活其中的酪氨酸激酶，表现为受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化。磷酸化后的酪氨酸激酶募集含SH2结构域的信号转导蛋白，然后激活下游的多个信号途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B (phosphatidylinositol3-kinases/AKT)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases, MAPK)及信号转导和转录激活子(signal transducer and activator oftranscription, STAT)。上述信号的异常活化最终导致细胞诸多转录因子异常活跃并逐渐发生凋亡抑制、增殖失控等各种恶性肿瘤细胞特有的生物学行为(Burgess AW等，GrowthFactors, 2008, 26 (5):263-274)。目前针对EGFR开展的分子靶向治疗有两大类:一类是EGFR单克隆抗体，主要作用于EGFR的细胞外区域和各种配体(如EGF，TGF_D)竞争结合，并导致EGFR失去活性,包括帕尼单抗(Panitumumab)和西妥西单抗(Cetuximab)。另一类是进入细胞内的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),系与ATP竞争结合酪氧酸激酶并间接抑制其功能的小分子化合物。常见的EGFR-TKI包括吉非替尼(Gefinirib)、厄洛替尼(Erlotinib)、Η)153035等。这些靶向药物的疗效已经在肺癌患者的个体化治疗中得到肯定，如针对EGFR的酪氨酸激酶结构域的抑制剂(Gefitinib，Erlotinib)已被应用于晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCL)等恶性肿瘤的临床治疗。结果显示，EGFR基因突变、扩增与Gefitinib和Erlotinib的药物敏感性呈正相关(Paez JG等，Science, 2004，304:1497-500)，EGFR 突变阳性患者 Gefitinib 治疗的有效率达 71.2%,野生型者治疗有效率却低至1.1 %。目前，临床研究中，特别是在部分患者用传统化疗药物无效的情况下，发现EGFR对其仍然有效。近年来，靶向EGFR的新型药物已逐渐应用于乳腺癌、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌以及盆腔和泌尿道等肿瘤的治疗。
[0004]对肿瘤特异的靶分子进行分子诊断是个体化靶向治疗的前提和基础。目前，分子诊断技术繁多，发展迅速，但大多方法都有一定的缺点。例如目前为临床提供mRNA表达水平检测大多采用的荧光定量PCR法，虽然其简单方便，灵敏度高，但其无论在科研还是临床应用过程中还存在着一些不足，如在Taqman荧光定量PCR技术中，由于涉及到两条引物和探针之间的相互干扰，荧光探针设计的难度高；同时荧光探针对实验条件的影响很大，不同的荧光探针要求不同的Tm值，因此不同的检测项目要求不同的热循环条件，难以实现高通量的检测(Petak I等，Nat Rev Drug Discov.，2010,9:523-35)。再如测序作为基因突变检测金标准，但临床应用有诸多缺陷，如周期长、技术复杂、开放式检测引起的污染、灵敏度低、需要样本量大等，因此，研究开发新型特异性强、稳定性好、灵敏度高的简单方便的分子诊断方法是科研和临床诊断领域的迫切需求。
[0005]催化性核酸-脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的短片段单链DNA，具有高效的结构识别能力和催化降解活性。脱氧核酶具有结构简单、对底物的趋近性好、催化效率及特异性高等优点(Sun LQ等，Pharmacol Rev.，2000, 52 (3): 325-47)，可以有效地降解靶分子，已广泛应用于实验室的基因沉默研究和新型靶向药物的开发等领域。
[0006]根据脱氧核酶的特点，结合PCR方法，设计和建立一种新型的分子检测技术(Catalytic Nucleic Acid based Detection, CND)。CND 技术工作原理是运用常规PCR 体系，在PCR引物的5’端加上通 用脱氧核酶的反义序列，并在反应体系中加入脱氧核酶的特异标记底物。底物上下游分别标记上荧光发射基团和荧光淬灭基团，由于距离相近，两基团相互作用不产生荧光。PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列，产生具有切割活性的脱氧核酶，并切断标记底物，使淬灭作用消失，产生荧光信号(如图1所示)。由于荧光信号与PCR产物成对应关系，因此可以对核酸模板进行准确实时定量。
