专利名称：毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构及其应用，属真菌学和生物农药植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类就达70多种，为害3000多种植物，每年造成巨大的损失。我国根结线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等经济作物，成为发展这些作物的重要限制因子。据不完全统计，2001年全国烟草根结线虫发病面积已达55万公顷，直接经济损失5亿多元。仅云南省发病面积就达2.7万公倾，直接经济损失1亿元，间接损失更为严重。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。长期以来，线虫防治主要依赖于化学农药。随着科学技术的进步，研究发现多数化学杀线虫剂除了具高毒性杀伤天敌，破坏生态平衡及危害人体健康外，对地下水污染严重。美国、欧洲等发达国家已逐步限制化学杀线虫剂的使用，线虫生防引起了各国科学家前所未有的关注。
发明采用的真菌是毛头鬼伞Coprinus comatus LHA-7，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2003年5月26日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0932。
毛头鬼伞子实体菌盖4-6×6-11cm，未成熟时为圆柱状的，白色，成熟时扩展为钟形且边缘翻卷，很快液化如墨汁；菌盖中心呈褐色，有蓬松的毛发状鳞片，成熟菌盖边缘有条纹。菌褶与菌柄分离，在成熟过程中颜色由白色变为桃色最后变为黑色，后期与菌盖边缘一同自溶为墨汁状。菌柄圆柱形，7-24.5×1-1.7cm，沿顶端方向逐渐变细；光滑，白色；易于与菌盖分离；中空或实心。菌肉质地软，白色。菌环白色，后期可上下移动，易脱落。菌丝为典型的担子菌菌丝，有明显的锁状联合。孢子小大为10-17×7-9μm，黑色，椭圆形，光滑，孢子印黑色。
本项发明主要分为两个部份，一个是发现确定棘状小球结构，另一个就是对产生了棘状小球的菌丝进行研究，确定其杀线虫功能。一、确定棘状小球结构采集新鲜的毛头鬼伞子实体，用PDA琼脂培养基平板(培养皿直径为9cm)进行组织分离，24℃下培养，获得一批菌株，从中筛选出一株性状好的菌株，编号为LHA-7。
取直径9cm培养皿灭菌后倒入15ml的PDA培养基，将毛头鬼伞LHA-7接种到培养基平板上，于24℃下培养。2天后开始每天用光学显微镜进行菌丝体形态研究。2天后发现菌丝上产生明显的棘状小球结构，然后随时间延长，棘状小球不断增多，5天后达到高峰。通过电子显微镜对棘状小球进行形态学研究，确定棘状小球是担子菌上发现的一种未见报道的结构。但研究同时也表明，将毛头鬼伞LHA-7菌株用PDA培养基液体发酵时，不产生棘状小球。
最后将产生了棘状小球的菌丝体按常规食用菌栽培方法进行栽培，获得了出发菌的毛头鬼伞子实体，证明产生棘状小球的菌株的确来源于毛头鬼伞。二、棘状小球菌丝体的杀线虫功能测定为了确定棘状小球的杀线虫功能，分别进行了毛头鬼伞LHA-7菌株具有棘状小球菌丝体杀线虫活性测定；液体发酵不产生棘状小球的菌丝体杀线虫活性测定。
本发明对线虫的活性测定1、制备试验用制剂(1)含棘状小球的菌丝体制剂用直径9cm培养皿灭菌后倒入15ml的PDA琼脂培养基，在培养基平板上接种毛头鬼伞LHA-7，24℃下培养箱恒温培养9天，此时毛头鬼伞LHA-7菌丝辅满平板，并已大量产生棘状小球。
(2)不含棘状小球的菌丝体对照用250ml三角瓶加入PDA液体培养基100ml，灭菌后接入毛头鬼伞LHA-7，24℃下摇床(200rpm)培养9天，此时已产生大量菌丝，但不产生棘状小球。将发酵液过滤后，把滤液和菌丝体分别放入灭菌9cm培养皿中备用。
2、制备试验用线虫(1)Panagrellus redivivus线虫的培养将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。
(2)花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)的培养将温室培养的带有花生根结线虫的蕃茄根用无菌水洗净，用解剖针挑取根结线虫的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml离心管中依次用4ml无菌水(三次)、1ml无菌青-链霉素双抗溶液(浓度为60μg/ml)、3ml0.1％的NaClO溶液洗涤和消毒，每一步骤均通过短暂离心(8000转30秒)除去上清液。洗涤好的虫卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小时，二龄幼虫用移液器收集于1.5ml离心管，通过短暂离心(5000转30秒)富集备用。
