专利名称：一种食品防腐用菌株及其抗菌产物的制作方法
技术领域：
本发明为一种食品防腐用菌株及其抗菌产物，属于食品生物技术领域，适用于食品加工和农产品贮藏保鲜，专用于控制食品中的致病菌和腐败菌，对食品营养和质量没有任何影响。
二、技术背景在食品工业中，为了增加食品的安全性和延长食品的保质期，可以采取不同处理手段控制食品中的微生物，但是有些杀菌方法会对食品的质地、风味和营养产生不良影响。食品防腐剂因其使用方便有效，同时能很好地保存食品的商品价值，目前仍然是食品防腐的重要措施之一。
目前我国食品添加剂标准(GB2760)允许使用的32种防腐剂中以化学防腐剂为主，天然防腐剂仅乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种，所占比例很少。这是因为化学防腐剂通常成本较低，化学性能稳定以及抑菌谱较广、防腐效果好，但是经过长期研究发现，化学防腐剂对人体不同程度存在一定毒性，其中一些具有诱癌性和致畸性，在超标使用的情况下甚至会引起食物中毒。
随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强，人们对食品的安全卫生和自身健康状况日益关注，不含化学防腐剂的天然食品和绿色食品更容易被消费者认可和接受。因此研究开发高效安全无毒的天然食品防腐剂(Natural Antiseptics)已成为当今国际食品添加剂发展的主要方向。
Nisin是乳酸链球菌分泌合成的短肽分子。1983年被FDA批准使用，1990年被列入我国食品添加剂标准(GB2760)。Nisin是目前公认安全和应用范围最广的天然食品防腐剂，但也存在某些局限性，例如抑菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性，在中性和碱性条件下对热不稳定，从而使其在食品中的应用受到一定限制。
Natamycin源于放线菌纳塔尔霉菌(Streptomyces natalensis)，为多烯烃大环内酯化合物，是一种高效真菌抑制剂。1997年经我国卫生部批准使用。能有效杀死霉菌、酵母菌和丝状真菌，但对细菌和病毒无效。
虽然国内外对不同来源的天然防腐剂的开发和研究很多，主要有乳酸菌细菌素，有源于酵母的嗜杀霉素，从米曲霉中分离的曲酸，但在实际应用中还很少。这主要是因为天然防腐剂抑菌谱窄，抑菌效果不够理想，有些抗菌性能不很稳定，尤其是价格偏高，所以很难取代化学防腐剂的作用和地位。葡萄球菌属和芽孢杆菌属等也能产生细菌素，但是有关它们在食品防腐中的应用还未见研究报道。因此目前食品工业急需广谱高效，性能稳定的天然食品防腐剂。
发明内容
技术问题发明目的是针对食品工业中化学防腐剂存在的问题以及对广谱高效天然防腐剂的需求增加状况，提供一种食品防腐用菌株及其抗菌产物，可用于食品防腐和农产品保鲜，能够有效延长食品的保质期。
技术方案一种食品防腐用菌株，其特征在于一种食品防腐剂菌株fmbJ，经鉴定属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2003年6月6日，保藏号CGMCC No.0943，主要生物学特性为革兰氏阳性菌，普通营养琼脂培养菌落为白色或微黄色，圆形，不透明，表面粗糙，有皱褶，无光泽，边缘不光滑呈裂叶状，中央颜色深于边缘部分，菌落直径为2-5mm；为芽孢短杆菌，芽孢呈椭圆或柱状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色；过氧化氢酶阳性，厌氧条件不能生长，可利用葡萄糖，能还原硝酸盐，7％(质量比，下文同)NaCl可生长，pH5.7培养基可生长，可水解淀粉和酪蛋白，VP试验和甲基红试验阳性，石蕊牛奶凝固不变色。
上述食品防腐用菌株fmbJ产生的抗菌产物，是通过以下方法获得的1)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株摇瓶种子液制备取试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，37℃、130rpm/min下培养24h，至对数生长期，制成浓度为107-108个/L的摇瓶种子液；种子培养基为去琼脂的营养琼脂培养基。2)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株种子罐种子液制备取摇瓶种子液以10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养；3)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株抗菌代谢产物发酵将上述种子罐培养的种子液以5％浓度接种于发酵培养基中，在30-35℃、150rpm/min下培养35-38小时，发酵培养基配方玉米粉4％、麦麸2％、豆粕粉2％，CaCO30.1％、MgSO40.05％、KCl 0.03％、CuSO40.0005％、NaCl 0.3％，用蒸馏水定容到100ml，pH值7.2-7.4，获得发酵液；4)抗菌代谢产物的获得将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，用Millipore超滤膜截留分子量10000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即获得抗菌代谢产物。
有益效果本发明的主要优点和积极效果如下1、本发明首次提供了一株食品防腐用菌株枯草芽孢杆菌fmbJ。
2、本发明首次提供了一种对食品中主要致病菌和腐败菌具有广谱高效抑菌作用的抗菌产物。
