多层试剂测试条和用它量度生理样品中糖化蛋白的方法

专利名称：多层试剂测试条和用它量度生理样品中糖化蛋白的方法
技术领域：
本发明的领域是被分析物检测，特别是糖化蛋白的检测。
背景技术：
患有糖尿病的人，由于胰腺不能分泌足够量的活性激素胰岛素到血流中以调节碳水化合物的代谢，所以通常都有异常高的血糖水平。假若异常高的血糖水平，已知为高血糖状态，再持续更长的时间，则患者将会受到糖尿病慢性并发症的威胁，包括视网膜病、肾病、神经病和心血管疾病等。研究指出，能维持接近正常的血糖控制的糖尿病患者会大大减少这些可怕并发症的可能性。因此，开发出了几种测试法用来测量和控制血糖的情况。
为控制血糖状况的一种通常的医学测试方法是直接测量糖尿病患者的血葡萄糖水平。由于血葡萄糖水平在一天中会有明显的波动，受到饮食、活动和治疗的影响，依赖于患者病例的状况和严重性，有的病人测量他们的血葡萄糖一天多达七次。基于测量葡萄糖的观察模式，病人和医师一起做了饮食、锻练和胰岛素摄入的调整，以便更好地控制疾病。显然，这种信息应当立刻提供给病人。
然而，由于在一天中葡萄糖水平时常发生变动，依赖于病人的饮食、活动和/或治疗并且提供较长时期血葡萄糖水平指示的测试法也已被开发。这些测试方法测量的是糖化蛋白或“蛋白结合葡萄糖”(PBG)的浓度。比如那些出现在全血、血浆和其他生物流体中的蛋白质，在非酶作用的情况下，可与葡萄糖发生反应而产生糖化蛋白。反应的程度直接取决于血液中的葡萄糖浓度。
最初开发的糖化蛋白的测试法之一是测量糖化血红蛋白，即血红蛋白A1c(HbA1c)，它反映的是约2到3个月期间的血糖控制情况。其他这类测试法测量血清蛋白，例如总糖化血清蛋白，或特异的糖化血清蛋白，即糖化白蛋白。糖化白蛋白反映2到3周期间内对血糖控制的居中情况。
还有另一种间接评定血糖浓度的方法就是分析糖化蛋白浓度。在体内血浆蛋白被糖化是通过葡萄糖和可利用的血蛋白的氨基之间主要是与赖氨酸残基的γ-氨基和蛋白质末端氨基酸上的α-氨基之间发生的非酶反应。葡萄糖结合到蛋白质的氨基上形成席夫碱，即醛亚胺，它再经历分子重排形成稳定的酮胺。在本领域中，这类酮胺一般已知为“果糖胺”。蛋白质糖化及果糖胺形成的程度是与血葡萄糖浓度成正比的。血清或血浆糖化蛋白水平的测量对于监测糖尿病的控制是有用的，因为在血清或血浆中糖化蛋白的浓度反映了大约半个月期间内血葡萄糖水平的平均数。
一种当前使用的化验方法提供血液糖化蛋白水平的准确测定，这就是Genzyme公司现在在市场上销售的GlyProTM化验，在美国专利号6,008,006中描述了这种化验方法。虽然这种化验方法提供了准确的分析结果，但它需要在临床实验室中由经过培训的技术人员使用复杂的仪器才能完成，因此不适合家庭或医师办公室使用。
美国专利号5,470,752；5,695,949和5,725,774描述一种用于果糖胺定量的多层试剂测试条，此测试条是为家庭或医师办公室使用而设计的。然而，用此处所描述的测试条所提供的检测不太准确，因为除了果糖胺分析物之外，在流体样品中的其他物质也与信号产生系统起反应，而且影响到由此产生的信号，导致用这种测试条在最终果糖胺定量测定时的不准确。
因此，需要继续关注另外的适合于糖化蛋白定量测定的多层试剂条形式的开发，这种测试条适合于家庭或医师办公室使用，而且提供高度准确的测量，与当前使用的基于临床实验室的方案所得到的一致。相关文献有关的美国专利包括5,470,752；5,695,949；5,725,774；6,008,006。有关的还有WO 96/31270；WO 96/31619；WO 96/34977；EP821064；和EP 737744。

发明内容
提供了一种多层试剂测试条，用于定量测定流体样品中的糖化蛋白，以及使用它的方法。本发明的多层测试条包括至少一个滤器层，一个蛋白酶层和一个产生酮胺氧化酶信号和流体流动控制系统层。在使用本发明的测试条时，把流体样品加到测试条上，然后就产生可被用来定量测定样品中糖化蛋白水平的信号。还提供了成套器件和系统，其包括本发明的测试条并用于实施本发明方法。本发明的组成和方法除了其他用途尤其可应用于糖化蛋白的监测。
附图简述

图1提供了按照本发明的一个具体实施方式
的多层试剂测试条的分解视图。
图2提供的是用单层血液分离层构造的测试条完成的化验图示结果。
图3提供的是用双层血液分离层构造的化验图示结果。
具体实施例方式
提供了为定量测量流体样品中糖化蛋白的多层试剂测试条及其使用方法。本发明的多层测试条包括至少一个滤器层，一个蛋白酶层，和一个产生酮胺氧化酶信号的流体流控制系统层。在使用本发明的测试条时，将流体样品加到测试条上，然后产生信号，此信号可用来定量测量样品中糖化蛋白水平。还提供了成套器件和系统，其包括本发明的测试条并用于实施本发明方法。除了其它用途，本发明的组成和方法尤其可应用于糖化蛋白的监测。
在进一步描述本发明之前，需要说明的是本发明不仅限于以下所描述的本发明的具体实施方式
，因为这些具体实施方式
可以做些改动，但仍然落在附加权限范围之内。还需要说明的是使用术语的目的是为了描述具体实施方式
，而并不是意在限制。换句话说，现在本发明的覆盖范围将由附加权限设定。
