专利名称：乳酸菌细胞微包囊培养方法及其生产的发酵剂的制作方法
技术领域：
本发明为乳酸菌细胞微包囊培养方法及其生产的发酵剂，属于一种新型的乳酸菌细胞包囊技术并将包囊细胞作为发酵剂应用于酸奶生产，属于生物工程技术领域，是一种新型的乳品发酵剂生产技术。
二、技术背景近十年来，我国奶业一直保持较快的发展速度，正成为农业乃至国民经济的支柱产业。酸奶在乳品市场中的销售比例不断上升。2000年，我国酸奶销售总量为30.7万吨，比1995年增长了74％；2002年，我国的酸奶产量又上升到63万吨。这些数字说明，酸奶的发展速度是超常规的，酸奶的市场空间十分广阔。
目前用于酸奶生产的发酵剂有两类一类传统的继代式发酵剂，一类为直投式发酵剂。继代式发酵剂含菌量少(107-108cfu/ml)不能直接用于生产，需经母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂的扩大繁殖才能用于酸奶发酵，发酵剂的制作过程比较复杂，无菌要求高，另外还存在菌种使用时间短，保存传代困难，容易污染等问题。为了解决这些问题，国外从90年代末，开发出直投式酸奶发酵剂，如丹麦的汉森公司，法国的罗地亚公司。直投式发酵剂的使用，简化了生产工艺，省去了菌种车间，避免了各厂家微生物技术力量不足而造成的菌种质量不佳的问题，但使用直投式发酵剂成本很高，目前国内还没有直投式发酵剂的生产，在一些高档酸奶中所使用的直投式发酵剂全部从国外进口。研制开发具有自主知识产权的新型酸奶发酵剂生产技术，克服了上述两类发酵剂的不足，即简化了生产工艺，又降低了生产成本，显得尤为重要。
发明内容
技术问题 本发明的目的是针对我国酸奶发酵中用继代式发酵剂存在的问题及直投式发酵剂价格昂贵，所研制开发的一种新型的发酵剂生产方法，提供乳酸菌细胞微包囊培养方法及其生产的发酵剂，克服了上述两类发酵剂的不足，即简化了生产工艺，又降低了生产成本。
技术方案 本发明所提供的提供乳酸菌细胞微包囊培养方法——液芯包囊乳酸菌的方法，包括将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％(M/V下文同)的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，然后将活化的菌种接种到乳清或MRS培养基中，30-44℃保温18小时，5000rpm，10min离心，弃去上清液，将菌体悬浮于0.10-1.0％无菌的含有0.5-2.5％氯化钙胶体溶液中，所用胶体可以是瓜尔豆胶，变性淀粉，黄原胶，羧甲基纤维素或卡拉胶，通过胶囊发生器，滴入无菌的含0.5％的海藻酸钠、0.1％吐温80溶液中，制作过程150-200rpm不断搅拌，所得胶囊用无菌水冲洗后，放入1％的氯化钙溶液中硬化1小时，过滤，弃去氯化钙溶液，用无菌水冲洗后，将胶囊放入0.3％的壳聚糖溶液中，30min后取出，用无菌水冲洗，将胶囊置于乳清培养基中，37℃保温18小时，过滤，滤液可收集菌体用于下批胶囊的生产，将胶囊取出悬浮于生理盐水(含5％的甘油)中，4℃保藏；或者将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，然后将活化的菌种接种到乳清(或MRS)培养基中，30-44℃保温18小时，5000rpm，10min离心，弃去上清液，将菌体悬浮于0.5-5％的无菌的海藻酸钠；卡拉胶+刺槐豆胶胶体溶液中，滴入含0.1-0.8％吐温80植物油中，100-10000rpm搅拌，5-30分钟后，加入0.05M-0.5M的氯化钙或氯化钾溶液，形成胶粒后，倾去上层油层，下层水层低速离心，并用生理盐水清洗后，将胶囊取出悬浮于含5％甘油的生理盐水中，4℃保藏。
或者将上述方法制得的胶囊，通过冷冻干燥、真空干燥或普通低温30-50℃干燥制得干胶囊。用上述乳酸菌细胞微包囊培养方法制得的乳酸菌发酵剂，包括单菌胶囊(胶囊中含单种乳酸菌)、混菌胶囊(胶囊中含多种乳酸菌)、不同菌的单菌胶囊混合、单菌与混菌胶囊的复配、混菌胶囊及复配乳酸菌发酵剂，广泛应用于乳制品发酵(如含菌奶、酸奶、干酪、含益生菌奶等)，豆奶发酵，蔬菜发酵，肉品发酵，葡萄酒降酸，及饲料发酵。
有益效果 本发明利用生物工程技术，用液芯包囊乳酸菌作为酸奶发酵剂，克服了现有技术中两类发酵剂的不足，即简化了生产工艺，又降低了生产成本，必定有良好的社会效益和经济效益。
本发明的主要优点和积极效果如下1.发酵剂的生产成本低，不需高速冷冻离心(或超滤)，冷冻干燥工序，只需经普通过滤就可分离菌体。