3.本发明提供的枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物抑菌谱广。对食品中主要致病菌和腐败菌，包括3种革兰氏阳性菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌)，7种革兰氏阴性菌(大肠埃希氏杆菌、荧光假单胞菌、大肠埃希氏杆菌0157H7、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺菌和福氏志贺氏菌)，以及4种霉菌(黑曲霉、黑根霉、点青霉和总状毛霉)均具有显著的抑菌效果，而目前国内外广泛应用的天然食品防腐剂Nisin抑菌谱相对较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性；另一种主要的天然食品防腐剂Natamycin仅能控制霉菌、酵母菌和丝状真菌，但对细菌和病毒无效。
由于本发明提供的抗菌产物对食品中多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的天然食品防腐剂，广泛用于鱼、肉、禽、蛋、乳、水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，有效控制食品中微生物生长，对于减少食品腐烂损失和延长食品保质期具有重要应用价值。
4.本发明提供的枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物用于食品防腐保鲜，效果显著。牛奶防腐试验结果表明在室温贮藏下添加1％，与对照相比，保质期可以延长1天，在4℃贮藏下添加1％，保质期可以延长7天；室温添加4％以上，4℃添加3％以上，保质期均可延长35天以上。
西瓜汁防腐试验也具有类似结果，在室温贮藏下添加1％，与对照相比，保质期可以延长1天，在4℃贮藏下添加1％，保质期可以延长2天；若添加4％以上，无论室温和4℃贮藏，保质期可延长36天以上。
此外，本发明提供的抗菌产物对新鲜草莓具有明显的防腐保鲜作用，新鲜草莓室温贮藏3天，果实色泽暗淡，80％果实腐烂，单个果实腐烂面积较大；而经过抗菌产物浸泡的果实色泽较暗淡，60％果实腐烂，单个果实腐烂不很严重；在4℃贮藏3天，对照果实色泽较鲜艳，50％果实局部腐烂，而经过抗菌产物浸泡的果实色泽依然鲜艳，仅有20％果实局部腐烂。
5.本发明使用安全，方法简便，成本低。本发明枯草芽孢杆菌fmbJ菌株属于国际上公认的食品安全菌种，为1989年美国FDA发布的42种安全有效的有益菌种之一，同时为我国农业部1996年公布的允许使用的12种益生菌之一。枯草芽孢杆菌fmbJ产生的抗菌产物属于微生物天然食品防腐剂，对食品和人类健康安全性高，无毒副作用，不会导致对环境的污染，可用于绿色食品和天然食品的生产与出口，该抗菌产物替代化学防腐剂广泛用于食品工业，将提高食品的安全性和商品价值。
四
图1枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对10种细菌抑菌效果照片其中照片5-10由江苏省卫生防疫站提供。
图2枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对4种真菌抑菌效果照片图3枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对新鲜牛奶的防腐效果(室温)图4枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对新鲜牛奶的防腐效果(4℃)图5枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对西瓜汁的防腐效果(室温)图6枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对西瓜汁的防腐效果(4℃)五具体实施方式
本发明的食品防腐用菌株fmbJ从土壤中筛选获得，经鉴定属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2003年6月6日，保藏号CGMCC No.0943，主要生物学特性为革兰氏阳性菌，普通营养琼脂培养菌落为白色或微黄色，圆形，不透明，表面粗糙，有皱褶，无光泽，边缘不光滑呈裂叶状，中央颜色深于边缘部分，菌落直径为2-5mm；为芽孢短杆菌，芽孢呈椭圆或柱状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色；过氧化氢酶阳性，厌氧条件不能生长，可利用葡萄糖，能还原硝酸盐，7％(质量比，下文同)NaCl可生长，pH5.7培养基可生长，可水解淀粉和酪蛋白，VP试验和甲基红试验阳性，石蕊牛奶凝固不变色。
本发明的食品防腐用菌株fmbJ产生的抗菌产物通过以下方法获得的。抗菌产物生产过程为1)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株摇瓶种子液制备取试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，37℃、130rpn/min下培养24h，至对数生长期，制成浓度为107-108cfu/L的摇瓶种子液；种子培养基为肉汤培养基。2)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株种子罐种子液制备取摇瓶种子液以10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养；3)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株抗菌产物发酵将上述种子罐培养的种子液以5％浓度接种于发酵培养基中，在30-35℃、150rpm/min下培养35-38小时，发酵培养基配方玉米粉4％、麦麸2％、豆粕粉2％，CaCO30.1％、MgSO40.05％、KCl 0.03％、CuSO40.0005％、NaCl 0.3％，用蒸馏水定容到100ml，pH值7.2--7.4，获得发酵液；4)抗菌产物的获得将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，用Millipore超滤膜截留分子量10000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即获得抗菌代谢产物。
