专利名称：含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌DraT的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种巴西固氮螺菌的工程菌，本发明还涉及一种菌肥。
背景技术：
小麦、玉米和水稻等大多数农作物产量的提高主要依赖于化学氮肥施用量的增加，以提高产量为唯一目标而无节制的大量施用化肥所带来的恶果是土壤板结，肥力下降，环境特别是水质严重污染等问题。
生物固氮是减少氮肥使用，缓解环境污染，降低农业生产成本的一条重要途径。根据固氮微生物与宿主植物的关系，将固氮作用分为自生固氮、联合固氮和共生固氮(尤崇杓主编，生物固氮，科学出版社，1987)。自生固氮微生物自由生活在土壤或水域中，其固氮效率易受周围环境的影响，它们在富含可被利用的能源物质、缺氮和微氧(或无氧)的土壤中固氮，因而可为森林和草原植物生长提供一些氮素；但在缺乏可被利用的能源(碳水化合物)或有化合态氮(NH4+或NO3-)时，是不能固氮生长的。共生固氮微生物与植物共生形成根瘤，它们生活在根瘤内，以宿主植物提供的光合产物为能源进行固氮，为宿主植物生长提供大量氮素；但其宿主范围有限，主要限于豆科植物(豆科植物根瘤菌)和某些非豆科树木(弗氏固氮放线菌)。联合固氮微生物，主要生长在植物的根际和根表，有些可进入根的皮层组织但不形成根瘤；很多联合固氮微生物的宿主是重要的粮食作物如水稻、小麦、玉米等，联合固氮为这些粮食作物提供一些氮素。由于联合固氮菌不能与宿主形成根瘤而裸露在植物根表，因此易受环境因素的影响，再加上固定的氮不易分泌到体外，这些因素都是造成联合固氮菌固氮效率较低的原因。于是，这些粮食作物的高产，不得不依赖化学氮肥。因此，提高联合固氮菌的固氮效率和改善固氮菌对宿主的氮素供应，是在粮食作物生产中减少氮肥用量的主要途径。
在自生固氮、联合固氮及共生固氮这三种固氮类型中，对自生固氮的理论研究较为深入，但在农业生产中的应用价值不大。联合固氮较之共生固氮有固氮机理简单、易于进行基因工程改造等优点。
在联合固氮菌中，国内外研究较多的是巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)。70年代中期巴西学者Dobereier发现巴西固氮螺菌大量存在于禾本科牧草根际，并分离出许多菌株。后来的研究表明巴西固氮螺菌广泛存在于世界上许多地区(包括热带、温带甚至寒带)，不仅能与禾本科牧草联合共生，而且还与许多单子叶植物联合共生，如玉米、水稻、小麦、高粱、甘蔗等(Dobereiner J，Day J M.Proceeding of thelst International Symposium on Nitrogen Fixation，Newton WeandNyman CJ(eds.)，Washington State University Press，Pullman，1976，518~538)。由于巴西固氮螺菌能与很多重要的单子叶粮食作物联合固氮并为这些作物提供一定的氮素，因此从那时起，世界各地的科学家们便倾注了大量的精力，对该菌的形态、生理生化、遗传、田间应用等各方面进行了全方位的研究。其中A.brasilense Sp7菌株是国外在遗传、田间应用等方面研究最多的标准菌株，该菌株就是70年代从巴西禾本科牧草根际分离获得的，来源于热带地区。
自70年代以来，人们以A.brasilense作为菌肥进行了很多田间接种试验，其中大多数以小麦作为施肥对象。从1994年世界各地的统计结果来看，用该菌作为菌肥，接种的成功率是60％，其增产幅度为5～30％。而且，接种效果与接种的有效菌数、土壤肥力等因素有关(Colnaghi R.et al.Plant and soil，1997，194145-150)。一般在贫瘠的土壤中增产幅度大，在肥沃土壤中增产幅度小，因此认为增产效果主要是由于A.brasilense分泌的植物激素促进了植物生长和提高了植物对矿物质和水分的吸收而引起的，而由固氮作用提供氮素导致的增产效果是有限的(Okon Y.et al.SoilBiology and Biochemistry，1994，261591-1596)。A.brasilense野生菌只在限铵(小于5mM NH4+)的环境中固氮，因此土壤中高的铵浓度是发挥该菌固氮效率的主要限制因子。