[0007]CND分子检测技术利用了荧光定量PCR的检测原理，具有其特异性强、灵敏度高及自动化程度高的特点，同时由于CND技术使用了通用脱氧核酶及底物作为信号放大和信号报告系统，具有独特的优点:1.设计简单:由于使用了通用脱氧核酶及底物这一发光检测系统，在建立不同靶分子检测系统时，CND技术只需要相应改变特异的PCR扩增引物，而Taqman荧光PCR定量等技术则还需要筛选相应的荧光探针。2.灵敏度高:PCR的放大效应和底物被切割后荧光的释放双重效应的叠加；3.稳定性好:CND不同检测靶分子仅引物部分序列不同，实验条件较为均一 ；4.能实现多基因/多位点同时检测:CND设计相对简单、反应共性强，利用多个通用脱氧核酶及其底物系统，不同的靶分子或多个位点的检测可以在同一次热循环中完成，使高通量检测成为可能；5.简便快速:检测在荧光PCR仪中自动完成。
[0008]CND技术所具有的特点使其可以在临床肿瘤的个体化化治疗的分子诊断、实验室研究、药效监测等领域中发挥作用。本发明是利用CND技术原理，开发出一种特异性检测EGFR的新型分子检测技术。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种以催化性核酸-脱氧核酶为基础的特异性检测EGFR的新型分子检测技术。
[0010]本发明的技术方原理如图1所示，在常规PCR体系中，PCR下游引物的5’端加上通用脱氧核酶的反义序列，并在反应体系中加入脱氧核酶的特异标记底物。PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列，并切断特异标记底物，使底物中的淬灭作用消失而产生荧光信号。由于荧光信号与PCR产物成对应关系，因此可以对靶分子核酸进行准确定量。
[0011]本发明的第一方面，在集信号放大和信号报告为一体的通用脱氧核酶及其底物的基础上，结合PCR方法建立新型分子检测技术。利用通用脱氧核酶为10-23型脱氧核酶结构，依据脱氧核酶设计的原则，通过大批量的筛选而获得的具有最佳切割活性的配对脱氧核酶及其底物。
[0012](一 )本发明所提供的通用脱氧核酶的设计原则如下:
[0013]1、通用脱氧核酶根据特异底物序列设计；
[0014]2、所设计的脱氧核酶在空间上对底物序列具有易接近性；
[0015]3、总杂交自由能小(Δ G0〈_20kcal/mol)；
[0016]4、脱氧核酶以反义序列连接在PCR引物的5’端上；
[0017]5、脱氧核酶的反义序列由29-33个核苷酸残基组成，自5'到3'的方向由磷酸二酷键连接；
[0018]6、脱氧核酶的正义序列由与底物配对的结合序列和GGCTAGCTACAACGA催化功能序列连接组成；
[0019]7、5’和3’的结合序列分别为7-9个核苷酸残基；
[0020]8、PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列，能够特异性地切割位于对应底物中的嘌呤与嘧啶间的连接键；
[0021]9、脱氧核酶的筛选:利用体外切割实验，以动力学分析方法，筛选出特异性强、切割效率高的脱氧核酶。
[0022]通过大规模的筛选，本发明优选出4条脱氧核酶，用于CND的信号放大和报告系统，它们是脱氧核酶的活性正义序列:
[0023]Dz 1:5，-CACAGCCAAGGCTAGCTACAACGAGTGCCATGT-3 ’ (SEQ ID No:1)
[0024]Dz2:5，-TTCTCCCAAGGCTAGCTACAACGAGTGCGCCAT-3’ (SEQ ID No:2)
[0025]Dz3:5，-CCACAAAGAGGCTAGCTACAACGAATCCCAGCC-3，(SEQ ID No:3)
[0026]DZ4:5，-GCCCAGGGAGGCTAGCTACAACGAGGTTGTGCT-3> (SEQ ID No:4)
[0027]上述脱氧核酶序列具有如下特征:
[0028]a.通用脱氧核酶根据特异标记底物序列设计；
[0029]b.脱氧核酶的序列由33个核苷酸组成，自5'到3'的方向由磷酸二酯键连接；
[0030] c.脱氧核酶的序列由与底物配对的结合序列和催化功能序列(下划线部分)连接组成；
[0031]d.5’和3’的结合序列分别为9个核苷酸(无下划线部分)；
[0032]( 二)本发明所提供的特异标记底物的设计原则如下:[0033]1、底物通过人工设计，不与任何天然核酸序列相匹配的一段寡核苷酸；
[0034]2、底物由19~21核苷酸残基组成，自5'到3'的方向，由磷酸二酯键连接；
[0035]3、底物中间含AU或⑶序列；
[0036]4、底物AU或⑶序列上下游分别标记上荧光发射基团和荧光淬灭基团。
[0037]其中，本发明所述的荧光发射基团包括FAM、HEX、TET、ROX、Cy3、Cy5等，淬灭报告基团包括TAMRA、Eclipse及BHQ系列荧光染料。
[0038]由于常见的荧光定量PCR仪最多为5色荧光，根据不同荧光基团的波长和性质，本发明中优先选择如下组合:单一检测时，6-FAM/TET为荧光发射基团即报告基团，TAMRA/BHQ为淬灭报告基团，ROX为参比荧光；二重检测时，6-FAM/TET/HEX为报告基团，Eclipse/BHQ为淬灭报告基团，ROX为参比荧光；三、四重检测时，6-FAM/TET/HEX/Cy5为报告基团，Eclipse/BHQ为淬灭报告基团，ROX为参比荧光。