(一)枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物的抑菌试验1.抑菌实验所采用的指示菌为食品中重要的致病菌和腐败菌，包括11种细菌大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(AS1.487)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)(AS1.1846)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(AS1.1802)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(AS1.2465)、大肠埃希氏杆菌0157H7、(Escherichia coli)(CMCC(B)882364)鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(CMCC(B)50013)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(CMCC(B)50071)、副溶血性弧菌(Vibrio parachaemolyticus)(CMCC(B)89001)、宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)(CMCC(B)51334)和福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)(Serotype 2a，CMCC(B)51302)以上菌种均来自中科院微生物研究所菌种保藏中心。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(54004)源于卫生部食品监督所。
另外还有4种霉菌黑根霉(Rhizopus nigricans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、点青霉(Penicillium meleagrinum)和总状毛霉(Mucor racemosus)，为本实验室保藏。
2.指示菌的培养基，细菌培养基采用营养琼脂培养基(MH)，其中单核细胞增生李斯特菌采用血平板培养基培养(营养琼脂培养基加入羊血)；真菌培养基培养采用马铃薯PDA培养基。
3.抑菌试验实验方法参考CHAE GUN PHAE(Research Laboratory of ResourcesUtilization，Tokyo Institute of Technology.)发表的文献JOURAL ofFERMENTATION AND BIOENGINEERING Vol.69，No.11-7，1990。
3.1细菌各指示菌活化(营养琼脂培养基培养基)→制备种子液(肉膏蛋白胨培养基去琼脂)→用0.85％NaCI溶液稀释成不同梯度→涂平板并测定OD600.确定不同细菌最适涂布浓度(OD600为0.02-0.03左右适宜)→将不同指示菌0.1ml均匀涂于直径为9cm平板表面→晾干后，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯或滤纸片，再将抗菌产物加于牛津杯200μl(牛津杯直径5mm)或滤纸片100μl(滤纸片直径12mm)→37℃下培养16-24小时，记录抑菌圈直径大小。
3.2真菌指示菌活化(PDA培养基)→用无菌0.85％NaCl溶液将孢子洗下，制成孢子悬液→稀释至最适涂布浓度(以指示菌生长布满平皿为宜)→吸取0.1ml涂平板→晾干后，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯或滤纸片，再将抗菌产物加于牛津杯(200μl)或滤纸片(100μl)→30℃下培养48-72小时，记录抑菌圈直径大小。
抑菌效果见表1和表2以及图1和图2。抑菌试验结果证明枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对3种革兰氏阳性菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌)，和7种革兰氏阴性菌(大肠埃希氏杆菌、荧光假单胞菌、大肠埃希氏杆菌0157H7、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺菌和福氏志贺氏菌)，以及4种霉菌(黑曲霉、黑根霉、点青霉和总状毛霉)均具有显著的的抑菌效果，但是对副溶血性弧菌没有作用。
表1枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对11种细菌的抑菌效果
注抑菌圈直径(mm)为3次重复平均值±标准差.
表2枯草芽孢杆菌fmbJ提取物对4种真菌的抑菌效果
注抑菌圈直径(mm)为3次重复平均值±标准差.