2.乳酸菌细胞包囊后，可以防止嗜菌体感染，从而保证发酵成功；3.包囊化乳酸菌发酵剂，在连续生产过程中，可以基本保持球菌和杆菌的比例，确保连续生产酸奶的风味基本一致。
具体实施例方式
方法1将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，然后将活化的菌种接种到乳清培养基中，30-44℃保温18小时，5000rpm，10min离心，弃去上清液，将菌体悬浮于0.10-1.0％无菌的含有0.5-2.5％氯化钙胶体溶液中，所用胶体可以是瓜尔豆胶，变性淀粉，黄原胶，羧甲基纤维素或卡拉胶，通过胶囊发生器，滴入无菌的0.5％的海藻酸钠溶液(含0.1％吐温80)中，制作过程不断搅拌(150-200rpm)，所得胶囊用无菌水冲洗后，放入1％的氯化钙溶液(无菌)中硬化1小时，过滤，弃去氯化钙溶液，用无菌水冲洗后，将胶囊放入0.3％的壳聚糖溶液中，30min后取出，用无菌水冲洗，将胶囊置于乳清培养基中，37℃保温18小时，过滤，滤液可收集菌体用于下批胶囊的生产，将胶囊取出悬浮于含5％甘油的生理盐水中，4℃保藏；方法2将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，接种到乳清(或MRS)培养基中，30-44℃保温18小时，离心(5000rpm，10min)，弃去上清液，将菌体悬浮于0.5-5％的无菌的胶体溶液(海藻酸钠；卡拉胶+刺槐豆胶；)中，滴入植物油(含0.1-0.8％吐温80)中，搅拌(100-10000rpm)，搅拌速度根据所需胶囊的直径而定，5-30分钟后，加入0.05M-0.5M的氯化钙或氯化钾溶液，形成胶粒后，倾去上层油层，下层水层低速离心，并用生理盐水清洗后，将胶囊取出悬浮于含5％甘油的生理盐水中，4℃保藏。
方法3将方法1和2制得的胶囊，通过冷冻干燥、真空干燥或普通低温30-50℃干燥制得干胶囊。
用上述乳酸菌细胞微包囊培养方法制得的乳酸菌发酵剂，包括单菌胶囊(胶囊中含单种乳酸菌)、混菌胶囊(胶囊中含多种乳酸菌)、不同菌的单菌胶囊混合、单菌与混菌胶囊的复配、混菌胶囊及复配乳酸菌发酵剂，广泛应用于乳制品发酵(如含菌奶、酸奶、干酪、含益生菌奶等)，豆奶发酵，蔬菜发酵，肉品发酵，葡萄酒降酸，及饲料发酵。上述乳酸菌作为发酵剂应用实施例实施例1.发酵乳制品生产(如含菌奶、酸奶、干酪等)将方法1制得的包囊嗜热链球菌、保加利亚乳杆、干酪乳杆菌、乳酪链球菌乳酸菌单种或混合益生菌的微胶囊发酵剂按罐装牛奶的5-50％的量装入发酵罐(或固定化装置中)，20-45℃恒温发酵，当罐中牛奶PH达到5.0-6.5时，连续泵入巴氏杀菌奶，同时从发酵罐(或固定化装置)中流出含菌奶，维持发酵罐中牛奶的液位及PH。含菌奶通过调配或直接无菌灌装，生产调味型、果肉型、原味型含菌奶产品，或直接灌装后，置于40-44℃发酵，生产凝固型酸奶；含菌奶流入下一级发酵罐，继续发酵，生产各种搅拌型酸奶；含菌奶可通过调整酸度，添加氯化钙、色素、凝乳酶等生产干酪。一般一次投入的发酵剂可连续使用7-20天。在连续使用过程中，球、杆菌比例基本保持不变(如酸奶生产时为1∶1)，成本比直透式发酵剂降低50％，同时避免了使用继代式发酵剂质量不稳定的缺陷。
实施例2.含益生菌乳制品的生产益生菌是指对人和动物机体有益的菌。它们通过改善肠道微生态平衡，控制肠道感染，降低血清中胆固醇的水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。发酵乳制品中的益生菌主要包刮乳杆菌如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、德氏保加利亚乳杆菌(L.dellrueckii subsp.bulgraticus)等；革兰氏阳性球菌如乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactisssp.cremoris)、嗜热链球菌(S.thermophilus)、屎肠球菌(E.faecium)、中间链球菌(S.intermedius)、丁二酮链球菌(S.diacetylactis)；以及双歧杆菌如两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。
将含单种或混合益生菌的胶囊混入乳酸菌发酵剂中生产含益生菌的发酵乳制品；将含单种或混合益生菌的微胶囊加入实施例1的含菌奶中，或与酸奶发酵剂一起加入巴氏杀菌奶中，生产含活的益生菌的酸奶制品。
