专利名称：人白细胞介素－12在银纹夜蛾中的表达及其纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，具体地说，本发明涉及利用含有人白细胞介素-12基因的重组昆虫病毒株在银纹夜蛾幼虫活体中高效表达人白细胞介素-12，同时本发明还涉及一种人白细胞介素-12纯化的方法。
背景技术：
人白细胞介素-12(human lnterlukin12，hIL-12)是人体的重要细胞因子，也称之为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒性淋巴成熟因子(CLMF)。1989年，Kobayashi等先分离并纯化hIL-12(Kobayashi M，et a1.J Exp Med，1989ml70827-845)。1991年，Gubler和Wolf克隆了hIL-12 cDNA全序列，并在哺乳动物细胞中表达(Gubler U，et al，Proc Nati Acad Sci USA，1991，884143-4147；Wolf S F，et al，J Immunol，1991，1463047-3081)。hIL-12是由不具基因相关性的两个蛋白质亚基P35和P40通过二硫键相连构成一个70KDa的糖蛋白异二聚体。P35亚基有197个氨基酸残基，分子量为31KDa；P40亚基有306个氨基酸残基，分子量为40KDa。P35亚基是传递信息的功能亚单位(Gubler，at al.JBiol Chem，1995，27011)而P40亚基是hIL-12与细胞受体结合的功能蛋白质(Gillessen S，et al European Journal of Immunology，1995，251)。IL-12主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的启答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动TH0细胞向TH1细胞的发育，在抗病毒、抗肿瘤、抗细胞内寄生菌感染、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用。(Lamont AG，et al，lmmunology Today，1996，17214-217)。
国内外学者(杨林等，微生物学报，2001，41(1)35-41，魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587，Kazuaki Takehara et al VeterinaryImmunology and Immunopathology，2000，7715-25)利用昆虫病毒双表达载体共表达白细胞介素12双亚基，或者分别表达P35、P40亚基(沈惠等，生物工程学报，1998，14(4)360-364)。或者利用腺病毒载体的E1和E3缺陷区，分别将P40和P35克隆到E1和E3缺陷区进行表达(章卫平等，中华医学杂志，1998，78(1)33-36；中国专利CN98126748.3，申请日1998年12月13日)，并将能表达hIL-12的病毒应用于治疗。
白细胞介素-12是目前所发现的细胞因子中对体内免疫活性细胞诱导调节作用最强且范围最广的一种细胞因子，参与抗体的抗肿瘤、抗过敏、抗感染过程。目前，美国已将IL-12用于治疗艾滋患者和肿瘤患者，现已进临床III期。IL-12用于抗利什曼原虫、抗疟原虫、抗结核病、抗血吸虫病也已进入动物实验。1997年，Michael Brunda研究组报道，IL-12对多种肿瘤具有明显作用，包括对肾瘤、黑色素瘤，Colon肿瘤和14种亚性肿瘤。在把IL-12用于治疗小鼠16F16黑瘤的模型中，IL-12注射于患瘤鼠，可抑制肿瘤生长；直接把IL-12注射到肿瘤部位导致肿瘤退化，在长期处理后，肿瘤消退，动物治愈。
虽然研究表明hIL-12有巨大的应用前景，并且具有许多制备hIL-12的方法，但是hIL-12的使用存在量的问题，过量的使用会引起机体的免疫反应，产生毒性作用。因此，采用基因工程的方法获得hIL-12用于临床治疗，适时适量提供病人，优于基因治疗，并且基因治疗中存在着导入的病毒安全性的问题。另外，尽管有学者分别表达P35、P40亚基，但由于hIL-12中的P35、P40亚基经形成二聚体才具有活性。因此，需P35、P40双亚基共表达。国内外学者(魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587)也有利用AcNPV系统在昆虫sf细胞中共表达P35和P40双亚基。
发明内容
本发明的目的是提供一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，利用含有人白细胞介素-12基因的重组昆虫病毒株感染银纹夜蛾幼虫活体，体内高效表达由P35和P40双亚基构成的人白细胞介素-12异二聚体的方法。
本发明的另一个目的是提供一种制备高纯度人白细胞介素-12的纯化方法。用该方法制备的人白细胞介素-12具有明显的生物活性。