在本说明书和附加权限中，单数形式的“一个”、“一种”和“所述的”都包含了复数的指代物，除非上下文中另外明确说明。除非另有说明，否则在此处使用的所有技术术语和科学术语，都与在本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解的含意相同。
当提供了一个数值范围时，应理解的是，在该范围的上下限之间的每一居中值(至下限单位的十分之一位，除非另外规定)以及该范围中的任何其它所述值或居中值都包含在本发明内。这些较小范围的上下限可以被独立地归入所述的较小范围中，并且也包含在本发明内，服从于所述范围中的任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个所述限值时，排除其中任一个或全部两个的范围也将包括在本发明内。
除非另外指定，否则此处所使用的所有的技术术语和科学术语都与本发明所属的技术领域中的普通技术人员的理解具有相同的意义。尽管相似或等同于此处所描述的那些的任何方法、装置和材料都可用于本发明的实施或测试，但是优选的方法、装置和材料是现在所描述的。
此处提到的所有出版物都作为参考引入本发明中，目的是描述和披露元件范围(cell lines)、向量和方法，这些都是在所述出版物中介绍的，可以与目前描述的发明联合使用。
如同上面所概述的那样，本发明提供了多层试剂测试条，为的是定量测量样品中的糖化蛋白，以及提供了包括本发明的测试条的系统和成套器件。在本发明的进一步描述中，首先详尽介绍了测试条，然后是对使用测试条定量测定糖化蛋白水平的方法的综述。最后，还提供了依照本发明的代表性系统和成套器件的综述。多层试剂测试条如同上面所概述的，本发明提供了多层试剂测试条，本发明的测试条用于定量测量流体组分中的糖化蛋白，下面将更详细的描述。本发明的试剂测试条是多层的试剂测试条，这意谓本发明的试剂测试条包括多个不同的层，其中流体按顺序流过各层，使得加到多层中首层的流体按顺序地顺续流过所述多层的其余层。
构成本发明的测试条的相异层数目可以改变，通常范围约为2到10，在许多实施方式里通常约为3到7。在许多实施方式中，本发明的测试条包括最少三个不同的层，按顺序这几个层是(a)为从血浆中分离红细胞的血液滤器层；(b)蛋白酶层；和(c)产生酮胺氧化酶信号和流体流控制系统层。因此，本发明的测试条的许多实施方式按顺序至少包含有上述的层，以便第二个蛋白酶层与第一个血液滤器层流体连通，并且第三个酮胺氧化酶层与第二个蛋白酶层流体连通。在许多实施方式中，还有一个或多个附加层，它们提供附加的功能。
血液分离层(一层或多层)本发明的多层测试条的第一个组件是血液分离组件，这个组件是用来由全血产生血浆，然后血浆从那里流到随后各层以做进一步处理/分析。这个组件可以做成双层的分离组件，或者是单层的分离组件。这些不同的每一个实施方式将在下面详细描述。双层血液分离/过滤组件在某些实施方式中，使用一个双层结构从全血中产生血浆，在双层结构里包含一个血液分离层和一个滤器层，两层串联起来工作以提供没有红细胞的血浆，这种血浆随后在随后层中被化验。象在此处使用的，术语“血浆”意谓基本上无色的流体，它是用本发明的分离方法和装置从全血样品中除去红细胞后获得的。因为血浆是血清加凝固蛋白纤维蛋白原，所以术语″血浆″在此用来泛指血浆和血清。本发明的条的血液分离/滤器层包括一个分离基体和一个滤器层。
本发明的分离基体是一个可渗透的基体，不包含玻璃纤维，因之称作“可渗透的非玻璃纤维基体”。术语“可渗透的”意谓流体可渗透，例如可渗透血浆，以及当所提供基体中不存在多元醇时，对红细胞是有渗透性的或多孔性的。在此处使用的短语“在无多元醇存在时对红细胞是多孔性的基体”意谓在基体中或其上不含有多元醇时红细胞会很容易地透过基体，事实上是立刻穿过。在无多元醇存在时，通过过滤或其他方法，在基体内不会有红细胞滞留。
在基体的里面或上面含有的多元醇会与全血样品起化学反应而使红细胞凝块。在此处所使用的“凝块”意谓聚集成分散在全血样品中的一团或一组红细胞。尽管不愿受限于任何理论或机制，但凝块可以是凝集、凝聚等作用的结果，或是在多元醇和红细胞之间发生的一些其他的化学相互作用的结果。
有用的有渗透性的基体可以是织物或无纺织物材料，也可以是一种有吸收性的或无吸收性的材料，它可以是也可以不是亲水性的。尤其适用于作基体的材料包括，例如，织物或无纺织物、有吸收性的或无吸收性的、尼龙、人造丝、棉、丙烯酸类和聚酯类等。在本发明的一个实施方式里，基体是一种无纺织物、无吸收性的聚酯。该聚酯优选是聚(对苯二酸对亚苯基酯)，例如用于以Sontara(杜邦公司，Wilmington，Del.)出售的优选聚酯中的那种。另一种优选基体是织物、有吸收性的尼龙Tetex3-3710(Tetko公司，纽约州Lancaster)。