实施例3.泡菜生产将按方法1生产的包囊的植物乳杆菌、明串珠菌、乳脂链球菌单种或混合益生菌的微胶囊乳酸菌发酵剂加入经预处理的蔬菜中，再加入适量的盐、糖等辅料，在25-35℃的温度发酵5-7天，泡菜液的PH为3.5-4.0时，取出，调味后，包装。
用这种方法生产的泡菜，发酵时间比传统的自然发酵缩短了3天，产生亚硝酸盐的最高含量由49.27mg/kg减小到3.35mg/kg。
实例4.发酵肉制品的生产将包囊的米酒乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌单种或混合益生菌的微胶囊发酵剂与鲜肉及各种辅料混合，经20-30℃密封发酵25天后，产品经真空包装，常温下贮藏1年。例按下列配方进行酸肉的生产鲜肉100kg 炒米 10kg白砂糖 2kg乳清粉 8kg 食盐 6kg茶叶1kg 甜酒酿 6kg发酵剂 5kg 香料 0.5kg该产品经真空包装，常温下贮藏1年，产品中挥发性风味物质明显上升，各类微生物数量大幅下降(如肠细菌从6.5×104cfu/g下降到＜100cfu/g)，产品的适口性良好，这降低了该类产品的贮藏、运输成本，有较大的经济效益。
实例5.饲料发酵将方法2制得的包囊植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌单种或混合益生菌的微胶囊乳酸菌发酵剂加入一些豆粕`麦麸`啤酒糟`饴糖糟和白酒糟等食品残渣中培养，可用来生产富含蛋白质的微生态调节剂，这些食品残渣既便宜又容易得到，所以用它们生产微生态调节剂有着美好的前景。例如，以豆粕为主要原料，经微囊化的植物乳杆菌、假丝酵母混菌发酵，粗蛋白含量由原来的42％上升到58％。注以上实施例所用乳酸菌都是目前生产上常规菌种，公众可以得到。
权利要求
1.乳酸菌细胞微包囊培养方法，即液芯包囊乳酸菌的方法，包括将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％(M/V，下文同)的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，然后将活化的菌种接种到乳清或MRS培养基中，30-44℃保温18小时，5000rpm，10min离心，弃去上清液，将菌体悬浮于0.10-1.0％无菌的含有0.5-2.5％氯化钙胶体溶液中，所用胶体可以是瓜尔豆胶，变性淀粉，黄原胶，羧甲基纤维素或卡拉胶，通过胶囊发生器，滴入无菌的含0.5％的海藻酸钠、0.1％吐温80溶液中，制作过程150-200rpm不断搅拌，所得胶囊用无菌水冲洗后，放入1％的氯化钙溶液中硬化1小时，过滤，弃去氯化钙溶液，用无菌水冲洗后，将胶囊放入0.3％的壳聚糖溶液中，30min后取出，用无菌水冲洗，将胶囊置于乳清培养基中，37℃保温18小时，过滤，滤液可收集菌体用于下批胶囊的生产，将胶囊取出悬浮于含5％甘油的生理盐水中，4℃保藏；或者将冷冻干燥的乳酸菌接种到6-14％的无菌脱脂乳中，30-44℃保温至凝乳，或用MRS培养基将菌种活化两次，然后将活化的菌种接种到乳清或MRS培养基中，30-44℃保温18小时，5000rpm，10min离心，弃去上清液，将菌体悬浮于0.5-5％的无菌的海藻酸钠；卡拉胶+刺槐豆胶胶体溶液中，滴入含0.1-0.8％吐温80植物油中，100-10000rpm搅拌，5-30分钟后，加入0.05M-0.5M的氯化钙或氯化钾溶液，形成胶粒后，倾去上层油层，下层水层低速离心，并用生理盐水清洗后，将胶囊取出悬浮于含5％甘油的生理盐水中，4℃保藏。
2.根据权利要求1所述乳酸菌细胞微包囊培养方法，其特征在于，将上述方法制得的胶囊，通过冷冻干燥、真空干燥或普通低温30-50℃干燥制得干胶囊。
3.用权利要求1或2所述乳酸菌细胞微包囊培养方法制得的乳酸菌发酵剂，包括单菌胶囊、混菌胶囊、不同菌的单菌胶囊混合、单菌与混菌胶囊的复配、混菌胶囊及复配乳酸菌发酵剂。
全文摘要
本发明提供了乳酸菌细胞微包囊培养方法及其生产的发酵剂，用液心包囊乳酸菌制备方法制得的含菌胶囊，经配制成乳酸菌发酵剂，可广泛应用于乳品发酵(如含菌牛奶、酸奶、干酪、低乳糖牛奶、生物奶等)，蔬菜及果蔬汁发酵，肉品发酵(如发酵香肠、酸肉等)，饲料发酵，果酒生产中的降酸。是一种可用于连续接种或直投接种、低成本、高效率、使用方便的发酵剂。
文档编号C12N11/00GK1487078SQ0313232
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月14日 优先权日2003年8月14日
发明者董明盛, 周剑忠, 陈晓红, 姜梅 申请人:南京农业大学