白细胞介素－12的高效表达方法

专利名称：白细胞介素－12的高效表达方法
技术领域：
本发明涉及一种由生物技术制备白细胞介素-12(IL-12)的方法，特别涉及一种重组IL-12的表达方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
IL-12能够促进NK细胞、T细胞的增殖和杀伤活性，诱导γ-干扰素等细胞因子的产生，调节Th1细胞的发育，具有良好的临床应用前景。目前已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗哮喘的临床实验阶段。天然IL-12是一种主要由巨噬细胞和B细胞产生的异二聚体细胞因子，由P40和P35两个亚单位组成。细胞胞浆中P40的生成远大于P35，但只有P40和P35经二硫键连接的异二聚体才有生物学活性。
本发明前一些研究人员分别将P40和P35的基因分别插入同一种载体进行共转染(戴燕，陈慰峰。人重组白细胞介素12在CHO细胞中的表达。生物化学与生物物理进展，1998，25(3)254-258)，或在单一质粒中构建分别含P40和P35表达元件的载体(刘锰，郑珊珊。重组人细胞介素12基因在CHO-dhfr-细胞的稳定表达。免疫学杂志，1996，12(4)215-219)，也有人将P40和P35的基因融合构建IL-12单链真核表达载体进行表达(张梅，司履生，金莉等。重组人单链白细胞介素12融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定。中华血液学杂志，2000，21(12)636-640)，这些方法都未能实现IL-12的高效表达。将P40和P35的基因分别插入同一种载体进行共转染，由于共转染的效率较低，这种方法给表达IL-12的克隆筛选造成极大困难，很难得到高表达克隆，而且P40和P35的表达严重不平衡。在单一质粒中构建分别含P40和P35表达元件的载体，这种方法不管进行如何精确的平衡，由于两个目的基因在载体上的顺序不同，上游启动子携带的目的基因转录时常常阻碍下游启动子携带的目的基因的转录，P40和P35的表达也不平衡。构建IL-12单链真核表达载体进行表达，此种方法虽然可使两条链的表达平衡，但是由于对IL-12的空间结构了解甚少，接头的加入有可能影响IL-12两条链的折叠及空间结构，从而影响其生物学活性，对此种方法表达的IL-12的生物学活性报道不一。

发明内容
1、技术问题本发明的目的是提供一种简便的利用IL-12的P40和P35天然表达不平衡的特性、采用两种表达效率不同的载体、以使两条链的表达尽量平衡的白细胞介素-12的高效表达方法。
2、技术方案分别将IL-12的P40亚单位编码区cDNA插入pcDNA3真核表达载体，将IL-12的P35亚单位编码区cDNA插入pEE14真核高效表达载体，分别构建了pcDNA3/p40、pEE14/p35两种表达效率不同的真核细胞重组质粒，共转染宿主细胞后，在筛选培养基中同时加入G418(Geneticin)和甲硫氨酸亚砜(MSX)进行筛选，挑取存活的阳性克隆进行鉴定，获得高表达IL-12的阳性克隆；为进一步提高IL-12的表达量，用MSX对各高表达IL-12的阳性克隆进行加压扩增，获得具有产业化价值的工程细胞株。或者，用G418和MSX的组合对各高表达IL-12的阳性克隆进行加压扩增，获得具有产业化价值的工程细胞株。
其中，IL-12的基因包括人或哺乳动物IL-12的cDNA。P40和P35亚单位编码区cDNA可以直接在市场上购得，也可采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增获得。宿主细胞可以采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)或Non-secreting细胞(NSO细胞)等哺乳动物细胞。加压扩增时所用G418和MSX的组合可以是两者任意浓度之间的配合。
3、有益效果采用两种表达效率不同的载体共转染宿主细胞；用G418和MSX的组合对各阳性克隆加压扩增，这些是本发明特有的区别特征。与已有技术相比，本发明的优点是利用IL-12的P40和P35两条链天然表达不平衡的特性，将它们分别插入两种表达效率不同的载体，P40亚单位天然状态下易于高表达，将P40亚单位编码区cDNA插入表达效率较低的pcDNA3真核表达载体，P35亚单位天然状态下表达量较低，将P35亚单位编码区cDNA插入表达效率较高的pEE14真核高效表达载体，以使两条链的表达尽量平衡。同时不改变IL-12的结构，不影响IL-12的生物学活性。两种载体的筛选标志不同，重组载体共转染宿主细胞时有利于筛选出同时表达IL-12两条链的阳性克隆。且运用载体中含有的基因扩增系统，对各阳性克隆加压扩增，可以进一步提高表达量。尤其是采用G418和MSX的组合进行加压扩增，任意浓度的组合均比单独使用MSX的效果好。
四