为了达到上述目的，本发明叙述如下本发明所利用的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒属一株命名为重组AcNPV的毒株AcNPV-hIL12(CCTCC NOV200108)，该株已申请中国专利，专利申请号为01133631.5，一种表达人白细胞介素-12(hIL-12)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株，该重组病毒株插入了人白细胞介素-12表达盒，表达盒包括双启动子序列，人白细胞介素-12的P35亚基DNA编码序列和P40亚基DNA编码序列，P35亚基基因位于Polyhedrin启动子下游，P40亚基基因位于P10 promoter启动子下游。其特征是通过血腔注射AcNPV-hIL12感染银纹夜蛾幼虫，高效表达重组人白细胞介素-12，并经亲和层析纯化获得人白细胞介2素-12。其方法为采取血腔注射4龄银纹夜蛾幼虫第2腹足方法，按2μl1×107pfu/ml AcNPV-hIL12注射1头银纹夜蛾的剂量感染。96h后，用75％酒精消毒银纹夜蛾幼虫，消毒针刺破头部，收集血淋巴于灭菌管中；再将人白细胞介素-12mAb偶联于Sepharose CL-4B上，通过亲和层析法纯化人白细胞介素-12，其具体方法是将hIL-12mAb偶联于Sepharose CL-4B，重组杆状病毒AcNPV-hIL12经血腔感染银纹夜蛾幼虫96h，血淋巴经100,000g离心30min，收集上清。采用hIL-12mAb Sepharose CL-4B柱免疫亲和层析纯化hIL-12。获得有明显生物活性的人白细胞介素-12蛋白。
AcNPV-hIL12感染银纹夜蛾幼虫细胞变化AcNPV-hIL12经血腔感染4龄银纹夜蛾幼虫。经包埋，超薄切片、染色，用透射电镜观察。AcNPV-hIL12经血腔注射感染4龄银纹夜蛾幼虫72h，经透射电镜观察表明，感染的中肠细胞和脂肪体细胞有病毒粒子复制。
hIL-12的表达和纯化采用10％SDS-PAGE、银染法和Western Blot鉴定。根据R&D公司ECLWestern Bolot操作手册进行。结果表明，AcNPV-hIL12感染的Sf9细胞浓缩上清和感染的银纹夜蛾幼虫血淋巴，有特异性31KDa和40KDa二种蛋白的表达。采用HPLC法检测hIL-12纯度。
hIL-12 ELISA检测，根据R&D公司操作手册进行。
具体实施例方式
hIL-12的表达及纯化(1)hIL-12mAb Sepharose CL-4B的制备根据March等(1974，Anal.Biolchem.60149-152)方法改进。
用400ml dd H2O洗涤100ml Sepharose CL-4B，将100ml Sepharose CL-4B和300ml 2mol/L Na2CO3混合，搅拌。将5ml乙腈加入10g溴化氰中，溶解，然后将溴化氰溶液转移至Sepharose CL-4B中。将混合物转移至一漏斗，快速、温和地用400ml 0.1mol/L NaHCO3(pH9.5)、400ml dd H2O和400ml 0.2mol/L NaHCO3(pH8.5)洗涤混合物。将150mg hIL-12mAb溶于100ml 0.2mol/L NaHCO3(pH8.5)中。将溴化氰活化的Sepharose CL-4B转移至含hIL-12mAb溶液的瓶中，4℃混合20h，过滤收集hIL-12mAb-Sepharose CL-4B胶，用160ml 1mol/L盐酸、乙醇胺(pH8.0)悬浮，混合6h。分别用800ml 0.1mol/L NaOAc(pH4.0)-0.5mol/LNaCl，800ml 2mol/L尿素-0.5mol/L NaCl、800ml 0.1mol/L NaHCO3(pH10.0)-0.5mol/L NaCl和800ml dd H2O洗胶。将制备好的胶悬浮于200ml 50mmol/LTris·HCl(pH7.9)-1mol/L EDTA-0.02％叠氮钠溶液，4℃保存。
(2)hIL-12纯化重组杆状病毒Ac-hIL12感染Sf9细胞，5天后，收集感染液，3000rpm离心15min，去细胞沉淀，上清100,000g离心30min收集上清，弃沉淀，用100ml上清上样。具体操作如下装3ml hIL-12mAb Sepharose CL-4B介质于层析柱中，用60ml Buffer(50mmol/L Tris·Cl pH7.9-0.5mol/L EDTA-50mmol/L NaCl)平衡，将100ml细胞上清上样，然后用60ml Buffer(50mmol/L Tris·Cl pH7.9-0.5mmol/L EDTA-50mmol/L NaCl)洗柱。在室温下，用10ml lAC洗脱缓冲液(50mmol/L Tris·HCl pH7.9-0.5mmol/L EDTA-30％丙烯二醇-0.75mol/L NaCl)洗脱，分部收集各组分于管中，用10％SDS-PAGE，银染法和Western blot鉴定。
(3)hIL-12表达和纯化的鉴定采用10％SDS-PAGE，银染法和Western blot鉴定hIL-12表达和纯化。结果表明，经过hIL-12mAb Sepharose CL-4B柱亲和层析纯化，10％SDS-PAGE，银染检测有二条带31kDa和40kDa。将10％SDS-PAGE转膜处理，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，然后按ECL手册进行，表明浓缩细胞上清中有31kDa和40kDa二种蛋白的表达。
