专利名称：重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人白细胞介素12 ( rhIL-12)真核表达载体的研 制和应用。具体涉及该载体的构建、表达鉴定、生物学活性分析、 rfiIL-12在真核细胞中稳定表达细胞系的筛选、 一种核酸疫苗的基因 佐剂和肿瘤基因治疗制剂。
背景技术：
IL-12是一种由异源二聚体蛋白组成的细胞因子，编码IL-12 两个亚基(p35、 p40)的基因位于不同的染色体上，二者分别合 成后再通过亚基间二硫键结合成具有生物学活性的二聚体分子 (p70)。单独的亚基不能发挥其生物学作用。而且，p40易形成 同源二聚体，通过受体竞争机制抑制IL-12的活性。
中国专利200410080518.7公开了一种纯化重组人白细胞介素12 的方法，涉及蛋白质纯化方法。本发明纯化重组人白细胞介素12的 方法，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换 层析和阴离子交换层析；所述重组人白细胞介素12的细胞培养上清 液进行所述阳离子交换层析时，pH高于重组人白细胞介素12的等电 点；进行所述阴离子交换层析时，先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去 杂蛋白，接着洗脱收集目的物。但是这种方法生产rhIL-12，产出的 rfiIL-12纯度不够，目前还不能用于临床使用。
目前，国外已经将人IL-12真核表达载体和rhIL-12作为治疗制
剂进入n/m期临床实验阶段，涉及多种传染性疾病、肿瘤、甚至自
身免疫性疾病的治疗。使用人IL-12真核表达载体进行肿瘤进行基因 治疗己成为肿瘤生物治疗的一个新策略；也为临床病毒性疾病及多种 自身免疫性疾病的治疗开辟了新的研究领域。本研究拟构建一种rhIL-12的真核表达载体、对其进行表达鉴定、 研究其基因佐剂功能和肿瘤基因治疗作用，并筛选其稳定表达细胞 系。rhIL-12真核表达载体的研制、在真核细胞中稳定表达细胞系的 建立、其基因佐剂和肿瘤基因治疗功能的探索对于rhIL-12的理论和 应用研究均具有重要的意义，并具有潜在的市场前景。
发明内容
本发明提供了重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应 用。构建rIL-12真核表达载体(pCDNA6-IL-12)，对其进行体外表达 鉴定及表达产物的生物学活性分析；将其与重组人巨细病毒被膜蛋白 PP65腺病毒核酸疫苗(Adno-pp65)共同免疫动物，评价其对核酸疫 苗的基因佐剂功能；将其直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或导入 肿瘤细胞后再致瘤，观察其对肿瘤的基因治疗作用；筛选rhlL-12稳 定表达细胞系。本发明已基本达到进入I期临床实验阶段，可审慎选 择少量临床病例进行体内应用研究，以积累经验，探索和完善方法， 为其后正轨的I期临床研究提供支持。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案 pCDNA6-IL-12的构建采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方 案获取rlL-12P40、 P35融合基因，本构建策略不仅可保证P40、 P35 两亚基以1: 1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延 展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。融合基因插入真核表 达质粒(pcDNA6/v5-hisp),构建pCDNA6-IL-12; 通过酶切、测序 鉴定重组克隆。将pCDNA6-IL-12导入HEK293细胞，ELISA检测培 养上清液中rhlL-12表达。
rh-IL-12体外生物学活性分析应用特异性淋巴细胞增生实验、 NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等方法对rhIL-12进行体 外生物学活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐剂功能研究pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫。检测其对核酸疫苗 的基因佐剂功能
应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤基因治疗的研究(l)以小鼠肉瘤细 胞(S-180)在昆明种小鼠建立荷瘤模型，将pCDNA6-IL-12直接瘤 体内注射。(2)将pCDNA6-IL-12转染小鼠乳腺癌细胞株EMT6，经筛 选获得rhlL-12基因修饰的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/IL-12);接种实 验小鼠，观察并检测其对肿瘤的基因治疗作用。
rhIL-12稳定表达细胞系的筛选将pCDNA6-IL-12转染CHO细 胞；用Blasticidin筛选rhIL-12阳性表达克隆，并进行单克隆扩增、 表达鉴定及表达稳定观察。
pCDNA6-IL-l2在实验小鼠体内应用的初步安全性评价 pCDNA6-IL-12在实验小鼠体内大剂量应用(肌肉注射)。观察其体 温、体重、 一般状况等。
本发明的主要成果本发明成功地构建了重组人白细胞介素12 的单链双亚基真核表达质粒(pCDNA6-IL-12)，并证明其表达的产物 (rhIL-12)具有预期的生物学活性。应用弹性蛋白接头连接rhIL-12 两个亚基的方案在国内为首次报道，享有独立的知识产权。
pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗在实验小鼠体内共免疫，可 显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。经进一步 完善后，可进入临床试用阶段的研究。