表1和表2以及图1和图2充分说明枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对3种革兰氏阳性菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌)，7种革兰氏阴性菌(大肠埃希氏杆菌、荧光假单胞菌、大肠埃希氏杆菌0157Hz、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺菌和福氏志贺氏菌)，以及4种霉菌(黑曲霉、黑根霉、点青霉和总状毛霉)均具有显著的的抑菌效果，而目前国内外广泛应用的天然食品防腐剂Nisin抑菌谱相对较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性；另一种主要的天然食品防腐剂Natamycin仅能有效杀死霉菌、酵母菌和丝状真菌，但对细菌和病毒无效。
由于枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对食品中多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的天然食品防腐剂，广泛用于鱼、肉、禽、蛋、乳、水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，有效控制食品中微生物生长，对于减少食品腐烂损失和延长食品保质期具有重要应用价值。
枯草芽孢杆菌fmbJ菌株属于国际上公认的食品安全菌种，为1989年美国FDA发布的42种安全有效的有益菌种之一，同时为我国农业部1996年公布的允许使用的12种益生菌之一。枯草芽孢杆菌fmbJ产生的抗菌产物属微生物天然食品防腐剂，对食品和人类健康安全性高，无毒副作用，不会导致对环境的污染，可用于绿色食品和天然食品的生产与出口，该抗菌产物替代化学防腐剂广泛用于食品工业，将提高食品的安全性和商品价值。
(二)枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对食品的防腐效果试验1.牛奶防腐试验将枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物按0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％浓度添加于等量新鲜牛奶(经过高温短时灭菌)中，以未添加抗菌产物的为对照，将牛奶密封，分别于室温和4℃下保藏，观察感官、保质期、微生物的变化。
1)新鲜牛奶贮藏过程中感官的变化不同处理新鲜牛奶在室温和4℃贮藏条件下的感官变化见表3-4。新鲜牛奶中添加抗菌产物能够有效延长牛奶的感官质量，随添加量增加，牛奶感官品质延长，出现凝絮和腐败现象减慢。在室温贮藏条件下，添加4％以上外观总体可接受性可保持40天以上。在4℃贮藏条件下，添加3％以上外观总体可接受性可保持40天以上。防腐剂结合冷藏使用效果更好。
表3新鲜牛奶室温贮藏过程中感官的变化贮藏时间(d)处理 369 12 20 2840表面呈 凝絮达 凝絮达 整管呈现 整管呈现整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，水0 现凝絮状 到1/2管 到3/4管 凝絮状凝絮状，水 状，水乳分层乳分层，色泽变黄乳分层表面呈 凝絮达 凝絮达 整管呈现 整管呈现整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，水1 现凝絮状 到1/2管 到3/4管 凝絮状凝絮状，水 状，水乳分层乳分层，色泽变黄乳分层凝絮达 整管呈现凝 整管呈现 整管呈现整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，水2 正常到1/2管 絮状， 水乳凝絮状， 凝絮状，水 状，水乳分层乳分层，色泽变黄分层水乳分层 乳分层表面呈现 凝絮达 整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，水3 正常 正常 正常凝絮状 到1/2管 状 乳分层，色泽变黄表面呈现整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，水4 正常 正常 正常 正常凝絮状 状 乳分层，色泽变黄5 正常 正常 正常 正常 正常 正常 正常6 正常 正常 正常 正常 正常 正常 正常注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。
表4新鲜牛奶4℃贮藏过程中感官的变化贮藏时间(d)处理36 9 12 2028 40正常 表面呈凝絮达 凝絮达到 整管呈整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，0 现凝絮到1/2管3/4管现凝絮状，水乳分层水乳分层，色泽变状状黄正常 正常 表面呈 凝絮达到 凝絮达整管呈现凝絮整管呈现凝絮状，1现凝絮 1/4管到1/2管 状，水乳分层水乳分层，色泽变状黄正常 正常 正常 表面呈现 凝絮达凝絮达到3/4管 整管呈现凝絮状，2 凝絮状 到1/4管 水乳分层，色泽变黄表面呈现凝絮整管呈现凝絮状，3 正常 正常 正常 正常 正常状 水乳分层4 正常 正常 正常 正常 正常 正常 正常5 正常 正常 正常 正常 正常 正常 正常6 正常 正常 正常 正常 正常 正常 正常注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。
