专利名称：一种节瓜雌性基因的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种节瓜雌性基因的分子标记方法。
背景技术：
节瓜(Benincasa hispida Cogn.var.chieh-qua How.)，冬瓜属的一个变种，是华南地区有优势的特色蔬菜，国外仅见少数华人地区零星种植，在我国广东省栽培已逾300余年。节瓜在蔬菜生产和供应上起着重要作用，除供应本地市场外，还是出口创汇的主要蔬菜之一，在东南亚、香港及澳门享有盛誉。近年来，华南地区节瓜生产发展很快，年种植面积超过50万亩，倍受市场欢迎。节瓜生产以采收嫩瓜供食为主，其肉质柔滑，味微甜清香、甘爽，富含蛋白质、维生素等营养成分，是华南地区出口的主要蔬菜品种之一。国内、外节瓜育种研究起步较晚，广东省农业科学院从20世纪80年代中期开始开展节瓜雌性系相关研究，并成功运用于育种实践，达到了提高雌性系选育效率和杂交种纯度的目的。目前，筛选雌性系主要方法是田间自然筛选鉴定，一方面由于自然环境条件不稳定对花性分离有影响；另一方面，所花费的时间长。
发明内容本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种节瓜雌性基因的分子标记方法，该方法在筛选节瓜种质资源的性型方面是一种全新、快捷、高效的鉴定、鉴别方法，也为常规育种与分子标记辅助选择的有机结合奠定基础。
本发明所述一种节瓜雌性基因的分子标记方法，其特征是，它包括如下步骤第一步 全雌株系的获得和保持从节瓜强雌株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雌株，全雌株在3～5片真叶期喷施AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续；
第二步 全雄株系的获得和保持从节瓜强雄株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雄株，全雄株上的雄花与其同亲缘的强雄株上的雌花进行杂交，从而获得节瓜杂交种子，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续；第三步 全雌株、全雄株的获得利用纯合的节瓜全雌株系与全雄株系进行杂交，获得F1种子，种植F1种子，可获得分离世代的F2植株，从中可筛选出全雌株、全雄株；第四步 全雌株DNA、全雄株DNA的获得分别取7～10株全雌株、全雄株，混合取样，按CTAB法提取全雌株、全雄株DNA(要求在提取过程中动作要快，加样、加液准确，样品褐化程度减小到最小)；第五步 分子标记反应体系RAPD反应总体积25μl，含2.5mmol/L的MgCl2，模板DNA20～30ng，扩增反应的热循环条件94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min；取8～10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析。
为了更好地实现本发明，所述节瓜全雌株、全雄株DNA的纯度必须满足RAPD反应的要求；所述缓冲液含25mmol/L的MgCl2。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1.目前，国内、外尚无节瓜全雄株系、全雌株系的获得和保持方法的报道，本发明在这一方面属于开创性成果。
2.国内、外至今尚无成熟的标记节瓜性型基因的RAPD技术，本发明提出标记节瓜性型基因的RAPD扩增反应的热循环条件，成熟可靠。
3.通过本发明方法可获得节瓜雌性基因特异性分子标记性状OPQ-451150。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
第一步 从江竹节瓜选用强雌株经多代自交，定向选择，选育出全雌株A36，全雌株在3～5片真叶期喷施2％的AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续。
第二步 从广东省农家种黑毛节选取强雄株，经多代自交，定向选择，选育出全雄株H，全雄株H与黑毛节中的强雄株进行杂交，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续。
第三步 纯雌材料A36与全雄株系黑毛节H进行杂交，经自交，从分离世代中挑选出全雄株、全雌株，分别取7～10株，混合取样，按CTAB法提取DNA。采用改良的CTAB法可以保证每离心管中的样品比较均匀，且减少了鲜样褐变时间，还可节省时间，提高工作效率，从而建立了雌性株DNA基因池和雄性株DNA基因池。经紫外分光光度计检测雌性DNA的A260/230＝2.130，A260/280＝1.8235；雄性DNA的A260/230＝2.015，A260/280＝1.7455。
第四步 琼脂糖凝胶电泳检测全雌株DNA的浓度为100ng/μl，全雄株DNA的浓度约为80ng/μl。带条清晰，达到RAPD实验所需要求。
第五步 RAPD反应总体积25μl，含2.5μl缓冲液(含25mmol/L，MgCl2)，10mmol/L的dNTP0.25μl，Taq DNA聚合酶0.5U，10碱基随机引物1μl，模板DNA20～30ng，加ddH2O至25μl。覆盖20～30μl石蜡油。扩增反应的热循环条件94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min。PCR仪为美国PE公司生产的PE-480扩增仪。取10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析。
以雌性DNA池和雄性DNA池为模板，平行地进行RAPD反应，结果每反应均可产生0～3条扩增带。从198个随机引物中筛选出1个引物OPQ-45(TGAGCGGACA)能在全雌基因池中扩增出一条特异带，重复多次，结果一致。此扩增条带的大小为1150bp，命名为OPQ-451150。
权利要求
1.一种节瓜雌性基因的分子标记方法，其特征是，它包括如下步骤第一步 全雌株系的获得和保持从节瓜强雌株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雌株，全雌株在3～5片真叶期喷施AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续；第二步 全雄株系的获得和保持从节瓜强雄株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雄株，全雄株上的雄花与其同亲缘的强雄株上的雌花进行杂交，从而获得节瓜杂交种子，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续；第三步 全雌株、全雄株的获得利用纯合的节瓜全雌株系与全雄株系进行杂交，获得F1种子，种植F1种子，可获得分离世代的F2植株，从中可筛选出全雌株、全雄株；第四步 全雌株DNA、全雄株DNA的获得分别取7～10株全雌株、全雄株，混合取样，按CTAB法提取全雌株、全雄株DNA；第五步 分子标记反应体系RAPD反应总体积25μl，含2.5mmol/L的MgCl2，模板DNA20～30ng，扩增反应的热循环条件94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min；取8～10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种节瓜雌性基因的分子标记方法，其特征是，所述节瓜全雌株、全雄株DNA的纯度必须满足RAPD反应的要求。
全文摘要
本发明是一种节瓜雌性基因的分子标记方法，它涉及节瓜全雄株系、全雌株系的选育与保持方法，以及利用节瓜全雄株系、全雌株系进行雌性基因分子标记的方法。该方法利用改良CTAB法从节瓜全雌株系与全雄株系杂交分离后代中快速提取全雌DNA和全雄DNA，采用BSA法对节瓜性型基因进行标记，扩增反应的热循环条件94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min。
文档编号C12Q1/68GK1452857SQ0312658
公开日2003年11月5日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者谢大森, 陈清华, 何晓明, 彭庆务, 赫新洲 申请人:广东省农业科学院蔬菜研究所