AcNPV-hIL12经血腔注射感染银纹夜蛾4龄幼虫。采用亲和层析法，从感染幼虫血淋巴中纯化获得hIL-12。纯化hIL-12样品经10％SDS-PAGE，银染法和Western blot检测，有二条特异带31Kda和40Kda。
(4)亲和层析纯化的hIL-12蛋白纯度鉴定采用HPLC法，hIL-12纯度≥98％。
(5)hIL-12 ELISA检测重组杆状病毒AcNPV-hIL12经血腔感染银纹夜蛾4龄幼虫96h后收获血淋巴。AcNPV-hIL12感染Sf9细胞，96h后收获细胞上清。采用ELISA法，用hIL-12mAb ELISA检测试剂盒检测。按R&D公司操作手册进行。结果表明，细胞培养中hIL-12的含量为17.8μg/106细胞，银纹夜蛾幼虫血淋巴中hIL-12的含量为200-300mg/L。采用亲和层析法，用hIL-12-mAb-Sepharose柱亲和层析纯化，纯化效率为62％。
(6)hIL-12生物活性的测定①外周血单个核细胞分离将静脉血5ml，加入事先准备的0.5ml 500单位每毫升肝素抗凝，再入等量Hanks液将血液稀释。缓慢将用Hanks稀释过的血液加入装有淋巴分离液试管中，使其与分离液形成一界面，两者不能混合，轻轻置于4℃水平离心机中，1500rpm，离心20分钟分离淋巴母细胞，轻轻取出试管，小心吸出白色细胞层放入管中，加入含小牛血清培养液稀释成2.0×106/ml细胞悬液。
②hIL-12生物活性测定根据Mosmann方法进行。
A.hIL-12对PBMC的刺激增殖用终浓度0.025mg/ml PHA-P作用经分离人外周血单个核细胞(PBMC)48h，调节细胞浓度2×105/ml，96孔细胞培养板每孔加入100μl，分别加入纯化的hIL-12样品，同时设不同浓度的hIL-12标准品作为对照。用MTT法检测hIL-12的生物活性。
B.hIL-12诱生NK细胞对K562细胞的杀伤活性测定调节人外周血单个核细胞(PBMC)浓度为1.5×106/ml，加入纯化的hIL-12样品标准品，终浓度为10ng/ml。培养7d诱生的NK细胞作为效应细胞，人红白血病细胞系K562细胞作为靶细胞，设定效靶比为50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1、3.125∶1，并设效应细胞、靶细胞对照孔，分设3个平行孔。用MTT法测定杀伤活性。
(7)hIL-12生物活性测定纯化的hIL-12样品与hIL-12标准品，对经PHA刺激的PBMC具有明显的增殖活性。当hIL-12浓度为10、100、1,000、10,000、100,000pg/ml时，PBMC增殖效率随hIL-12浓度升高而增高；当hIL-12浓度为100,000pg/ml时，PBMC增殖效率略有降低。纯化的hIL-12样品与hIL-12标准品诱生NK细胞，该诱生细胞对K562细胞具有明显的杀伤活性，当效靶比为50∶1、25∶1、12.5∶l、6.25∶1、3.125∶1时，杀伤活性随效靶比降低而下降。所获得的人白细胞介素-12适用于肿瘤、细菌、病毒和寄生虫等感染性养病的治疗。
权利要求
1.一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，其特征在于利用含hIL-12基因的重组昆虫病毒株AcNPV-hIL12经血腔感染银纹夜蛾，表达和纯化人白细胞介素-12。
2.根据权利要求1所述的一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，其特征在于通过血腔注射AcNPV-hIL12感染银纹夜蛾幼虫，表达重组人白细胞介素-12。
3.一种实现权利要求1或2所述的一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的纯化方法，其特征在于利用将人白细胞介素-12mAb偶联于Sepharose CL-4B上，通过亲和层析法纯化人白细胞介素-12。
全文摘要
本发明公开了一种人白细胞介素－12在银纹夜蛾中的表达及其纯化的方法，其特征在于通过血腔注射AcNPV－hIL12感染银纹夜蛾幼虫，96h后，用75％酒精消毒银纹夜蛾幼虫，消毒针刺破头部，收集血淋巴于灭菌管中。重组杆状病毒AcNPV－hIL12经血腔感染银纹夜蛾幼虫96h，血淋巴经100,000g离心30min，收集上清。将人白细胞介素－12mAb偶联于Sepharose CL－4B上，采用hIL－12mAb Sepharose CL－4B柱免疫亲和层析纯化hIL－12。本发明方法操作方便，所获得的人白细胞介素－12适用于肿瘤、细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病的治疗。
文档编号C07K14/435GK1417340SQ01133658
公开日2003年5月14日 申请日期2001年11月8日 优先权日2001年11月8日
发明者孟小林, 徐进平, 王健, 鲁伟 申请人:武汉大学