1994年美国以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)PC和2011为出发菌株，分别构建了7株在染色体上克隆有额外拷贝dctABD或/和nifA的重组菌，在美国威斯康星州的四个试验地上进行的小区田间比较试验结果表明同时克隆有dctABD和nifA的菌株RMPBC-2在土壤有机质和化合态氮素含量较低的Hancock试验点上的苜蓿植株生物量较出发菌PC高12.9％、较不接种对照高17.9％，其差异已达到统计上的显著水平(BosworthA.H.et al.Applied Environmental Microbiology，1994，60(10)3815-3832)。1996年，美国用外源dctABD基因及修饰的nifA基因重组的苜蓿根瘤菌的接种工程菌种实验已进入大田应用阶段。至今，国内外接种实验用的巴西固氮螺菌都是野生型菌株。国外文献及国外专利查新都未见有关巴西固氮螺菌耐铵工程菌进行田间试验的报道，国内未见用巴西固氮螺菌耐铵工程菌在田间接种的报告。
我室于1984年从北京郊区玉米根部分离到巴西固氮螺菌Yu62菌株，在国家863项目的资助下，本课题组以巴西固氮螺菌Yu62为原始菌株，十几年来通过对该菌从遗传、调控、生理等各方面的深入研究，使该菌的固氮调控机制已趋于明朗化，实验已证实NH+4对该菌固氮作用的调控是通过两条途径而起作用的---阻遏固氮酶的合成和抑制已有固氮酶的活性。在巴西固氮螺菌中，翻译后的固氮酶活性受DraT-DraG蛋白系统的调控。当细胞内铵浓度高时，在DraT酶的作用下，使固氮酶铁蛋白一个亚基上的精氨酸残基被一个ADP-核糖基团共价修饰而完全丧失活性；当细胞内铵浓度低时，在DraG酶的作用下，将ADP-核糖从铁蛋白亚基上解离，铁蛋白恢复活性。draT基因突变后，其固氮酶活性则不再受铵的抑制。因此，巴西固氮螺菌DraT-突变株的构建将是突破高铵限制固氮效率的一条改造途径。在固氮酶合成调控中，NifA作为固氮酶结构基因(nifHDK)的转录激活蛋白已得到证实。增加nifA的拷贝数就能提高固氮酶活性。
发明内容
本发明的目的是增加巴西固氮螺菌中nifA基因的拷贝数和对draT基因进行插入失活，构建成的工程菌株抗铵能力增强和固氮效率提高。本发明的再一个目的是提供一种菌肥。
本发明提供了一种巴西固氮螺菌工程菌株，菌株号为YuMA。该菌株已于2003年1月22日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏中心地址中国，北京，中关村。保藏号为CGMCCNo.0876。
本发明还提供了一种菌肥，它含有本发明的含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌DraT-工程菌株。
本发明的巴西固氮螺菌工程菌株YuMA是通过对1984年由中国农业大学微生物系从北京郊区玉米根际土壤中分离获得的巴西固氮螺菌Yu62进行遗传改造而获得的，其形态特征和分类地位仍然与野生型出发菌株巴西固氮螺菌Yu62相同。巴西固氮螺菌工程菌株YuMA在分类上属于假单孢杆菌目(Pseudomonadales)，螺旋菌科(Spirillaceae)，固氮螺菌属(Azospirillum)，巴西固氮螺菌种(Azospirillum brasilense)。该菌形态为杆状，略有弯曲，菌体为0.5-0.9×2-3mm，有的更长些，革兰氏染色阴性，在液体培养基中靠一根极生鞭毛游动，在固体培养基上可产生数根侧生鞭毛，细胞内含有PHB(聚β-羟基丁酸盐)颗粒，DNA G+C含量为70％。最适生长温度是30℃，可以积累类胡萝卜素，老的培养物呈粉红色。对氨苄青霉素和奈啶酮酸具有自然的抗性。其生长不需要生物素，属于需氧的化能有机营养菌，在含有葡萄糖或核糖的基本培养基中不产酸。可以利用有机酸作为唯一碳源，如苹果酸、乳酸、丙酮酸和瑚珀酸等。可以利用植物秸杆(含有大量的半纤维素和木聚糖)进行固氮，在微好氧条件下进行固氮。巴西固氮螺菌工程菌株YuMA对人蓄无毒，无致病性。100ml工程菌株YuMA菌液(OD600)产生的激素，即IAA和GA3分别为3.3574mg和0.487。