2)不同处理新鲜牛奶的保质期不同处理新鲜牛奶的保质期结果见图3-4。由图3-4可知，在室温贮藏下添加1％，与对照相比，保质期可以延长1天，在4℃贮藏下添加1％，保质期可以延长7天；室温添加4％以上，4℃添加3％以上，保质期均可延长35天以上。
3)新鲜牛奶汁贮藏过程中微生物的变化新鲜牛奶汁贮藏过程中微生物的变化见表5。表5表明新鲜牛奶中添加抗菌产物能够有效抑制微生物增长，随添加量增加微生物增长明显减慢。室温和4℃贮藏40天，添加1％的处理微生物比对照减少1个数量级，添加4％以上可完全控制微生物生长。其中4℃贮藏比室温贮藏微生物低近1个数量级表5牛奶室温和4℃贮藏40天细菌总数的变化室温 4℃处理 细菌总数 细菌总数(CFU/ml)Log CFU/ml(CFU/ml)Log CFU/ml06.7×1066.83 1.1×1066.0415.8×1066.76 5.9×1055.7727.6×1055.89 8.0×1044.9034.3×1033.63 2.8×1022.4545.1×1022.70 3.6×1011.565 00006 0000注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。
2.西瓜汁的防腐试验将枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物按0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％％浓度添加于等量新鲜西瓜汁中，以未加抗菌产物的为对照，将西瓜汁密封与室温和4℃下保藏，观察感官、保质期、微生物的变化。
1)新鲜西瓜汁贮藏过程中感官的变化不同处理西瓜汁在室温和4℃贮藏条件下的感官变化见表6-7。西瓜汁中添加抗菌产物能够有效延长西瓜汁的感官质量，随添加量增加西瓜汁感官品质保藏延长，出现混浊和腐败现象减慢。在室温贮藏条件下，添加3％以上外观总体可接受性可保持12天；在4℃贮藏条件下，添加3％以上外观总体可接受性可保持28天；添加4％以上室温和4℃贮藏外观总体可接受性均可保持40天以上。防腐剂结合冷藏使用效果更好。
表6鲜西瓜汁室温贮藏过程中感官的变化贮藏时间(d)处理 3 69 12 20 28 40汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊，0产气产气 产气产气 产气 产气产气汁液混浊汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊，1产气产气 产气产气 产气 产气汁液澄清， 汁液混浊 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊，2无变化 ·产气产气 产气 产气产气汁液澄清， 汁液混浊 汁液混浊汁液混浊 汁液混浊， 汁液混浊， 汁液混浊，3无变化产气 产气产气汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液混浊 汁液混浊汁液混浊4无变化 无变化 无变化 无变化汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清，5无变化 无变化 无变化 无变化 无变化 无变化 无变化汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清， 汁液澄清，6无变化 无变化 无变化 无变化 无变化 无变化 无变化注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。
表7西瓜汁4℃贮藏过程中感官的变化贮藏时间(d)处理 3 6 9 12 20 2840汁液澄清， 汁液混浊 汁液混浊， 汁液混浊，产气 汁液混浊，产 汁液混浊， 汁液混浊，0无变化 产气气 产气产气汁液澄清， 汁液混浊 汁液混浊， 汁液混浊，产气 汁液混浊，产 汁液混浊， 汁液混浊，1无变化 产气气 产气产气汁液澄清， 汁液澄清，无 汁液混浊汁液混浊，产气 汁液混浊，产 汁液混浊， 汁液混浊，2无变化 变化 气 产气产气汁液澄清， 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清，无变 汁液混浊 汁液混浊汁液混浊3无变化 变化 无变化 化汁液澄清， 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清 无变 汁液澄清无变 汁液轻微混 汁液轻微混4无变化 变化 无变化 化 化 浊 浊汁液澄清， 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清，无变 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清，5无变化 变化 无变化 化 变化 无变化 无变化汁液澄清， 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清，无变 汁液澄清，无 汁液澄清， 汁液澄清，6无变化 变化 无变化 化 变化 无变化 无变化注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。
2)不同处理新鲜西瓜汁的保质期不同处理新鲜西瓜汁的保质期见图5-6。由图5-6可知，在室温贮藏下添加1％，与对照相比，保质期可以延长1天，在4℃贮藏下添加1％，保质期可以延长2天；若添加4％以上，无论室温和4℃贮藏，保质期可延长36天以上。