依赖于基体的多孔性或其他的特性，凝块的红细胞或者被滞留在基体里面，或者被滤器材料过滤出去，如下所述。上面介绍的某些基体材料，例如无纺、非吸收性的聚酯，在传统的理解中并没有“孔隙”，也就是说没有能够被测量到的孔隙，例如用孔径(微米)等。在无本发明的多元醇的情况下，这类材料基本上没有对多孔性的限制，并且对红细胞都是多孔的，红细胞的平均大小为5微米。藉助于这些大孔材料，如果多元醇不存在，则红细胞几乎是立刻穿过基体。对於那些可以孔径为特征的基体材料，用于本发明的这些基体一般具有的孔径大小为大约2微米到大约10微米。这样的孔径对滞留凝块的红细胞是有用的。依赖于基体的多孔性、厚度(通常是200到1100微米)和其他性质，例如吸收性等，凝块的红细胞或者被滞留在基体里面，或者被捕获在最后的滤器材料里，如下所述。
含有多元醇的基体具有用于加样的第一表面，具有的第二表面是用来容纳血浆或者血浆可于此进行附加的分离。通常，第一表面和第二表面是在基体的相对侧。全血样品从第一表面流向第二表面，产生此流向的条件是比如引力、真空或外压。为了提高方法的简易性，如果需要，可以单靠引力完成分离。优选地，分离基体优选通过引力提供垂直方向的流动。
分离方法和装置包括一个有渗透性的非玻璃纤维的含有多元醇的基体。如此处所使用的，术语“含有多元醇的基体”意谓多元醇是单独地加入到基体中，而不是基体组成或构成中的原始组分，例如纤维素滤纸。另外，“含有多元醇的基体”意谓多元醇可被浸渍入基体，或被涂布到基体里面或上面，或以共价键或非共价键的方式结合到基体上。在一个优选实施方式里，多元醇是被浸渍入基体的。
如同在此所使用的，术语 “多元醇”意谓一种多羟基的醇，它是一种含有多于一个羟基的烷基或芳族化合物。如在“多元醇”中所使用的术语“多”，并不表示烷基或芳族化合物是一个由重复单体构成的大聚合物，而是指在化合物中有多于一个的羟基。如以下所更充分讨论的，除了多糖以外，在本发明中所使用的多元醇可以是简单的糖或糖醇、寡糖、或其它天然存在或非天然存在的非聚合的烷基或芳族化合物。因此，术语“多元醇”包含糖、糖的醇衍生物，在此处称作“糖醇”，以及其它天然存在或非天然存在的非聚合的多元醇类。
如在此使用的，“糖”包括单糖、寡糖、和多糖。单糖是一种简单的糖，是呈线状、分枝状、或环状的多元醇，含有醛基或者酮基。典型的单糖包括，但并不限于，甘露糖、葡萄糖、塔罗糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖和果糖。寡糖是线性或者分枝状的碳水化合物，由二到十个单糖单元通过糖苷键结合而组成。可用于本发明的寡糖包括，但并不限于，双糖如蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖。用于本发明的较大分子的寡糖的例子包括环糊精，例如α-环己基直链淀粉、β-环庚直链淀粉、和γ-环辛直链淀粉，以及其它在本领域中已知的寡糖。多糖是任何一种具有多于十个单糖，靠糖苷键联结在一起的线性或分枝状的聚合物。典型的多糖包括，但并不限于，水溶性聚蔗糖、聚蔗糖、和羟乙基淀粉。
包含在“糖”里的有那些天然存在的糖，也有那些是已知但尚未被确认为天然存在于植物或动物中的糖。举例来说，有五种天然存在的己醛糖，包括D-葡萄糖、D-甘露糖、D-塔罗糖、D-半乳糖和L-半乳糖。然而，己醛糖的结构有四个手性碳，因此有十六个可能的立体异构体，所有这些都是已知的，虽然只有列在上面的五种是已被确认为天然存在于植物或动物中的。因此，“糖”包含糖的D型或者L型的对映体，以及它们的外消旋混合物。
本发明的多元醇也可以是“糖醇”。“糖醇”是单糖或寡糖的醇衍生物，一般是由单糖或寡糖中的醛基或酮基部分还原而形成的。典型的糖醇包括，但并不限于，甘露糖醇、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、半乳糖醇、赤藓醇和苏糖醇。在“糖醇”的定义里也包括上述的那些单糖和寡糖的醇衍生物。
当糖醇中有手性碳存在时，此糖醇就可能有D型或L型，例如D-苏糖醇和L-苏糖醇，或者是D型和L型的外消旋混合物。糖醇可以是、但并不必须是天然存在的。那就是说，糖醇可能是一种已知的、天然存在的糖的衍生物，或者，换句话说，它可能具有已知存在的D或L构型，但并不必须确认存在于自然界。糖醇也可能是一种天然存在的还原醇形式的糖，或者可能是一种糖的醇衍生物，未知此衍生物存在于自然界。
除了糖或糖醇以外，多元醇可以是非聚合的天然存在或者是非天然存在的多元醇，包括含有多于一个羟基的线性的、枝化的、或环状的烷基或芳族化合物。如在此使用的，术语“非聚合的”意谓此烷基或芳族化合物不是聚合物。聚合物被定义为由长链所组成的高分子量的化合物，此长链可以是打开的、关闭的、线性的、分枝的、或交联的，这些链由称作单体的重复单元组成，其可以是相同的也可以是不同的。如在此处使用的，那些“天然存在的”多元醇是存在于自然界的，而那些“非天然存在的”是在自然中没被发现的。通常，这些天然存在的或非天然存在的烷基或芳族化合物的大小范围是从三到二十个碳(C3-C20)，更优选地是从三到十个碳(C3-C10)。这些天然存在的、非聚合的多元醇的实例是丙三醇，一种三个碳的三羟基醇，存在于许多脂类中，还有奎宁酸，即1，3，4，5-四羟基环已羧酸，此酸可以呈盐的形式。非天然存在的、非聚合的多元醇的例子有季戊四醇和二(聚)季戊四醇。