[0039]通过大规模的筛选，本发明优选出4条与脱氧核酶对应的特异标记底物，用于CND的信号放大和报告系统。它们的序 列是:
[0040]Sub 1:5，-ACATGGCACguTGGCTGTG-3 ’ (SEQ ID No:5)
[0041]Sub2:5，-ATGGCGCACguTGGGAGAA-3J (SEQ ID No:6)
[0042]Sub3:5，-GGCTGGGATguCTTTGTGG-3 ’ (SEQ ID No: 7)
[0043]Sub4:5，-CAGCACAACCguCCCTGGGCA-3J (SEQ ID No:8)
[0044]上述特异标记底物序列具有如下特征:
[0045]a.底物通过人工设计，不与任何天然核酸序列相匹配；
[0046]b.底物由19~21核苷酸组成，自5'到3'的方向，由磷酸二酯键连接；
[0047]c.底物中间含AU或⑶序列；
[0048]d.底物上下游分别标记上荧光发射基团和荧光淬灭基团；
[0049]e.中间小写的核苷酸gu为RNA，其他为DNA;
[0050]f.寡核苷酸上游带下划线的核苷酸进行6-FAM标记；下游带下划线的核苷酸进行TAMRA标记。
[0051](三)本发明的分子检测技术具有如下特征:
[0052]①本发明是在PCR技术的基础上，使用通用脱氧核酶及其特异标记底物为信号放大和信号报告，从而进行靶分子定量分析；
[0053]②在PCR引物的5’端加上脱氧核酶的反义序列，PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列；
[0054]③标记底物上下游分别标记上荧光发射基团和荧光淬灭基团，由于距离相近，两基团相互作用不产生荧光，PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列，并切断标记底物，使淬灭作用消失产生突光信号；
[0055]④由于荧光信号与PCR产物成对应关系，因此可以对核酸模板进行准确定量；
[0056]⑤本发明所述的荧光定量PCR仪可以是目前常用的各种定量PCR仪，包括AB1、Roche、Bio-Rad、Eppendorf和QIAGEN等系列仪器都可以用于CND分子检测技术。
[0057]本发明的第二方面，提供了一种采用前述的通用脱氧核酶及其底物结合PCR方法建立的分子检测技术对EGFR分子进行定量或突变检测的新方法。
[0058]定量检测:根据EGFR的mRNA序列，设计PCR引物，在下游PCR引物的5’端加上通用脱氧核酶的反义序列，并在反应体系中加入脱氧核酶的特异标记底物。PCR扩增将产生脱氧核酶的正义序列，切断标记底物，使淬灭作用消失产生突光信号。由于突光信号与PCR产物成对应关系，因此可以利用仪器的分析软件对靶分子核酸进行准确定量。
[0059]突变检测:利用错配PCR原理，CND技术可有效地检测靶基因的突变。CND在进行突变检测时，只需根据靶基因检测位点改变PCR引物的特异序列部分即可实现。
[0060]其中所涉及的PCR引物，其设计的原则是:
[0061]1、引物应最好在靶分子的保守区内设计；
[0062]2、引物与模板配对区域的长度一般在15-25碱基之间；
[0063]3、引物GC含量在40 % -60 %之间；
[0064]4、引物3’端不能选择A,最好选择T ；
[0065]5、碱基要随机分布；
[0066]6、引物自身及引物之间不应存在互补序列；
[0067]7、引物5'端和中间AG值应该相对较高，而3'端AG值较低。可以利用各种引物设计软件如PRMER5或01igo6.0等，进行PCR引物的设计。 [0068]在本发明中，除另外特别说明外，下列词语/术语具有下列含义:
[0069]“核酸”:主要指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，也可以是经过修饰的DNA或RNA类似物和嵌合DNA或RNA分子。
[0070]“寡核苷酸”:小分子核酸，由核苷酸残基(片段)通过磷酸二酯键连接(聚合)而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。
[0071]“脱氧核酶”:是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。
[0072]“10-23型脱氧核酶”:从I个含IO14个嵌合分子的随机DNA序列库中，通过体外筛选获得的第10轮循环的第23个克隆。10-23型脱氧核酶具有高稳定性，能催化RNA特定部位的切割反应。10-23脱氧核酶的活性中心由15个脱氧核糖核苷酸组成(TCGTTGTAGCTAGCC)，活性中心两侧各有约7-9个脱氧核糖核苷酸，构成酶分子的底物识别部位，底物结合臂通过Waston Crick配对与底物结合后，进行底物的定点切割。