3)新鲜西瓜汁贮藏过程中微生物的变化新鲜西瓜汁贮藏过程中微生物的变化见表8，表8说明新鲜西瓜汁中添加抗菌产物能够有效抑制微生物增长，随添加量增加微生物增长明显减慢。室温和4℃贮藏40天，添加1％的处理微生物比对照减少一个数量级，添加4％以上可完全控制微生物生长。其中4℃贮藏比室温贮藏微生物低1-2个数量级表8西瓜汁室温和4℃贮藏40天细菌总数的变化室温 4℃处理细菌总数 细菌总数CFU/ml Log CFU/ml CFU/ml Log CFU/ml0 8.3×1088.92 8.7×1077.931 6.4×1088.81 3.4×1077.532 7.9×1077.90 4.9×1055.693 2.3×1055.36 5.6×1033.754 2.1×1033.32 1.6×1011.205 0 0 0 06 0 0 0 0注处理0、处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6分别代表0％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％抗菌代谢产物添加量。3.草莓的防腐试验取两组相同数量的新鲜草莓，其中一组用枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物浸泡一下取出，另一组未用抗菌产物浸泡的草莓作为对照，再用塑料盒和薄膜包装好，分别于室温和4℃下贮藏3天，观察感官变化并计算腐烂率。室温和4℃各做3次重复取平均值。从表9可以看出枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌产物对新鲜草莓具有明显的防腐保鲜作用，新鲜草莓室温贮藏3天，果实色泽暗淡，80％果实腐烂，单个果实腐烂面积较大；而经过抗菌产物浸泡的果实色泽较暗淡，60％果实腐烂，单个果实腐烂不很严重；在4℃贮藏3天，对照果实色泽较鲜艳，50％果实局部腐烂，而经过抗菌产物浸泡的果实色泽依然鲜艳，仅有20％果实局部腐烂。
表9新鲜草莓室温及4℃贮藏3天感官变化和腐烂率室温贮藏 4℃贮藏色泽暗淡，80％果实腐烂，单个果实 色泽较鲜艳，50％果实局部腐烂。
对照腐烂面积较大。
色泽较暗淡，60％果实腐烂，单个果 色泽鲜艳，20％果实局部腐烂。
浸泡实腐烂不很严重。
权利要求
1.一种食品防腐用菌株，其特征在于一种食品防腐用菌株fmbJ，经鉴定属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2003年6月6日，保藏号CGMCC No.0943，主要生物学特性为革兰氏阳性菌，普通营养琼脂培养菌落为白色或微黄色，圆形，不透明，表面粗糙，有皱褶，无光泽，边缘不光滑呈裂叶状，中央颜色深于边缘部分，菌落直径为2-5mm；为芽孢短杆菌，芽孢呈椭圆或柱状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色；过氧化氢酶阳性，厌氧条件不能生长，可利用葡萄糖，能还原硝酸盐，7％(质量比，下文同)NaCl可生长，pH5.7培养基可生长，可水解淀粉和酪蛋白，VP试验和甲基红试验阳性，石蕊牛奶凝固不变色。
2.权利1要求的食品防腐用菌株fmbJ所生产的抗菌产物，是通过以下方法获得的1)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株摇瓶种子液制备取试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，37℃、130rpm/min下培养24h，至对数生长期，制成浓度为107-108个/L的摇瓶种子液；种子培养基为肉汤培养基。2)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株种子罐种子液制备取摇瓶种子液以10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养；3)枯草芽孢杆菌fmbJ菌株抗菌产物发酵将上述种子罐培养的种子液以5％浓度接种于发酵培养基中，在30-35℃、150rpm/min下培养35-38小时，发酵培养基配方玉米粉4％、麦麸2％、豆粕粉2％，CaCO30.1％、MgSO40.05％、KCl 0.03％、CuSO40.0005％、NaCl 0.3％，用蒸馏水定容到100ml，pH值7.2--7.4，获得发酵液；4)抗菌产物的获得将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，用Millipore超滤膜截留分子量10000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即获得抗菌代谢产物。
全文摘要
本发明为一种食品防腐用菌株及其抗菌产物，属于食品生物技术领域，枯草芽孢杆菌菌株fmbJ(保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2003年6月6日，保藏号CGMCC No.0943)产生的抗菌产物对食品中主要致病菌和腐败菌包括7种革兰氏阴性菌、3种革兰氏阳性菌以及4种霉菌具有显著的抑制效果。生产工艺为斜面菌种、摇瓶种子、种子罐、发酵罐、分离提取、抗菌代谢产物。该产物用于食品，能够有效地抑制食品中的有害微生物生长、延长食品的保质期。对食品和人类健康安全性高，不会导致对环境的污染，可用于天然食品和绿色食品加工。
文档编号A23L3/3571GK1477189SQ0313200
公开日2004年2月25日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者陆兆新, 别小妹, 吕凤霞 申请人:南京农业大学