在一个实施方式中，为了将多元醇加到基体上，通常是将多元醇简单地溶解于一水溶液中，当单独使用时浓度约为20％，当与聚阳离子聚合物联合使用时浓度约为10％，此聚合物的浓度通常约为0.5％到5％，更充分的讨论如下。如果需要，也可以使用包含较低浓度多元醇的多层基体，例如包含5％多元醇的四层基体。多元醇和，如果有的话，聚阳离子聚合物或可作为选择溶解于生理盐水(0.85％NaCl)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或有机溶剂等中。
除了多元醇以外，可以但不是必须将聚阳离子聚合物加到基体上。与把多元醇加到基体上的方法相同，聚阳离子聚合物也可以用物理方式浸渍、涂布到基体的里面或上面、或者以共价键方式或非共价键方式键合到基体上。聚阳离子聚合物对于凝块的和稳定化处理过的凝块红细胞也是有用的。
聚阳离子聚合物的组份可以是任何一种具有多于一个阳离子位点的聚合物，并且通常是基于含有胺基的单体。适合的聚阳离子聚合物包括，举例来说，抗肝素灵溴化物，亚丙基己二铵溴化物，聚赖氨酸，聚烯丙胺，聚精氨酸，聚(N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)，N，N-二甲基氨基乙基甲烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，聚乙烯亚胺，聚(二烯丙基二甲基胺氯化物)，聚(1，1-二甲基-3，5-二亚甲基哌啶鎓氯化物)，以及它们的混合物。聚合了带正电荷的氨基酸，例如聚赖氨酸，可能具有D或L型的氨基酸，例如聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸，或它们的外消旋混合物，例如聚-D，L-赖氨酸。
如上所述，在一个实施方式中为了将阳离子聚合物加到基体上，可将此聚合物溶解于一种溶液例如水、生理盐水、PBS、或有机溶剂等中，然后把基体浸入到含有聚合物的溶液中。通常，聚合物的浓度约为0.5％到5％。当在基体中多元醇和聚合物两者都含有时，把多元醇和聚合物加到基体上的次序是没有关系的。举例来说，多元醇和聚合物可以是同时，也可以是顺序溶入如上所述的水溶液或溶剂中，并且把多元醇和聚合物两者同时加到基体上，如下面实施例中所述。或者可选择的是，可以任何顺序将多元醇和聚合物加到基体上。
非溶血性的洗涤剂，例如Pluronic(Pragmatics，Inc.，Elkhart，Ind.)，可以加到上面所述的水溶液或溶剂中，通常是以0.01％到0.1％的浓度。这样的洗涤剂协助多元醇最大可能地浸渍到基体中去，从而改善全血样品和血浆的流速。其他可进一步增加流速的任选的试剂包括例如聚乙烯基吡咯烷酮或类似的聚合物，和其它能使基体和下述滤器材料坚硬的填料。
除此之外，基体可以包括一种或多种辅助的试剂以除去干扰物，例如，为除去抗坏血酸干扰的KIO3、KMnO4、FeSO4，为除去尿酸干扰的尿酸酶。
如上所示，滤器材料可以与本发明的基体联合使用。举例来说，合适的滤器材料包括尼龙、醋酸纤维素、聚砜、合成纤维、和聚碳酸酯。滤器可以是、但不必须是一层膜。举例来说，例示性的滤器和膜包括BTS聚砜膜(Memtek，Inc.，圣地亚哥，加州)，Ahlstrom合成纤维片，例如94-30A(Ahlstrom Filtration，Inc.，Mt.Holly Spring，Pa.)，Biodyne A尼龙膜(Pall Corp.，East Hills，纽约州)，Ultrabind 450(Gelman，Ann Arbor，Mich.)，和Nucleopore聚碳酸酯(Costar，Corp.，Cambridge，Mass.)。
对于任何辅助滤器材料的需要在很大程度上取决于基体的多孔性、厚度、吸收性或其他的特性。举例来说，取决于上述的基体特性，凝块的红细胞可以被保留在基体里面。可供选择的是，或除此之外，终滤材料可用来捕获或保留红细胞的任何其它凝块。如果存在，滤器材料具有的孔隙度一般高达约12微米，并且优选具有小于10微米的孔径，更优选是5微米或更小。
滤器材料可以放置在含多元醇的分离基体下面，藉此支持基体。
在本发明的优选实施方式中，血液分离方法和装置包含一个无纺织物的、非吸收性的用甘露醇浸渍过的聚酯基体，以及一个处于基体下面的尼龙膜或是聚砜膜。优选地，基体另外含有抗肝素灵溴化物和KIO3。
上述的双层过滤组件在美国专利5,470,752；5,695,949和5,725774中有进一步的讨论，有关这些专利的公开在此被参考编入。单层过滤层在其他的实施方式中，血液分离是藉助于由一个单过滤层构成的组件达到的。在这些实施方式中，单过滤层通常是多孔基体，其中样品穿过基体从一侧到另一侧移动时发生分离。为完成所述分离的有代表性的基体可具有捕获红细胞的微孔，通常孔径范围为大约0.1微米到大约5微米。在某些实施方式中，膜是各向异性的，具有一个孔径范围，例如，宽范围孔径。当基体包含各向异性的膜时，施加未过滤血液的首侧可以是大孔侧。举例来说，通过膜延伸的孔径梯度可以从大约0.1微米到大约150微米。在大孔侧，孔径范围优选为大约30微米到大约40微米。在膜的最小孔隙侧(即流体穿出通向下层的出口侧)，在通常占膜厚达20％的层中孔隙体积比较小，而膜材料通常相当致密。在这层里，有时孔径范围为大约0.1到大约0.8微米，公称孔径通常为0.3微米。在某些实施方式中，基体不但能捕获红细胞而且能减少细胞的溶解，以便通过基体通向液流方向的下游层的任何样品部分，都不会在约700纳米处有可检测到的光吸收。
