酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属医药领域，涉及酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的药物中的应用。本发明经试验证实，所述的酵母来源的葡聚糖可以调节小鼠脾脏细胞中细胞因子表达，上调IL-12、IL-1、TNF表达，下调抑制性细胞因子IL-10表达；能促进HBV?C57BL/6J-TgN转基因小鼠mDC的成熟，上调mDC表面协同刺激分子CD80、CD86表；能够明显增强HBV感染患者外周血来源PBMC?IFN-γ的生成。所述的酵母来源葡聚糖可以制备治疗乙肝病毒感染的药物，尤其是制备降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的药物，以及作为免疫增强剂辅助HBV感染的治疗。
【专利说明】酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属医药领域，涉及葡聚糖新的药用用途，具体涉及酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了酵母来源的葡聚糖(glucan)具有二重螺旋的超微结构，通过与人类单核细胞(monocyte)、巨卩遼细胞(macrophage)、中性粒细胞(neutrophilegranulocyte)、树突状细胞(dendritic cell, DC)、自然杀伤细胞(natural killercell, NK cell)等免疫细胞膜表面的CR3、LacCer、Dectin-l、TLR2等受体结合发挥识别、吞噬等生理作用，刺激机体产生抗体，分泌TNF-α、白介素和干扰素等多种细胞因子、调节免疫细胞间的相互作用，加速和放大宿主免疫反应。
[0003]研究显示，葡聚糖具有强大的抗肿瘤作用，它在解除肿瘤毒素对机体免疫抑制的同时，能快速激活机体自身的免疫监视和识别机制，发现和区分潜在的肿瘤细胞，使吞噬细胞直接杀灭肿瘤细胞。Macrogard、PGG> Glomrellan等葡聚糖类的抗肿瘤药已先后研发并应用于临床治疗。同时，有报道公开，葡聚糖还作为免疫增强剂与抗肿瘤单克隆抗体联合应用，发挥抗肿瘤效应。
[0004]除此之外，葡聚糖还具有增强机体抗辐射能力，对化学疗法起到协同增强的效果，可以作为治疗辐射损伤佐剂，以及，葡聚糖还具有有效抑制血清中胆固醇的升高，降低胆固醇和血脂的作用。但尚未见有葡聚糖在治疗病毒感染领域的应用的报道。
[0005]据报道，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎已成为严重危害人类健康的疾病。全球约有3.5亿慢性乙型肝炎患者，中国携带乙型肝炎病毒人数约8%左右，乙肝病毒携带者已超过1.2亿人，发病人数超过3000万人，慢性乙型肝炎患者病程还会进一步发展成为肝硬化和肝癌。实践显示，尽管大规模的计划内疫苗接种已大大降低新生儿感染乙型肝炎病毒的风险，但是对已经感染乙型肝炎病毒的人群而言，仍然缺乏十分有效的药物以清除病毒。目前临床上使用α干扰素和核苷酸类似物抑制乙型肝炎病毒复制，但其中仅有不到30%的患者对干扰素治疗有较好的应答。而且，长期的干扰素治疗有较强的副作用，也给患者及其家庭带了沉重的经济负担，而核苷类似物治疗则容易产生病毒的耐药性。研究认为，慢性乙肝病人相较急性乙肝病人，其不能有效清除HBV的原因与其机体免疫系统耐受有关。为此，寻找到一种可有效提高机体免疫水平，进而打破机体免疫耐受、激活特异性针对HBV的天然免疫及适应性免疫应答的方法具重要的临床意义。本申请拟研究葡聚糖对HBV感染的免疫调节作用，进一步提供酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供葡聚糖新的药用用途，具体涉及酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的药物中的应用。
[0007]本发明采用酵母来源的葡聚糖在HBV转基因小鼠细胞和临床HBV感染患者外周血单个核细胞(PBMC)中测试了酵母来源的葡聚糖的免疫调节作用，分别获得所述葡聚糖调节小鼠脾脏细胞细胞因子表达、上调mDC表面⑶80表达、调mDC表面⑶86表达以及对mDC的形态改变的影响和葡聚糖诱生HBV患者PBMC IFN- Y生成的影响结果，实验结果显示，所述的酵母来源葡聚糖可以调节小鼠脾脏细胞中细胞因子表达，上调IL-12、IL-U TNF表达，下调抑制性细胞因子IL-10表达；所述的酵母来源的葡聚糖能促进HBVC57BL/6J-TgN转基因小鼠mDC的成熟，上调mDC表面协同刺激分子CD80、CD86表达，提示葡聚糖可以促进mDC成熟，且葡聚糖这种上调作用对DC的活化呈剂量依赖方式；所述的酵母来源的葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能够明显增强HBV感染患者外周血来源PBMC IFN-Y的生成。
[0008]本发明经试验证实，所述的酵母来源的葡聚糖可以与机体免疫细胞受体结合，迅速激活DC细胞、巨噬细胞、NK细胞，并促进B淋巴细胞产生抗体，T淋巴细胞和巨噬细胞分泌TNF- α、白介素和IFN等具有免疫调节功能的细胞因子；