[0073]“靶分子”:能通过本发明所述以脱氧核酶为基础的新型分子诊断技术进行检测的待检测物质，主要包括核酸分子。
[0074]“聚合酶链式反应(PCR) ”:聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点。
[0075]“定量检测”:直接或间接检测靶分子的浓度或量。
[0076]本发明与现有的核酸检测方法相比，主要有以下优点:
[0077]①CND分子检测技术利用了 PCR方法的检测原理，具有其特异性强、灵敏度高及自动化程度高的特点；
[0078]②同时由于CND技术使用了通用脱氧核酶及底物这一发光检测系统，CND分子检测技术还具有设计简单的优点，其在建立不同靶分子检测系统时，只需要相应改变特异的PCR扩增引物，而Taqman荧光PCR定量技术则还需要筛选相应的荧光探针。
[0079]③灵敏度高:PCR的放大效应和底物被切割后荧光的释放双重效应的叠加；[0080]④稳定性好:CND不同检测靶分子仅引物部分序列不同，实验条件较为均一；
[0081]⑤能实现多基因/多位点同时检测:CND设计相对简单、反应共性强，利用多个通用脱氧核酶及其底物系统，不同的靶分子或多个位点的检测可以在同一次热循环中完成，使高通量检测成为可能。
[0082]⑥简便快速:检测在荧光PCR仪中自动完成。
【专利附图】
【附图说明】
[0083]图1是CND技术原理图。
[0084]图2显示了用于CND的信号放大和报告系统的脱氧核酶对其特异标记底物的切割效应。
[0085]图3是实施例3确定实验体系中最佳限制性引物/底物搭配的实验结果。
[0086]图4a和图4b是实施例4中CND实验体系的建立以及使用EGFR mRNA阳性质控标准品进行检测绘制的标准曲线，其中图4a:梯度阳性质控标准品的扩增曲线；图4b =EGFRmRNA的阳性质控标准品的检测曲线，其相关系数为99.5%。
【具体实施方式】
[0087]以下通过实施例进一步详细描述本发明，旨在通过举例说明更好地理解本发明的本质，而不是限制本发明。 [0088]实施例1:通用脱氧核酶对其底物的切割活性
[0089]通用脱氧核酶对其底物的切割活性的鉴定:以对应的脱氧核酶在Mg2+的存在下切割特异性标记的底物。取InM通用底物加入到100 μ L水中，加IOmM Mg2+缓冲液和1、2、5、IOnM脱氧核酶(Dzl)，37°C分别处理0、5、10、30、60min，微量荧光检测仪读荧光数，分析底物的荧光性能。
[0090]结果如图2所示，显示本发明所设计脱氧核酶Dzl对其特异性标记底物subl (6-FAM/TAMRA标记)有很好的切割活性，随着活性酶的量的增加，切割效应也逐渐增加；同时发现，脱氧核酶对其特异性标记底物有很好的切割活性在作用5分钟开始逐步增加，并在30-60分钟后加入平台期。
[0091]实施例2:最佳限制性引物/底物搭配的确定。
[0092]利用已筛选出的4对有良好切割效应的配对脱氧核酶/特异标记底物，利用实施例3中的CND检测方法，进一步筛选出应用于EGFR mRNA定量检测的最佳限制性引物(含脱氧核酶反义序列)/底物。其中，脱氧核酶的序列如SEQ IDNo:1~4所示，它们分别配对的特异标记底物序列如SEQ ID No:5~8所示(6-FAM/TAMRA标记)。含脱氧核酶反义序列的EGFRmRNA定量检测引物序列如下:
[0093]EGFR-Dz-1:ACATGGCACTCGTTGTAGCTAGCCTTGGCTGTGGTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC(SEQ ID No:9)
[0094]EGFR-Dz-2:ATGGCGCTGTCGTTGTAGCTAGCCTTGGGAGAAGTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC(SEQ ID No:10)
[0095]EGFR-Dz-3:5，-GGCTGGGATTCGTTGTAGCTAGCCTCTTTGTGGGTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC-3’ (SEQ ID No:11)；[0096]EGFR-Dz-4:AGCACAACCTCGTTGTAGCTAGCCTCCCTGGGCGTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC(SEQ ID No:12)
[0097]结果见图3。结果显示，本发明所选出的4对脱氧核酶/特异标记底物中，在进行EGFRmRNA的定量检测时，EGFR-Dz-3/sub3组合能够获得最好的扩增效果。
[0098]实施例3:利用实施例2所描述的EGFR-Dz-3/sub3脱氧核酶/特异性标记底物组合结合PCR方法定量检测肿瘤细胞中靶分子EGFR mRNA的含量。
[0099]1.PCR引物的设计:首先，从GenBank数据库获取人EGFR的cDNA全长序列，通过BLAST分析获得其保守性序列，用生物学软件01 igo6.0分别对BLAST检索所得的EGFR的保守序列逐一进行分析，依据PCR引物的设计原则设计出长度为15-25mer的PCR引物，其核苷酸序列为:
[0100]EGFR-F: 5，-TCCCTCAGCCACCCATATGTAC-3 ’ (SEQ ID No: 13)
[0101]EGFR-R:5’ -GTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC-3’ (SEQ ID No:14)
[0102]EGFR-Dz-3:5，-GGCTGGGATTCGTTGTAGCTAGCCTCTTTGTGGGTCTCGGGCCATTTTGGAGAATTC-3’ (SEQ ID No:11) [0103]引物说明:
[0104]①常规引物EGFR-F和EGFR-R用于阳性模板的制备；
[0105]②EGFR-F和EGFR-Dz-3弓丨物用于CND检测；
[0106]③EGFR-Dz-3引物是由3号脱氧核酶(Dz3)反义序列(下划线部分)和EGFR下游引物构成。
[0107]2.阳性模板的制备:
[0108]阳性模板的标定:从MCF-7细胞中提取总RNA，进行逆转录反应后，利用常规引物EGFR-F 和 EGFR-R 进行 PCR 扩增，PCR 产物采用 T-克隆方法(pGEM-T-easy Vector, Promega)构建含EGFR基因的质粒，测定浓度，根据质粒分子量，定值模板标准品(IO11c0Py/^ I)。
[0109]阳性标准品的制备:定值模板(10nCOpy/yI)用阴性模板作连续的10倍梯度稀释成 IO10Copy/ μ 1、IO9Copy/μ 1、IO8Copy/ μ 1、IO7Copy/ μ 1、IO6Copy/ μ 1、IO5Copy/ μ 1、IO4Copy/ μ IlO3Copy/ μ 1、IO2Copy/ μ IUO1Copy/ μ I,分别作为阳性定量标准品。
[0110]3.本发明中CND实验体系的建立:
[0111]标准的反应体系:
[0112]
【权利要求】
1.一种特异性检测EGFR的方法，根据EGFR的mRNA序列，设计PCR引物，在下游PCR引物的5’端加上脱氧核酶的反义序列，并在反应体系中加入该脱氧核酶的特异标记底物，该特异标记底物的上下游分别标记了荧光发射基团和荧光淬灭基团；PCR扩增产生脱氧核酶的正义序列，产生具有切割活性的脱氧核酶并切断特异标记底物，使淬灭作用消失，产生荧光信号；根据荧光信号与PCR产物之间的对应关系，对EGFR进行定量或突变检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异标记底物由19~21核苷酸残基组成；特异标记底物中间含AU或⑶序列，其上下游分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱氧核酶的正义序列由与特异标记底物配对的结合序列和GGCTAGCTACAACGA催化功能序列连接组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脱氧核酶的正义序列由29~33个核苷酸残基组成，其中所述与特异标记底物配对的结合序列包括分别位于所述催化功能序列5’端和3’端的两段序列，各具有7~9个核苷酸残基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脱氧核酶的正义序列选自序列表中的SEQ ID No:1~4中的任意一个。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特异标记底物序列选自序列表中的SEQ ID No:5~8中的任意一个，它们依次分别对应SEQ ID No:1~4所示的脱氧核酶的正义序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物与EGFRmRNA序列配对区域的长度为15~25核苷酸残基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，5’端加上脱氧核酶的反义序列的PCR引物序列选自序列表中的SEQ IDNo:9~12中的一个。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、ROX、Cy3和Cy5中的一种；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse和BHQ系列荧光染料中的一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以6-FAM为荧光发射基团，TAMRA为荧光淬灭基团，ROX为参比荧光。
【文档编号】C12Q1/68GK104017900SQ201410298015
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】孙仑泉, 杨力芳, 林奕婷 申请人:中南大学湘雅医院