分离层的基体通常是亲水性的多孔膜。这种基体允许含水介质通过它流动。聚砜和聚酰胺(尼龙)都是适合作基体材料的例子。具有可比性能的其它聚合物也可以使用。制备形成分离层基体的多孔材料的优选方法是在没有承重型芯的情况下浇铸聚合物。例如，这样的基体是各向异性的聚砜膜(购自Memtec，Inc.，San Diego，California)。术语“基体”和“膜”于此可交替使用。每个术语应理解为不仅限制在一个层，并且可以包括例如吸收层。小於大约500微米厚度的基体是通常使用的，约115到155微米是优选的。特别当使用尼龙或各向异性的聚砜做基体时，厚度约130到140微米是最优选的。基体通常在润湿时不变形，因此保持其最初构型和大小，而且具有足够的湿强度以允许常规制造。蛋白酶层在流体流动方向血液分离组件/层下游的是本发明的多层试剂测试条的蛋白酶层。这一层包含基体或膜材料和一种蛋白酶。基体材料是多孔性的并能让流体样品穿过此材料流动。在这层使用的基体通常是一种惰性的多孔基体，它为蛋白酶成分提供支撑。因此，基体能准许含水流体穿过它流动，并为蛋白酶提供足够的孔隙空间，使它能在通过基体的流体中的蛋白质上发挥其活性。为了在各种不同的分析物检测化验中使用，已开发出很多不同的多孔基体，这些基体可以在材料依据、孔径、尺度等方面有所不同，其中有代表性的基体包括那些已描述在如下美国专利中的55,932,431；5,874,099；5,871,767；5,869,077；5,866,322；5,834,001；5,800,829；5,800,828；5,798,113；5,670,381；5,663,054；5,459,080；5,459,078；5,441,894和5,212,061；关于这些专利的公开于此参考编入。测试条的尺寸和孔隙度可以有很大变化，其中基体可以有或没有孔隙度梯度，例如，较大的孔隙靠近或处于加样区，而较小的孔隙在检测区。感兴趣的基体材料的实例包括那些从聚酰胺(尼龙)、聚砜、聚酯、聚丙烯酸酯、纤维素、聚碳酸酯、硝基纤维素等制备的。
蛋白酶层还包括一种蛋白酶，即一种具有蛋白酶活性的酶。蛋白酶层的膜或基体通常是用蛋白酶涂布的方式以保护蛋白酶的活性。蛋白酶层的蛋白酶能劈开蛋白质分子以产生易受影响的酮胺键。任何方便的蛋白酶都可以使用，但是有代表性的蛋白酶包括蛋白酶XIV、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、substilisin和胰蛋白酶等。信号产生和流体流动控制系统层位于蛋白酶层下游并与蛋白酶层流体连通的是酮胺氧化酶信号产生和流体流动控制系统层。这个产生信号的系统层包括多孔基体或膜组件，比如上面所描述的，它包括一个酮胺氧化酶信号产生系统。在本发明的测试条里，信号产生系统的一种或多种构件是与基体的至少一部分(即检测区域)、并且在许多实施方式中基本上是与所有多孔基体连结的，例如共价或非共价连结。在许多实施方式中，基体或膜组件通常是用酮胺氧化酶信号产生系统的试剂涂布。
多层试剂测试条的这个特殊层的酮胺氧化酶信号产生系统是一个产生氧化信号的系统。产生氧化信号的系统意谓在产生推导出样品中酮胺浓度发生的可检测信号的过程中，酮胺键被酮胺氧化酶氧化，产生了氧化型底物和相应量的或比例量的过氧化氢。随后，过氧化氢被用来从一个或多个指示剂化合物中生成可检测的产物(于此共同归之为色原体系统)，其中使信号产生系统产生的可检测产物的量，即信号，与起始样品中酮胺的量相关。因此，设在本发明的测试条中的产生酮胺氧化酶氧化信号的系统也被准确地表征为基于过氧化氢的信号产生系统或产生过氧化物的信号产生系统。
如同上面所指出的，本发明的信号产生系统中的一个组分是酮胺氧化酶。用于本发明的试剂系统中的有意义的酮胺氧化酶都是那些专门氧化酮胺键的，产生出氧化底物和相应量的过氧化氢，此处相应量意谓所生成的过氧化氢的量与样品中的酮胺量成比例。各种不同的适用的酮胺氧化酶都是本领域中技术人员已知的，并且可以在本发明中使用，在这里有代表性的重要的酮胺氧化酶包括那些在美国专利5,712,138和6,008,006中所描述的，在此有关这些专利的公开被参考编入，以及在EP 821064和EP 737744中所描述的。
除了信号产生系统的酮胺氧化酶活性之外，信号产生系统还包括一种或多种指示剂化合物，在此共同归之为色原体系统，色原体系统在过氧化氢存在下生成一种显色产物。
信号产生系统还包括一种酶，它能在过氧化氢存在下催化染料底物转化到可检测产物，其中由这个反应生成的可检测产物的量与存在的过氧化氢的量成正比。这第二个酶通常是过氧化物酶，适用的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶(HRP)，大豆过氧化物酶，重组产生的过氧化物酶和具有过氧化活性的合成的类似物等。参见例如Ci等(1990)Analytica Chimica Acta，233299-302.