pCDNA6-IL-12于实验小鼠瘤体内注射或应用pCDNA6-IL-12对 肿瘤细胞进行基因修饰后再致瘤的研究表明，pCDNA6-IL-12通过激 发机体的抗肿瘤细胞免疫机制而发挥抗肿瘤作用，研究结果令人振 奋。同时获得了经基因修饰并稳定表达rhlL-12的小鼠乳腺癌细胞株 (EMT6/IL-12)。为应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤生物治疗的I期临 床研究奠定了基础。
成功地筛选出稳定表达rhIL-12的细胞系，为进行rhIL-12的中试生产和纯化铺平了道路，并为其进一步深入的功能研究和产业化开发 奠定了基础。初步的安全性评价结果表明，其在实验小鼠体内应用具 有较好的安全性。
具体实施例方式
本具体实施方式
采用以下技术方案pCDNA6-IL-12的构建采 用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12 P40、 P35融合 基因，本构建策略不仅可保证P40、 P35两亚基以l: 1比率表达，而 且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最 大的生物学活性。融合基因插入真核表达质粒(pcDNA6/v5-hisp)， 构建pCDNA6-IL-12; 通过酶切、测序鉴定重组克隆。将 pCDNA6-IL-12导入HEK293细胞，ELISA检测培养上清液中rhIL-12 表达。
rh-IL-12体外生物学活性分析应用特异性淋巴细胞增生实验、 NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等方法对rhIL-12进行体 外生物学活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐剂功能研究pCDNA6-IL-12与HCMV 核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫。检测其对核酸疫苗 的基因佐剂功能
应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤基因治疗的研究(l)以小鼠肉瘤细 胞(S-180)在昆明种小鼠建立荷瘤模型，将pCDNA6-IL-12直接瘤 体内注射。(2)将pCDNA6-IL-12转染小鼠乳腺癌细胞株EMT6,经筛选 获得rhlL-12基因修饰的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/IL-12);观察并检 测其对肿瘤的基因治疗作用
rhIL-12稳定表达细胞系的筛选将pCDNA6-IL-12转染CHO细 胞；用Bksticidin筛选rhlL-12阳性表达克隆，并进行单克隆扩增、 表达鉴定及表达稳定观察。
权利要求
1、重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于pCDNA6-IL-12的构建过程采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12 P40、P35融合基因，插入真核表达质粒(pcDNA6/v5-hisp)，构建重组rIL-12表达载体(pCDNA6-IL-12)；通过酶切、测序鉴定重组克隆。
2、 根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的 构建及其应用，其特征在于rh-IL-12体外生物学活性分析应用特 异性淋巴细胞增生实验、NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等 方法对rhIL-12进行体外生物学活性分析。
3、 根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的 构建及其应用，其特征在于基因佐剂功能；pCDNA6-IL-12与HCMV 核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫，能显著增强疫苗的 免疫效果。
4、 根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的 构建及其应用，其特征在于肿瘤基因治疗作用将pCDNA6-IL-12 直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或导入乳腺癌细胞内再致瘤，表 现出抗肿瘤作用。
5、 根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的 构建及其应用，其特征在于rhIL-12稳定表达细胞系的建立将 pCDNA6-IL-12转染CHO细胞，用Blasticidin筛选出rhIL-12阳性 表达克隆，获得稳定表达细胞系。
全文摘要
重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，它涉及重组人白细胞介素12(rhIL-12)表达载体的研制、稳定表达细胞系的筛选、其核酸疫苗基因佐剂功能和肿瘤基因治疗作用。采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接P40、P35获得融合基因构建rhIL-12真核表达质粒(pCDNA6-IL-12)。将其转染CHO细胞筛选出了稳定表达细胞系，并且表达产物具有良好的生物学活性。pCDNA6-IL-12与核酸疫苗共免疫可显著增强其免疫效果。直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或用其对肿瘤细胞进行基因修饰后再植入均可发挥强大的抗肿瘤作用。经进一步完善后可进入临床试用阶段的研究。
文档编号C12N15/24GK101638657SQ20081018346
公开日2010年2月3日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者张文卿 申请人:张文卿