野生型巴西固氮螺菌Yu62菌株在无氮培养基上可以生长，且抗氨苄青霉素和奈啶酮酸。重组工程菌株与野生型菌株相比，增加了外源基因卡那霉素抗性和四环素抗性。卡那霉素抗性和四环素抗性在自然环境中特别是土壤微生物中已较为普遍，因此工程菌所增加的卡那霉素抗性和四环素抗性不会对人类健康和生态环境构成新的危害。
2000年和2001年连续二年，在山西省农业科学院土壤肥料研究所进行玉米田间小区接种工程菌YuMA，比接种野生型菌及无菌载体显著地促进了玉米增产及节省氮肥，为进一步大田应用提供了依据。
将述培养物接种玉米的田间试验结果表明，工程菌株YuMA显示良好的节肥增产效果，增产幅度在11.27-44.7％之间，节约氮肥用量在15-20％之间。因此，该菌在禾本科粮食作物的应用上具有潜在的推广市场，可望取得良好的经济效益。
图1为巴西固氮螺菌工程菌在玉米根表分布的扫描电镜照片。
具体实施例方式
以下通过工程菌株YuMA的构建实例及应用实例对本发明作进一步说明。
1.工程菌株YuMA的构建(1)巴西固氮螺菌DraT-突变株的构建本发明首先从巴西固氮螺菌Yu62的基因组文库中抽提总染色体DNA，然后用Sau3A酶切，回收8-20kb的DNA片段，与噬菌体载体EMBL3A(华美生物工程公司)连接并在体外进行包装，构建成巴西固氮螺菌Yu62的基因文库。用巴西固氮螺菌Sp7菌株的部分draT基因片段做探针，从巴西固氮螺菌Yu62基因文库中筛选到一个阳性克隆，该阳性克隆的长度为8.0kb。用SalI对阳性克隆进行酶切，并回收含有draT基因的8.0kb的外源片段，并克隆到pUC19(购自华美生物工程公司)上，得到重组质粒pLYM106。质粒pLYM106(含有draT基因)用EcoRI+KpnI酶切，回收3.0kb的draTG基因片段，与BamHI酶切后经Klenow补平的自杀型质粒pSUP202(Promega公司)连接，得到重组质粒pSUTG。将从pUC4K质粒上用PstI酶切后回收的1.4kb卡那霉素(Km)片段，插入到重组质粒pSUTG的draT基因的PstI位点，造成draT基因失活，从而得到了质粒pSUTG-1(draT∷Km)。将质粒pSUTG-1(draT∷Km)通过转化作用而导入大肠杆菌S17-1中。
将含有质粒pSUTG-1(draT∷Km)的大肠杆菌S17-1接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养16小时；同时，将巴西固氮螺菌Yu62接种到含有氨苄青霉素(Amp)和萘叮酮酸的液体LD培养基中，30℃振荡培养20小时。取大肠杆菌S17-1菌液和巴西固氮螺菌Yu62菌液各500μl，加入到，1.5ml Eppendorf管中，1000rpm离心30秒，弃上清，用移液器将菌泥混合物移入到一LD固体平板中央，30℃正置培养过夜。然后，用接种环刮下少许菌泥，在含有卡那霉素、氨苄青霉素和萘叮酮酸的LB平板上划单菌落，30℃培养，分离纯化2-3次后长出的单菌落即为DraT-突变株。由于质粒pSUTG-1属于自杀型质粒，所以DraT-突变株中不含有外源质粒。(2)nifA基因的克隆和nifA基因向巴西固氮螺菌DraT-突变株的导入用PCR法从巴西固氮螺菌Yu62中扩增得到含nifA基因的2.4kb，并克隆到pGEM-T(Promega公司)载体上，形成pT-nifA重组质粒。