专利名称：一种人卵母细胞的贮存方法
技术领域：
本发明涉及一种人卵母细胞的贮存方法，确切地说，涉及一种采用缓慢低温冷冻和快速解冻复苏的贮存人卵母细胞方法，属于生殖医学的生物医学技术领域。
本发明的目的是这样实现的一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳(CO2)浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。
所述的方法包括下列具体操作步骤A、冷冻预处理取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行冷冻处理；B、程序降温冷冻和低温贮存将该人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行程序化缓慢降温冷冻；当温度达到设定的低温值，并稳定10-20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；C、快速升温解冻从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中和30±3℃的水中，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再顺序地放入不同的解冻处理液中复苏；D、复苏后培养将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度孵箱内进行培养，以供体外受精。
所述的步骤A中进一步包括下述配制冷冻保护液的操作步骤A1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；A2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液混合配制成含1.0～2.0M的PROH液，称作B液；A3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成1.0～2.0M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；A4、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。
所述的步骤A中的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤A5、将A液、B液和C液三种溶液分别放在室温(18～28℃)下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；
A6、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
所述的步骤B中进一步包括下述操作步骤B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是用麦管吸C液1.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→C液1.5±1.0cm→封口；B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰(seeding)，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入液氮(-196℃)中低温贮存。
所述的步骤C中进一步包括下述配制复苏处理液的操作步骤C1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；C2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.5～1.5M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；C3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.2～1.2M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；C4、将体积比为85～95％的A液与Sucrose配制成0.25～0.35M的Sucrose液，称作F液；C5、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
所述的步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤C6、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；C7、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后分别置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后分别置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱中培养，以供体外受精。
本发明是一种对人卵母细胞采用慢冻快融的贮存方法，该方法先把人卵母细胞浸泡在含有蔗糖(Sucrose)等的冷冻保护液中进行处理，再将处理过的人卵母细胞经程序缓慢降温冷冻后贮存于液氮；需要使用时，利用解冻复苏液使该人卵母细胞快速升温复苏，再将解冻复苏的人卵母细胞放入序贯培养液中进行培养，使该人卵母细胞能够通过卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)等体外受精技术发育成为胚胎。该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率，操作简便，所需医用仪器和溶液简单、价廉，成本低、复苏率高，有利于解决人类不孕问题和计划生育国策的贯彻执行。
下面结合本发明的实施例具体介绍人卵母细胞的贮存方法。
先说明第一个实施例的具体操作步骤首先制备冷冻保护液将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES与6.3ml的人体血清混合配制成含15％血清的溶液，称作A液；接着将8.5ml的A液与1.0ml的PROH液混合配制成1.0M的PROH液，称作B液；又取8.5ml的A液加入1.0ml的PROH液和Sucrose混合配制成含1.0M的PROH液与0.3M的Sucrose液的混合液，称作C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。最后，将A液、B液和C液分别放在室温(25℃)下平衡1.5小时以后，分别取出1.5ml置于无菌器皿中；剩余溶液可以放入4℃冰箱内，保存期为一周。此时从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘的卵母细胞置于上述B液中浸泡15分钟后，又在C液中浸泡12分钟；同时启动程序冷冻仪。
然后进行程序降温冷冻处理在C液中浸泡到12分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是用麦管吸C液2.5cm→空气2.0cm→其中含有人卵母细胞的C液3.0cm→空气2.0cm→C液2.5cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为从+18℃开始，先以-1.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持2分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.3℃/分的降温速率缓慢地降温到-30℃时，再以-30℃/分的降温速率快速降温到-172℃低温，在稳定10分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)低温贮存。
在需要进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先要配置解冻复苏处理液先用42ml的HTF-HEPES人体输卵管液缓冲液与6.3ml的人体血清混合配制成含15％血清溶液，称作A液；接着在9.2ml的A液加入0.8ml的PROH液和Sucrose混合配置成0.8M的PROH液与0.25M的Sucrose液的混合液，称作D液；再将9.6ml的A液加入0.4ml的PROH液和Sucrose混合配置成0.4M的PROH液与0.25M的Sucrose液的混合液，称作E液；还用9ml的A液和Sucrose配制成0.25M的Sucrose液的混合液，称作F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是先将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中35秒后，再置于30℃水中浸泡45秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各5分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各15分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
本发明另一个实施例的具体操作步骤是首先制备冷冻保护液将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES与10.5ml的人体血清混合配制成含25％血清的溶液，称作A液；接着将8.0ml的A液与2.0ml的PROH液混合配制成2.0M的PROH液，称作B液；又取8.0ml的A液加入2.0ml的PROH液和Sucrose混合配制成含2.0M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。接着，将A液、B液和C液分别放在室温(25℃)下平衡2小时，分别取出1.2ml置于无菌器皿中；剩余溶液可以放入4℃冰箱内，保存期为一周。此时从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘的卵母细胞置于上述B液中浸泡7分钟后，又在C液中浸泡20分钟；同时启动程序冷冻仪。
然后进行程序降温冷冻处理在C液中浸泡到20分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是用麦管吸C液2.0cm→空气2.5cm→其中含有人卵母细胞的C液2.5cm→空气2.5cm→C液2.0cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为从+24℃开始，先以-2.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持3分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.4℃/分的降温速率缓慢地降温到-35℃时，再以-35℃/分的降温速率快速降温到-180℃低温，在稳定15分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)中低温贮存。
在需要进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先要配置解冻复苏处理液先用42ml的HTF-HEPES人体输卵管液缓冲液与10.5ml的人体血清混合配制成含25％血清的溶液，称作A液；接着，将8.5ml的A液加入1.5ml的PROH液与Sucrose混合配置成1.5M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；再将9ml的A液加入1ml的PROH液与Sucrose混合配置成1.0M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；还用9ml的A液与Sucrose配制成0.35M的Sucrose液的混合液，称作F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是先将冷冻麦管从液氮取出，置于室温空气中45秒后，再置于32℃水中浸泡35秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各8分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各8分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置10分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2.5小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
本发明已经试验实施多次，试验的结果是成功的，实现了发明目的。
权利要求
1.一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳(CO2)浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。
2.根据权利要求1所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的方法包括下列具体操作步骤A、冷冻预处理取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行冷冻处理；B、程序降温冷冻和低温贮存将该人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行程序化缓慢降温冷冻；当温度达到设定的低温值，并稳定10-20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；C、快速升温解冻从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中和30±3℃的水中，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再顺序地放入不同的解冻处理液中复苏；D、复苏后培养将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度孵箱内进行培养，以供体外受精。
3.根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的步骤A中进一步包括下述配制冷冻保护液的操作步骤A1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；A2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液混合配制成含1.0～2.0M的PROH液，称作B液；A3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成1.0～2.0M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；A4、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。
4.根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的步骤A中的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤A5、将A液、B液和C液三种溶液分别放在室温(18～28℃)下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；A6、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
5.根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的步骤B中进一步包括下述操作步骤B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是用麦管吸C液1.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→C液1.5±1.0cm→封口；B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰(seeding)，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入液氮(-196℃)中低温贮存。
6.根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的步骤C中进一步包括下述配制复苏处理液的操作步骤C1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；C2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.5～1.5M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；C3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.2～1.2M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；C4、将体积比为85～95％的A液与Sucrose配制成0.25～0.35M的Sucrose液，称作F液；C5、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
7.根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于所述的步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤C6、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；C7、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后分别置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后分别置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱中培养，以供体外受精。
全文摘要
一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO
文档编号C12N5/08GK1454990SQ0313635
公开日2003年11月12日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者李晓红 申请人:北京大学第一医院