人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
【专利摘要】本发明提供了人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法。具体而言，本发明的人白细胞介素-12的编码基因包含(a)编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ?ID?NO:9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ?ID?NO:10或其互补核苷酸序列；或者(b)编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ?ID?NO:21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ?ID?NO:22或其互补核苷酸序列。本发明的核苷酸序列能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定高效表达。
【专利说明】人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
[0001]本申请是分案申请，其原申请的中国国家申请号为201210345021.8，申请日为 2012年9月17日，发明名称为“人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法”。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及人白细胞介素-12 (IL-12)的编码基因、真核宿主细胞和表达方法，具体而言，本发明涉及对人白细胞介素-12的编码基因进行优化，从而能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)中稳定高效表达， 尤其是在无血清条件下稳定闻效表达。 【背景技术】
[0003]白细胞介素-12 (IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等发现，起初命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，1991年统一命名为白介素-12。
[0004]白细胞介素-12是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为 35kDa (P35亚基)，另一条为40kDa (P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生，P35和P40 单独存在时均无任何IL-12的生物活性。
[0005]IL-12具有调节和参与免疫应答细胞的活性，刺激NK细胞和T细胞产生干扰素-伽玛(IFN-Y )，促进Thl细胞的分化，是连接固有免疫和获得性免疫的核心因子。同时，
[0006]IL-12可促进造血功能的恢复，用于机体造血功能的降低导致的疾病，如急性放射病、放射性治疗、化学治疗等。另外，IL-12还具有抗肿瘤，抗病毒的效果，具有良好的临床应用前景。
[0007]在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。
[0008]以下表1列出了现有技术相关技术的培养条件和最高产量。
[0009]
【权利要求】
1.人白细胞介素-12的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含: 编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID N0:21以及编码P40亚基的SEQ ID N0:22。
3.—种表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含: 具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的第二表达载体。
4.如权利要求3所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO: 21的第一表达载体和具有编码P40亚基的SEQ ID NO: 22的第二表达载体。
5.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选为CH0-DG44或CH0-3E7细胞。
6.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述第一表达载体为pGN-35质粒。
7.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述第二表达载体为PCDNA3.1 质粒。
8.一种人白细胞介素-12的表达方法，其特征在于，所述方法包括: 分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的PCDNA3.1 质粒； 然后用所述PGN-35质粒和所述pCDNA3.1质粒共转染真核宿主细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，更优选为CH0-DG44或CH0-3E7细胞。
【文档编号】C12N15/24GK103555734SQ201310507082
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年9月17日 优先权日:2012年9月17日
【发明者】赵毅, 李友海, 章方良, 柳振宇 申请人:青岛康立泰药业有限公司