图1是人IL-12p40cDNA的PCR产物的电泳图谱，其中泳道1为p40的PCR扩增产物，泳道2为λDNA/HindIII+EcoRI Marker；图2是pcDNA3/p40重组质粒的构建流程图；图3是人IL-12p35cDNA的PCR产物的电泳图谱，其中泳道1为p35的PCR扩增产物，泳道2为λDNA/HindIII+EcoRI Marker；图4是pEE14/p35重组质粒的构建流程图；图5是pcDNA3/p40、pEE14/p35稳定共转染CHO-K1细胞示意图；图6是非还原条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳后的Western Blot结果，泳道1为蛋白分子量标准(85.9kD，68.8kD，52.5kD，40.0kD，28.4kD)，泳道2为空质粒转染对照，泳道3-5为阳性克隆加压后的培养上清；图7是还原条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳后的Western Blot结果，泳道1为蛋白分子量标准(85.9kD，68.8kD，52.5kD，40.0kD，28.4kD)，泳道2为空质粒转染对照，泳道3为IL-12标准(peproTech公司)，泳道4-5为阳性克隆加压后的培养上清；图8是转染CHO细胞培养上清对PHA活化的PBMC增殖的刺激作用与标准品的比较。
五具体实施例方式
实施例11.1 pcDNA3/p40重组质粒的构建以提取的质粒T载体/p40为模板进行PCR扩增人IL-12的p40基因，预计长度1003bp(如图1)，参数为94℃ 1分钟，62℃ 1分钟，72℃ 2分钟，循环28次，末次延长7分钟。pcDNA3/p40重组质粒的构建流程(见图2)将pcDNA3质粒用HindIII和BamHI双酶切回收纯化后，与同样双酶切的PCR产物连接，产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子。阳性重组质粒委托大连宝生物生物技术有限公司测序，结果表明p35cDNA序列与报道一致。
1.2 pEE14/p35重组质粒的构建以提取的质粒T载体/p35为模板进行PCR扩增人IL-12的p35基因，预计长度676bp(如图3)，参数为94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，循环30次，末次延长7分钟。pEE14/p35重组质粒的构建流程(见图4)将SmaI酶切的pEE14质粒回收纯化后，与Klenow酶补平的p35目的基因的PCR产物进行平端连接，产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子。阳性重组质粒委托大连宝生物生物技术有限公司测序，结果表明p40cDNA序列与报道一致。
1.3 pcDNA3/p40、pEE14/p35用脂质体法稳定共转染CHO-K1细胞完整的IL-12分子是由两个不同的亚基组成的异二聚体分子，只有在同一系统中同时表达这两个亚基，并使它们正确装配，才有可能获得具有生物学活性的IL-12。pcDNA3/p40、pEE14/p35共转染CHO-K1细胞及阳性筛选(见图5)CHO-K1细胞培养在含10％小牛血清的F-12培养基中，按每孔3×105细胞的量在六孔板中接种指数生长期的CHO-K1细胞，37℃ 5％CO2培养至细胞约80％汇片。pcDNA3/p40、pEE14/p35重组质粒大量提取、聚乙二醇法纯化后，取pcDNA3/p40、pEE14/p35各1μg，混合。用LIPOFECTAMINTMReagent转染CHO-K1细胞，37℃5％CO2培养72小时后，0.25％胰蛋白酶消化，按1∶4稀释传入筛选DMEM培养基(含终浓度为25μM的MSX和600mg/L的G418)。培养约14天后，出现五个抗性克隆。挑取克隆转移至24孔板中，再转移至六孔板中培养，0.25％胰蛋白酶消化，提取RNA，进行RT-PCR鉴定p40mRNA、p35mRNA的表达，同时取培养上清进行ELISA和生物学活性测定。获得的5个抗性克隆均有IL-12表达。选取表达IL-12较高的1株克隆进行MSX加压扩增，MSX设100、250、500μM等浓度梯度，获得具有产业化价值的高表达IL-12的工程细胞株(详见下表)。
实施例2外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因在哺乳动物细胞内表达产量的重要方法之一。由于天然P40的生成远大于P35，本实施例中采用pEE14的谷氨酰胺合成酶(GS)基因作为显性基因扩增选择标记使P35的基因得到高效率扩增，以尽量与P40的表达平衡。从实施例1中选取表达IL-12较高的1株克隆进行加压扩增，MSX设100、250、500μM等浓度梯度，G418设600、800、1000、1200mg/L等浓度梯度，将MSX和G418各浓度梯度进行各种不同的组合，加入培养基进行目的基因的加压扩增，培养10-14天，中间更换一次培养液。挑取存活的克隆，取其培养上清Western Blot分析重组蛋白的表达并用ELISA技术测定表达量，获得具有产业化价值的高表达IL-12的工程细胞株。