用XhoI和HindIII对载体pVK100(购自华美工程公司)进行双酶切，同时用XhoI和HindIII对pT-nifA重组质粒进行双酶切，回收2.4kb nifA片段，与连接得到pKC11重组质粒。在pKC11重组质粒中，nifA基因在卡那霉素抗性基因的启动子下组成型表达，而且由于nifA基因的插入而使卡那霉素基因失活，但该质粒仍然携带有四环素抗性基因。接着将pKC11重组质粒通过电转化导入大肠杆菌S-17。然后将含有pKC11重组质粒的大肠杆菌S-17(华美生物工程公司)与巴西固氮螺菌DraT-突变株进行双亲杂交，筛选含有四环素抗性和卡那霉素抗性的接合子，该接合子就是工程菌株YuMA。
野生型巴西固氮螺菌Yu62菌株在无氮培养基上可以生长，且抗氨苄青霉素和萘啶酮酸。重组工程菌株与野生型菌株相比，增加了外源基因卡那霉素抗性和四环素抗性。卡那霉素抗性和四环素抗性在自然环境中特别是土壤微生物中已较为普遍，因此工程菌所增加的卡那霉素抗性和四环素抗性不会对人类健康和生态环境构成新的危害。
2.工程菌株的固氮酶活性将本发明的工程菌株YuMA与野生型Yu62菌株一同进行固氮酶活性的测定，然后比较它们的固氮酶活性。固氮酶活性的测定按半固体法固氮酶测定方法和液体法固氮酶测定方法两种方法同时测定。
(i)半固体法固氮酶活性的测定(1)将待测的工程菌株YuMA与野生型菌株Yu62同时活化，保持其生长状态一致；(2)将活化后的工程菌株YuMA与野生型菌株Yu62分别接入含相应抗生素的液体LD培养基(LD液体培养基10g胰蛋白胨，2.5g氯化钠，5g酵母粉，1000ml蒸馏水。15磅，121℃灭菌15分钟灭菌)中，30℃振荡培养20小时。培养工程菌株YuMA的LD培养基中需要添加卡那霉素(浓度为10μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)和氨苄青霉素(25μg/ml)；培养野生型Yu62菌株的LD培养基中需要添加氨苄青霉素(25μg/ml)和萘啶酮酸(5μg/ml)；(3)分别测定工程菌株YuMA和野生型菌株Yu62的OD600值，并将OD600值调节为1。取1ml OD600值为1的菌液，12,000rpm离心1min，收集菌体；用液体K-lac培养基(K-Lac基本培养基每升含K2HPO41.67g，KH2PO40.87g，MgSO47H2O 0.29g，NaCl 0.48g，60％乳酸钠溶液6.3ml，10磅灭菌30min。使用前每100ml加入200×CaCl2溶液1ml、100×微量元素溶液1ml、1000×FeCl3溶液0.1ml、1000×NaMoO4溶液0.1ml，根据需要加入5M NH4Cl溶液至所需终浓度。半固体的K-Lac加入0.2％的琼脂)洗两遍后充分悬浮于100μl液体K-Lac培养基中；然后将100μl菌液接种到含有的K-Lac半固体培养基的小管，30℃培养48小时。设3个重复，即用工程菌株YuMA和野生型菌株Yu62各接种3个半固体小管；(4)向每个半固体小管中塞入一个小棉塞，再将试管帽全部换成胶塞，各注入1ml新制的乙炔，30℃反应10-12小时；(5)从每个半固体小管中用微量进样器取出100μl气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。
(ii)液体法测定固氮酶活性(1)将待测的工程菌株YuMA与野生型菌株Yu62同时活化，保持其生长状态一致；(2)将活化后的各菌株接入含相应抗生素的液体LD培养基中，30℃振荡培养20小时；(3)测各菌株的OD600值，并将OD600值调节为1。取1ml OD600值为1的菌液，12,000rpm离心1min，收集菌体；用液体K-lac培养基洗两遍后充分悬浮于100μl液体K-lac培养基中；接着将100μl菌液接入到10ml小血清瓶，30℃剧烈震荡培养，胁迫3~4小时；(4)向每个小血清瓶注入10％体积新制的乙炔，每隔30分钟从每个小血清瓶中用微量进样器取出100μl气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。