3、试验方法按5000条线虫/培养皿的比例，将线虫加入到含棘状小球的菌丝体和对照菌丝体培养皿中，恒温24℃培养。定时在解剖镜下观察计数，随机选择5个视野，分别记录不动和活动的线虫的数目，计算出杀灭率。并对杀死的线虫进行电子显微镜观察，分析其毒杀机理。
整个实验设三个平行并重复两次。
4、结果表1 毛头鬼伞LHA-7菌丝体的杀线虫活性测定
死亡率＝杀死线虫数/线虫总数结果表明，毛头鬼伞LHA-7菌株培养中凡是产生了本发明棘状小球结构的菌丝体，对花生根结线虫和P.redivivus线虫都有很好的杀线虫活性，8小时线虫死亡率分别达95.8％和95％，而相同菌株在相同培养基上，经液体发酵后获得的不产棘状小球的菌丝体，其发酵液和菌丝体的杀线虫活性都极低，8小时线虫死亡率仅达0.8％和1％，对线虫基本没有毒杀作用。结果充分表明了本发明对花生根结线虫和P.redivivus线虫具极好的毒杀作用，从电子显微镜照片(图4)观察也清楚的看到，带有棘状小球的菌丝体在短时间内杀死线虫。
本发明毛头鬼伞LHA-7菌株是一类很好培养的真菌，其产生棘状小球结构后对线虫具极强的毒杀作用，而产生棘状小球结构只是在菌丝培养期间，这就决定了培养时间短，成本低，具有很好的开发前景。
图2显示布满了棘状小刺的小球。
图3显示纯化的棘状小球。
图4显示被带棘状小球的菌丝体杀死的P.redivivus线虫的扫描电镜图。
实施例一毛头鬼伞LHA-7的棘状小球结构取直径9cm培养皿灭菌后倒入15ml的PDA琼脂培养基，将毛头鬼伞LHA-7接种到培养基上，于24℃下培养。2天后开始每天用光学显微镜进行菌丝体形态研究。结果表明，从2天开始发现菌丝上产生明显的棘状小球结构，然后随时间延长，棘状小球不断增多，5天后达到高峰。
用扫描电子显微镜(SEM)常规技术对棘状小球进行形态特征研究。将LHA-7菌株接种于PDA琼脂平板上，24℃培养5天。取靠近菌落边缘已产生大量棘状小球的琼脂块(8mm×8mm)，立即放入2.5％戊二醛固定液中4℃固定24小时，接下来用0.2M的磷酸缓冲液(pH7.2)洗三次，再用1％的锇酸(OsO4)固定1小时。采用丙酮溶液进行梯度脱水，并用醋酸异戊酯进行交换。用HCP-2型日立临界点干燥仪干燥样品，然后用IB-3型离子溅射真空镀膜仪(EIKO)喷金，最后在JSM-5600LV型扫描电子显微镜下进行观察摄影。结果表明，菌丝体上产生大量的棘状小球(见
图1)，小球上布满了棘状小刺(图2)。
实施例二制备含棘状小球的菌丝体取直径9cm培养皿灭菌后倒入PDA琼脂培养基，将毛头鬼伞LHA-7接种到培养基上，于24℃下培养。2天开始发现菌丝上产生明显的棘状小球结构，然后随时间延长，棘状小球不断增多，5天后达到高峰。此时菌丝体对花生根结线虫和P.redivivus线虫具有很好的毒杀作用，对线虫的致死率8小时即达95％以上。
实施例三分离纯化棘状小球将12层擦镜纸折叠后置于直径10cm玻璃漏斗内作为过滤介质，用蒸馏水将其浸湿并使其紧密贴附于漏斗内壁，然后用锡薄纸将整个漏斗包裹起来进行常规灭菌后备用。
先按实施例2培养好大量产生棘状小球的LHA-7菌丝体。然后在培养皿内加入7ml无菌水，用玻璃刮子轻轻刮涂表面2分钟，用移液枪将平板内液体吸出，加入上述无菌漏斗内过滤，用灭菌1.5ml离心管收集滤液。将装有滤液的离心管于12000转离心5分钟，弃上清，沉淀用无菌水洗涤；再次离心(10000转3min)，弃上清，将沉淀用扫描电子显微镜，用前述方法观察，表明为纯化的棘状小球(图3)。
权利要求
1.一种毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构，其特征在于毛头鬼伞Coprinuscomatus LHA-7菌株有一种棘状小球结构，LHA-7菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.0932。
2.一种毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构的应用，其特征在于毛头鬼伞LHA-7带有棘状小球结构菌丝体对花生根结线虫Meloidogyne arenaria和Panagrellusredivivus线虫有毒杀作用，可作为制备杀线虫生物制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构及其应用，属真菌学和生物农药技术领域。发明采用的真菌毛头鬼伞，Coprinus comatus LHA－7菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0932。本发明确定了毛头鬼伞上的棘状小球结构，并测定了其对线虫的杀线虫活性。结果表明对花生根结线虫和腐生线虫都有很好的杀线虫活性，8小时线虫死亡率分别达95.8％和95％，本发明具有良好的应用开发前景。
文档编号C12N1/14GK1471806SQ0313513
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者张克勤, 罗宏, 周薇 申请人:云南大学