[0009]本发明所述的酵母来源葡聚糖可以制备治疗乙肝病毒感染的药物，尤其是制备降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的药物。
[0010]本发明所述的酵母来源的葡聚糖还可作为免疫增强剂辅助HBV感染的治疗。
[0011]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明的葡聚糖调节小鼠脾脏细胞细胞因子表达。
[0013]图2Α是本发明的葡聚糖上调mDC表面⑶80表达；
[0014]2B是本发明的葡聚糖上调mDC表面⑶86表达；
[0015]2C是本发明的显微镜下葡聚糖作用下，mDC的形态改变。
[0016]图3是本发明的葡聚糖诱生HBV患者PBMC IFN- Y生成。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018](一 )细胞培养、临床标本干预和指标检测方案
[0019]分离HBVC57BL/6J_TgN转基因小鼠(该小鼠从美国Jackson实验室引进，含有HBVS，PreSland PreS2基因，可在小鼠血清表达HBsAg)单个脾细胞，DMEM培养液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02饱和水蒸气环境下37°C恒温培养。酵母来源葡聚糖250 μ g/ml刺激48h，定量PCR检测细胞因子表达。
[0020]按常规方法分离HBVC57BL/6J-TgN转基因小鼠骨髓以100ng/mlIL_4和IOOng/ml GM-CSF诱导分化DC 8天，DMEM培养液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02饱和水蒸气环境下37°C恒温培养。取对数生长期细胞以1*106/孔密度铺12孔板，酵母来源葡聚糖取250ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg(CHO 细胞来源,华北制药集团提供)、500ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 来源)、I μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 来源)、250 μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 来源)4个浓度梯度，对照组仅给2 μ g/ml HBsAg培养基；每组均设3个复孔；刺激48h后收集细胞检测mDC表面协同刺激分子⑶11C、⑶80、⑶86表达。
[0021]取离体的临床HBV感染患者外周血分离PBMC，以1*106/孔密度铺12孔板加HBVoverlap肽、HBV overlap肽+葡聚糖,正常对照组仅给空白培养基；每组均设3个复孔；刺激10天。
[0022]( 二)试验结果
[0023]I，本发明酵母来源葡聚糖(250 μ g/ml，刺激48hr )可以调节小鼠脾脏细胞中细胞因子表达，上调IL-12、IL-UTNF表达，下调抑制性细胞因子IL-10表达(如图1所示)。
[0024]2，本发明酵母来源的葡聚糖能促进HBV C57BL/6J_TgN转基因小鼠mDC的成熟，上调mDC表面协同刺激分子CD80、CD86表达，提示葡聚糖可以促进mDC成熟，且葡聚糖的上调作用对DC的活化呈剂量依赖方式(如图2A、2B所示)。
[0025]3，本发明的酵母来源的 葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能明显增强HBV感染患者外周血来源PBMC IFN- Y的生成(如图3所示)。
【权利要求】
1.酵母来源葡聚糖在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用。
2.酵母来源葡聚糖在制备降低或消除乙型肝炎病毒血清表面抗原的药物中的应用。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血清表面抗原是慢性感染患者的血清表面抗原。
4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母来源葡聚糖上调IL-12、IL-1、TNF表达，下调抑制性细胞因子IL-1O表达。
5.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母来源葡聚糖促进HBVC57BL/6J-TgN转基因小鼠mDC的成熟，上调mDC表面协同刺激分子CD80、CD86表达。
6.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母来源的葡聚糖增强HBV感染患者外周血来源PBMC IFN-Y的生成。
7.酵母来源葡聚糖在制备`治疗乙肝病毒感染的免疫增强剂中的应用。
【文档编号】A61P37/04GK103479663SQ201210189690
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月11日 优先权日:2012年6月11日
【发明者】袁正宏, 羽晓瑜, 周晓辉, 任广旭 申请人:上海市公共卫生临床中心