染料底物在有过氧化物酶存在时被过氧化氢氧化，生成一种在预定波长范围内吸光的产物，也就是，一种指示剂染料。优选的是指示剂染料在不同于样品或检测试剂强烈吸收的波长处有强烈吸收。指示剂的氧化型可以是有色的、弱色的、或无色的最终产物，它能显示膜的测试侧面的颜色变化。这就是说，测试试剂能指示样品中一种分析物的存在，根据有色区域被漂白，或者是根据无色区域展现出颜色。
在本发明中有用的染料底物包括尿素衍生物染料。尿素衍生物染料至少包括一些在JP 1118768；JP 9019296；EP 38 205，EP 124 287和EP 251297的专利中所公开的，有关这些专利的公开在此参考编入。染料底物通常是尿素的衍生物，具有负电荷，合适的带荷负电的尿素衍生物包括那些具有羧酸酯基(carboxylate group)或磺酸酯基(sulfonate group)的衍生物。感兴趣的尿素衍生物染料可用下式代表R1R2NCONHR3，其中R1、R2在一起是N，N-二元取代的氨芳基；和R3是由羧烷基、烷氧基羰基、烷基羰基、芳基磺酰基、磺芳基和羧芳基所组成的基团组中选择。
R1和R2的芳基基团通过S可以被键合形成吩噻嗪衍生物型染料，可用下式代表 其中R4和R5独立地选自NR2和OR，其中R是氢、(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基；R3是上面定义的；并且R6和R7独立地选自氢、(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基、酰基、，羧基、磺酰基、硝基、卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基或羟基-(C1-C6)烷基。
或者，R1和R2上的芳基可以经由O而键合，形成吩噁嗪衍生物型染料，可用下式代表 在又一个实施方式中，R1和R2的芳基不是键合的，可用下面的二苯胺式表示 典型的尿素衍生物染料包括10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪(无色亚甲蓝)、10-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺、10-丙酸吩噻嗪，和它们的盐。在一个优选的实施方式中，尿素衍生物染料是10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪的钠盐。
一个特别优选的酮胺氧化酶信号产生系统层是这样一种，它包含美国专利申请序列号为09/593,827(关于此专利的公开被参考编入)中所描述的层，该层包含酮胺氧化酶，如上所述。
在许多实施方式中，酮胺氧化酶信号产生系统层是疏水层，它使含水物质延迟进入层内，使得在测试条上正在进行化验的样品中的血浆部分在蛋白酶层中留存一段时间，此时间长于如果信号产生系统不做疏水处理的情况，举例来说，时间至少加长约5倍，通常至少加长约10倍。信号产生系统层的这个特征保证了血浆在蛋白酶层存留一段足够的时间，为的是让蛋白酶充分地劈开存在于血浆中的蛋白质，以产生易受影响的酮胺。
信号产生系统层可以用任何方便的方案来使其疏水。特别有用的一种方案描述于美国专利申请序号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，与本发明同时提交，题目为“包括至少一层流体流动控制层的多层试剂测试条及其使用方法，”(代理人记录号为LIFE-120，LFS 236)，关于它们的公开在此参考编入。在这个方案中，包括信号产生系统的多孔基体是用一种有机溶剂涂布，例如，通过将膜浸渍在有机溶剂中的方法。有关的有机溶剂包括，但不限于，氯仿、二氯甲烷、卤化烃、烃、醋酸乙酯等。使信号产生系统疏水的另一个重要方案是这样一种方法，即把膜用脂肪酸或其它的流体保留试剂涂布，例如在美国专利5,447,689中所描述的，有关它的公开在此参考编入。附加层除了上面的特殊滤器层、蛋白酶层和酮胺氧化酶信号产生系统层的各层之外，本发明的多层试剂测试条还可以包括许多附加层。
在上述层的上面可放置一个网状物层(mesh layer)，用于使所有其后层或下置层结合在一起。网状物层可以从任何的方便材料来制作，例如一种惰性的基体材料，如上所述。除此之外，一种透明聚合层，例如，聚酯或类似的聚合材料层，可以存在于信号产生系统层之下，此层用于提高血浆流动和在完成化验之前保护血浆样品不致变干。
上述的这些层经常以一种“堆叠”结构出现，如图1所示，而且可以放在一个被在上面的挡护板片和一个支撑组件固定起来的小槽中。典型的例示性实施方式图1提供了按照本发明的多层测试条的分解图。在图1中，多层试剂测试条10包括在网状物层12之上的注模的挡板组件11，而网状物层12是在分离层13和滤器层14之上，13和14一起组成血液分离组件。紧接在分离组件下面的是蛋白酶层15。在蛋白酶层15下面是信号产生层16，它是在聚合膜层17之上。以上这些层都置于支持组件18上，它包括一个手持区18a和一个样品化验区18b。