阳性克隆经MSX或MSX和G418不同浓度梯度组合加压扩增后IL-12表达量(ng/ml)

阳性克隆的鉴定过程1.酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测定培养上清中的IL-12表达量在pcDNA3/p40、pEE14/p35用脂质体法稳定共转染CHO-K1细胞后阳性克隆筛选及后续的加压扩增过程中，均采用人IL-12 ELISA试剂盒(peproTech公司)作为快速筛选手段，取培养上清检测IL-12的分泌量，操作程序按试剂盒说明书进行。
2.mRNA转录分析对获得的抗性克隆经扩增培养后，异硫氰酸胍方法提取RNA进行RT-PCR分析，在5株抗性克隆中，均有p35mRNA和p40mRNA的转录。
3.免疫印迹(Western Blot)分析IL-12的表达pEE14空载体转染克隆的培养上清作对照，对获得的表达量较高的克隆，培养7天后，取培养上清聚丙烯酰胺凝胶电泳后Western blot分析，非还原电泳在70kD处出现阳性条带(见图6)，还原电泳在40kD和35kD处出现表达条带(见图7)。
4.IL-12的活性分析取人的新鲜肝素抗凝外周血，等体积Hanks液稀释。用Ficoll分离单个核细胞(PBMC)。Hanks液洗两遍后，悬于含10％小牛血清的RMPI1640完全培养基中，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入植物血凝素(PHA)(终浓度为10μg/ml)，按100μl/孔将细胞加入96孔板。培养72小时后，再加不同稀释度的IL-12标准品和待测上清。培养48小时后，每孔加入10μl四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养约4-6小时，离心，去除100μl上清。每孔加100μl含10％SDS的10mmol/LHCL，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待测样品曲线即可其测得待测样品中细胞因子的含量。将培养上清依次作1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000稀释，测定其促进PHA激活的PBMC的增殖活性结果如图8。发现转染CHO细胞培养上清稀释40000倍后仍可促进人PBMC增值，与标准品比较后推算出表达量约为1000ng/ml。
5.转染了IL-12 cDNA的CHO细胞株分泌IL-12的动态观察及稳定性分析我们对获得的工程细胞株分泌IL-12的动态进行了观察，此细胞株在撤去MSX压力条件下传代6个月后，仍能稳定分泌IL-12，表明经筛选得到的能高效表达IL-12的CHO细胞株是比较稳定的，具有产业化价值。
权利要求
1.一种白细胞介素-12的高效表达方法，其特征在于分别将IL-12的P40亚单位编码区cDNA插入pcDNA3真核表达载体、将IL-12的P35亚单位编码区cDNA插入pEE14真核高效表达载体，分别构建pcDNA3/p40、pEE14/p35两种表达效率不同的真核细胞重组质粒，共转染宿主细胞后，在筛选培养基中同时加入G418和MSX进行筛选，挑取存活的阳性克隆进行鉴定，获得高表达的IL-12的阳性克隆；用MSX对高表达的阳性克隆进行加压扩增，获得具有产业化价值的高表达IL-12的工程细胞株。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-12的高效表达方法，其特征在于用G418和MSX的组合对高表达IL-12的阳性克隆进行加压扩增，获得具有产业化价值的工程细胞株。
全文摘要
白细胞介素－12的高效表达方法涉及一种由生物技术制备白细胞介素－12(IL－12)的方法，该方法分别将IL－12的P40亚单位编码区cDNA插入pcDNA3真核表达载体、将IL－12的P35亚单位编码区cDNA插入pEE14真核高效表达载体，分别构建了pcDNA3/p40、pEE14/p35两种真核细胞重组质粒，共转染宿主细胞后，在筛选培养基中同时加入G418和MSX进行筛选，挑取存活的阳性克隆，对各阳性克隆加压扩增，获得高表达IL－12的工程细胞株。该方法简便的利用IL－12 P40和P35天然表达不平衡的特性，采用两种表达效率不同的载体，以使两条链的表达尽量平衡。
文档编号C12N5/08GK1467292SQ0313156
公开日2004年1月14日 申请日期2003年5月27日 优先权日2003年5月27日
发明者田志刚, 刘文涛, 魏海明 申请人:中国科学技术大学