(iii)nmol乙烯的标定(1)准备120ml血清瓶两个，标为1#、2#瓶；(2)将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100ml水(用容量瓶量取)，换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100ml；(3)向1#瓶中注射2.24ml(标况下为2.24ml，非标准状况下，根据PV＝nRT来计算注入量)乙烯，再从1#瓶中取出1ml气体注入2#瓶中，从2#瓶中取出100μl气体打入气相色谱仪，所显示的峰高即为1nmol乙烯的量，据此可计算出记录纸上每单位峰高代表多少nmol乙烯。
通过用半固体固氮酶活性测定方法和液体固氮酶活性测定方法两种方法测定的结果都表明，本发明涉及的工程菌株YuMA的固氮酶活性比野生型Yu62菌株高一倍以上，测定的固氮酶见表1。
表1. 工程菌株YuMA与野生型菌株Yu62的固氮酶活性比较菌株 表型和/或基因型 相对固氮酶活性(％)野生型巴西固氮螺菌Yu62 野生型 100巴西固氮螺菌工程菌YuMA DraT-突变株中含有额外拷贝nifA基因 2243.工程菌株YuMA的田间小区接种试验以下通过工程菌YuMA的应用实例对本发明作进一步说明。
巴西固氮螺菌工程菌所用培养基成分和培养条件如下LD液体培养基(15磅，121℃灭菌15分钟灭菌)胰蛋白胨10g NaCl 2.5g酵母粉 5g 蒸馏水1000ml
pH6.8 置于200转/分恒温摇床，30℃培养48小时。
上述液体培养基中加1.2-1.5％琼脂，配制固体斜面或平板，pH6.8，30℃静置48小时。
用含有卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的LD液体培养基培养工程菌YuMA，菌液与草炭土混合制备菌剂。菌剂作为种肥，结合播种作业施用。每株穴施5克菌剂，菌剂含量大约为5×108个/株穴。
2001年和2002年在山西省，在轻质砂壤土的田间小区实验结果表明，在玉米穗长、穗行数、行粒数、百粒重、小区产量和亩产量，接种工程菌与接种野生型菌均比无菌对照有显著地增产作用和节约氮肥作用。
试验处理设计(1)无菌对照(未接菌的培养液+100％氮肥)(2)无菌对照(未接菌培养液+80％氮肥)(3)野生型巴西固氮螺菌Yu62+80％氮肥(4)巴西固氮螺菌工程菌YuMA+80％氮肥100％的氮肥为15kg尿素/亩、80％的氮肥为12kg尿素/亩亩。共4个处理，4次重复，随机排列，小区面积33.3m2。试验结果见表2。
表2. 接种工程菌YuMA对玉米生长的影响和增产效应
在轻质沙壤土、富含有机质、肥力中等的土壤条件下，对玉米联合固氮菌野生型和工程菌株进行了玉米小区田间接种试验。
试验结果表明，在不同水平氮肥条件下，接种工程菌比接种野生菌和不接种的对照都有不同程度的增产，特别是在施肥水平为12kg尿素/亩(80％)的条件下，接种工程菌比接种野生型平均增产10％，比不接种的对照增产32％，在减少化肥用量20％的情况下，接种工程菌仍然比对照增产32％。
权利要求
1.一种含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)DraT-工程菌株，保藏号为CGMCC No.0876。
2.一种菌肥，它含有权利要求1所述的含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌DraT-工程菌株。
全文摘要
本发明提供了一种含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)DraT
文档编号C12N1/21GK1552846SQ03138429
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者李季伦, 陈三凤, 张耀平, 赵银锁, 马旅雁, 王娟 申请人:中国农业大学