如同在图1中所能看到的，每个不同的层都是圆盘形的层，其中分离的各层是以一个在另一个之上的堆叠结构向上叠置。在许多实施方式中，每一个不同层的表面积典型范围为大约0.1cm2到大约0.25cm2，通常是为大约0.125cm2到大约0.18cm2，这样在示于图1的实施方式中的这些圆盘形层一般具有直径范围为大约0.35cm到大约0.6cm，通常为大约0.4cm到大约0.5cm。
支持组件18的总体尺寸是为提供便于手持的装置而选定的，以致支持组件具有的宽度典型范围是从约0.25英寸到约0.7英寸，通常从约0.45英寸到约0.55英寸，和长度范围从约1.5英寸到约3英寸，通常从约2英寸到约2.5英寸。
注模的挡板组件11典型性地具有的宽度范围从约0.18英寸到约0.5英寸，通常从约0.3英寸到约0.38英寸，和长度范围从约0.35英寸到约0.68英寸，通常从约0.45英寸到约0.56英寸。测试条制造本发明的试剂测试条可以使用任何方便的方案来制作。典型地，各种不同的层分开制造，举例来说，使用常规的在一种或多种试剂溶液中浸渍的方案，然后装配到最后的测试条之内。在实验部分中提供了一个有代表性的制作方案，见下文。糖化蛋白的检测方法上述多层试剂测试条可用在检测方法中，用于检测样品中蛋白质上酮胺基的存在和通常是检测其量。原则上本发明的方法可用来测定酮胺基团在各种不同的生理样品中，例如在小便、泪滴、唾液等中是否存在，但经常是测定其浓度，它们特别适合用于测定在血液或血液部分中的酮胺基团浓度，例如，在血液产生的样品中，更特别是在全血中。
本发明的方法的一个重要特征是本发明的信号产生系统的使用，此系统包括尿素衍生物染料可提供过氧化氢的高灵敏性检测。因此，使用本发明的稳定的干试剂模式，例如，测试条，可以在亚毫摩尔的浓度下检测到过氧化氢，其中亚毫摩尔浓度典型地意谓浓度范围从0.01到1毫摩尔，通常从约0.050到0.8毫摩尔。与包含不是尿素衍生物染料的染料底物(例如，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺，4-氨基安替比林)的信号产生系统相比，使用包含尿素衍生物染料的本发明的信号产生系统可提供对过氧化氢更灵敏的检测。
在实施本发明的方法时，第一步要把一定量的生理样品加到测试条上，有关测试条的描述见上文。加到测试条上的生理样品例如血的量可以不同，但其范围一般从大约2微升到40微升，通常从大约5微升到20微升。由于本发明的测试条的性质，所以施加到测试条上的血样量可以是比较小的，此量的范围从大约2微升到40微升，通常从大约5微升到20微升。如果血是生理样品，则各种不同血细胞比容的血样品都可以用本发明的方法化验，此处血细胞比容的范围可以从大约20％到65％，通常从大约25％到60％。
在样品施加到测试条以后，使样品经过条的各种不同的层顺序流动，以便样品在分离组件中被分离开，在蛋白酶层中被消化，然后与信号产生系统层中的信号产生系统的组分起反应而产生出一种可检测的产物，它的量与在样品中酮胺基的起始量是成正比的。可检测的产物即由信号产生系统产生的信号的量接着被检测，并与起始样品中糖化蛋白的量相关联。功用上面叙述过的方法主要应用于测试液体样品，以测定在其中的蛋白质上酮铵基的浓度的任何用途。特别重要的是使用本发明的方法测定/监视血葡萄糖水平。在上述的应用里，用本发明的方法提供的检测酮胺基浓度可用于测定在测试样品中糖化蛋白的量，如同在本领域中已知的，其随即可被用来监测血葡萄糖水平，例如，在对糖尿病患者的治疗和护理方面所需要的。本发明的测试条的功用进一步描述在美国专利5,470,752；5,695,949；5,725,774；和6,008,006中，有关这些专利的公开在此被参考编入。检测系统用于实践本发明的方法的检测系统包括如上所述的试剂测试条和信号检测仪或阅读器。在这样的系统中，将一个生理样品加到如上所述的测试条上，用仪器检测信号产生系统所产生的信号，并与样品中糖化蛋白的存在(经常是数量)相关联。上述的反应、检测和关联步骤，以及实施这些步骤的仪器，进一步描述于美国专利4,734,360；4,900,666；4,935,346；5,059,394；5,304,468；5,306,623；5,418,142；5,426,032；5,515,170；5,526,120；5,563,042；5,620,863；5,753,429；5,573,452；5,780,304；5,789,255；5,843,691；5,846,486；5,902,731；5,968,836和5,972,294中；有关这些专利的公开在此被参考编入。在关联步骤中，例如通过对仪器相应地进行校准，导出的糖化蛋白浓度考虑了竞争反应对观察信号的固定影响。成套器件本发明还提供了用于实践本发明的方法的成套器件。本发明的成套器件包括如上所述的试剂测试条和至少一种为获得所说生理样品的工具，例如，为刺手指用的一种小刀和小刀驱动工具等，以及一个基准物，例如，糖化蛋白的对照溶液，它含有标准浓度的酮胺或其前体，例如，糖化蛋白。在某些实施方式中，成套器件还备有一个检测仪器，如上所述，为检测在试剂条上加样后所产生的产物的量，以及把检测物关联到样品中分析物的是否出现(经常是量)。最后，成套器件备有在测定生理样品中糖化蛋白浓度时使用本发明的成套器件的组件的说明书。这些说明书可在包装、一个标志插页和成套器件容器等的一种或多种内。
下面的实施例都是用作说明的，而不是用作限制的。
实施例I.试剂测试条的制备A血液分离层筛网将Tetko#7-280/44筛网放入1％Pluronic(Pragmatics.公司)的洗涤剂溶液中一分钟。除去过剩的洗涤剂，然后把筛网在60℃下加热10分钟使干燥。
血液分离基体把含有10％甘露醇，1.25％抗肝素灵溴化物和1％碘酸钾(KIO3)的生理盐水(0.85％NaCl)溶液，灌注到置于自动浸渍/干燥器件(AFM Engineering.Santa Anna.加州)之上的Sontara@#8007(杜邦公司)上。干燥温度为100℃，干燥约10分钟。
Memtec聚砜膜是未经处理的。B消化层把200毫克/毫升的蛋白酶XIV(Sigma)溶解在100mM EPPS中，pH8.0。将尼龙筛网3-200/39(SEFAR)浸入蛋白酶XIV溶液内。除去过剩的溶液，然后将筛网置于56℃下加热10分钟使其干燥。C颜色形成和流体流动控制层A浸液在20mM PBS，pH7.4中含有300U/ml的KAO，1毫克/毫升的HRP，1％PVP(MW＝360K)和50毫克/毫升甘露醇。把尼龙膜(Pall)浸入到此溶液内，除去过剩的溶液，然后把膜置于56℃下加热5分钟使其干燥。
B浸液在A浸之后，把尼龙膜再浸入到在70％甲醇中含有1mM DA-60的B浸液内。把浸过的膜置于56℃下加热5分钟进行干燥。
C浸液把A和B浸过的膜快速拖拉通入二氯甲烷溶剂。除去过剩的溶剂，然后将该膜置于通风罩下在室温经过2分钟进行干燥。D测试条的组装件将每层切成直径为0.476厘米(3/16英寸)的圆片，然后把它们按顺序如图1所示组装成最后的条。II.使用如实施例I中制作的试剂测试条化验糖化蛋白。图2使用单层的血液分离层条设计，也就是，血液分离层只有聚砜膜。把15微升病人的全血加到测试条上，再把测试条置于37℃保温5分钟，然后用Macbeth反射分光计阅读颜色强度。图3单层对双层血液分离条设计的比较。单层只是用聚砜膜作为血液分离层。双层是由Sontara滤器材料和聚砜膜两者组成。将15微升具有低、中和高水平糖蛋白的全血加到测试条上。将条置于40℃保温5分钟。用Macbeth反射分光计读取颜色强度。在双层条的设计里，对处于不同糖蛋白水平的颜色强度斜率有显著的增加，明确地给出较好的分辨范围。在图3中所有的数据点都代表着八次重复的平均值，而对两种条的变差系数都在10％左右。
显然从上述的结果和讨论可以看到，本发明提供了一个高度灵敏和准确的糖化蛋白检测系统，它能提供的结果在可靠性和精确性方面与通常只有在临床实验室环境才能达到的结果可相比拟，但此系统是一种能被病人或医生在非实验室环境使用的，例如，在家或在医生的办公室中使用。因此，本发明是对本领域的一个重要的贡献。
在本说明书中所有引用的出版物和专利都在此参考编入，就如同每个个别的出版物或专利都被明确地和个别地指出已被参考编入。任何出版物的引用是在提交日之前公开的内容，在此不能根据在先的发明认为本发明不早于这样的公开文件。
虽然为了透彻理解的目的，在一些细节上以说明和举例的方式对本发明进行了描述，但很容易明白，对那些本领域中的普通技术人员而言可对其进行某些改动和修饰，而不偏离附加权限的精神或范围。
权利要求
1.一种多层测试条，包含(a)血液分离组件，用于从血浆分离红细胞；(b)蛋白酶层，与所述的血液分离组件流体联通；和(c)酮胺氧化酶信号产生系统层，与所述的蛋白酶层流体联通。
2.权利要求1的多层测试条，其中酮胺氧化酶信号产生系统层是疏水的。
3.权利要求2的多层测试条，其中所述各层都是以堆叠结构存在。
4.权利要求1、2或3的多层测试条，其中所述的蛋白酶层包含多孔基体和蛋白酶，该蛋白酶劈开蛋白质以产生酮胺氧化酶可接近的酮胺键。
5.权利要求1到4的多层测试条，其中所述的酮胺氧化酶信号产生系统层包含多孔基体、酮胺氧化酶、过氧化物酶和至少一种指示剂化合物。
6.一种测量流体样品中糖化蛋白量的测量系统，该系统包含(a)权利要求1到5的多层测试条，和(b)信号检测仪，用于检测在所述多层测试条上产生的信号。
7.一种量度在生理样品中的糖化蛋白量的方法，该方法包括(a)把所述的生理样品加到权利要求1-5的多层测试条上；(b)检测在所述测试条上产生的信号，以量度在所述生理样品中的糖化蛋白量。
8.用于测定生理样品中糖化蛋白浓度的成套器件，该成套器件包括(a)权利要求1到5的多层试剂测试条；和(b)下列中的至少一种(i)获取生理样品的工具，和(ii)对照标准。
9.一种信号检测仪，其中带有权利要求1到5的多层试剂测试条。
全文摘要
提供了为量度流体样品中糖化蛋白的多层试剂测试条，以及使用它的方法。本发明的多层测试条至少包括一个滤器层、一个蛋白酶层和一个酮胺氧化酶信号产生和流体流动控制系统层。在使用本发明的测试条时，把流体样品加到测试条上，信号随之产生，此信号可被利用来量度样品中的糖化蛋白的水平。定量化的糖化蛋白水平随后可用来测定流体样品中糖化蛋白的量。还提供的有包括本发明的测试条和用于实施本发明的方法的成套器件和系统。除其它功用外，本发明的组成和方法还可应用于糖化蛋白监测用途。
文档编号C12Q1/37GK1456680SQ0313124
公开日2003年11月19日 申请日期2003年5月8日 优先权日2002年5月10日
发明者钱苏月, S·郭, K·-W·梁 申请人:生命扫描有限公司