药品中主要病原微生物的检测的制作方法

专利名称：药品中主要病原微生物的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用聚合酶链式反应(PCR)技术检测药品中主要病原微生物的方法，特别地涉及一种利用聚合酶链式反应扩增特异性扩增主要病原微生物的特定的基因片段来检测药品中主要病原微生物的方法和用于PCR的引物，以及涉及用于检测PCR产物的探针和DNA芯片以及包含该DNA芯片的试剂盒。
背景技术：
药品的微生物学必须符合中国药典规定的标准，这对于制药公司和各药检研究所来讲是非常重要的。目前，药品中主要病原菌的检测均是采用传统的微生物检测方法，申请人尚未发现采用基因芯片检测主要病原菌的方法。中国、美国和欧洲药典均规定，在药品中不得含有主要病原菌。所以就药品特别是某些中药制品的污染问题而言，能快速检出破伤风梭菌的方法对于减少药物废品的产生以及避免浪费是非常必要的；而相关的药检部门则可以利用该类方法的敏感性和特异性来保证国民的用药安全。目前，药品中病原菌的检测大都是采用传统的微生物检测方法。
在现有的微生物检测技术中，病原菌的检测主要是利用微生物的培养法、生化反应、血清学方法以及荧光法等。例如JP62-115296A中公开了采用蛋黄培养细菌而后测定的方法，SU825627B公开了在厌氧条件下培养来测定营养品中的梭状芽胞杆菌的方法。RU2084521C公开了一种用淀粉和营养介质来分离和检测梭状芽胞杆菌的方法，该方法可用于控制奶品加工。US6228574B公开了一种以孢子萌发为基础，快速检测与确定分析物例如梭状芽胞杆菌的方法。另外，荧光法是指通过将微生物细胞染色或标记来产生荧光进行检测的方法，例如，在JP11-169194中公开了采用生物发光试剂测定体液样品中的微生物的方法。
然而，众所周知，这些传统的方法费时、耗力，且易出现错误的鉴定结果。随着分子生物学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，聚合酶链式(Polymerase chainreaction，PCR)以其敏感、特异、简便、快速的特点已逐步应用于病原菌的检测。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。通过这一方法可将极微量的DNA扩增放大数百万倍，用于DNA检测则极大地提高了灵敏度，理论上可测到每个细胞一分子DNA的水平。另外，基于PCR反应的DNA芯片技术以其具有敏感、特异、简便、快速及可以同时检测多种病原菌基因的特点受到广泛的关注。DNA芯片技术是通过核酸分子杂交原理来进行酸序列分析，即通过芯片上已知序列的核酸探针碱基的配对来检测分析未知序列，即杂交测序(SBH)。由于光刻技术具有非常高的分辨率，可以在支持物上按设计要求合成出高密度的寡核苷酸探针阵列，这个探针阵列由一定长度的寡核苷酸的所有可能序列组成，而且探针阵列中每一位置的寡核苷酸的序列都是已知的，将标记过的待分析序列与芯片上的探针阵列进行杂交，控制反应条件，与靶序列完全互补的探针显示很强的杂交信号，利用高分辨率检测装置检测杂交信号，经过计算机分析处理，即可检测出是否存在靶序列。
本发明的概述本发明涉及主要病原菌中基因上扩增特异性DNA片段的引物。因此，这些引物可以用来检测主要病原菌。
在具体实施方案中，本发明设计下列序列片段。
金黄色葡萄球菌1、命名为SAU-1的引物，核苷酸序列为5’CCAGATGAGTTGCACAAATCG3’(SEQ ID NO.1)2、命名为SAU-2的引物，核苷酸序列为5’CACCAAATAGTGACGAGTTA3’(SEQ ID NO.2)沙门菌3、命名为SAl-1的引物，核苷酸序列为5’GGCGAGCAGTTTGTCTGTC3’(SEQ ID NO.3)4、命名为SAl-3的引物，核苷酸序列为5’GTTTCGCCTGGCTGATACG3’(SEQ ID NO.4)志贺菌5、命名为Shi-1的引物，核苷酸序列为5’CAACACTGGATGATCTCAG3’(SEQ ID NO.5)
6、命名为Shi-2的引物，核苷酸序列为5’CCCCCTCAACTGCTAATA3’(SEQ ID NO.6)7、命名为Shi-3的引物，核苷酸序列为5’TGTATCACAGATATGGCATGC3’(SEQ ID NO.7)8、命名为Shi-4的引物，核苷酸序列为5’TCCGGAGATTGTTCCATGTG3’(SEQ ID NO.8)大肠埃希菌9、命名为Eco-1的引物，核苷酸序列为5’ATTAACCCTCACTAAAG3’(SEQ ID NO.9)10、命名为Eco-2的引物，起核苷酸序列为5’CGATGAAGAACGCAGCG3’(SEQ ID NO.10)铜绿假单胞菌11、命名为Pae-1的引物，核苷酸序列为5’GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC 3’(SEQ ID NO.11)鉴别活菌与死菌用引物12、命名为Lv-16SrR-1的引物，核苷酸序列为5’GCCGCCAGTGTGCTGGAATT3’(SEQ ID NO.12)13、命名为Lv-16SrR-2的引物，核苷酸序列为5’TAGATGCATGCTCGAGCGGC3’(SEQ ID NO.13)本发明的一个重要方面是用于PCR扩增的样品的方法。有生长能力的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌裂解后，从细胞中释放的DNA可以作为PCR扩增合适的模板。通过是否出现大小在126-539碱基对范围内的基因片段来判定其是否存在。这个片段可通过琼脂塘凝胶电泳并与DNA标准分子量的比较来加以判定，或利用基因芯片来判断含有靶序列的主要病原菌是否存在。
本发明的详细描述本发明首先涉及用来快速检测被污染药品中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌的方法。通过PCR金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌的核苷酸引物扩增出与其他种属无关的基因。由于不需要在实验基质中培养细菌，所以减少了检测细菌所需的时间，这些因素使这种方法可用于现场检测。
该方法以DNA的碱基互补为基础。DNA是由核苷酸“碱基”组成的两条反向平行链构成。这些碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，互相形成特有的氢键。腺嘌呤与胸腺嘧啶配对及鸟嘌呤和胞嘧啶配对的DNA双链能通过碱处理或加热的方法变性或转变成单链。当条件合适时，DNA将重新形成双链。聚合酶链式反应即PCR法是将目标DNA区段扩散到可检测水平所通常使用的方法。近来它被用来检测许多病原细菌。在这个过程中，与目标区的两侧区域互补的包含特异序列的DNA引物通过一种DNA聚合酶来引导DNA的酶促合成。DNA聚合酶要求引物来启动互补DNA链的合成。引物是核苷酸片段(18碱基)。在PCR过程中通过温度在退火步骤中控制引导过程。引物的退火条件根据试验来确定，以便提高特异性。退火后，当聚合酶合成互补DNA链时聚合发生。聚合后，PCR反应物被加热到使双链DNA变性。通过使用热稳定性的DNA聚合酶进行退火、聚合、变性的反复循环能够保证该酶不失活。PCR扩增是使用自动热循环设备的常规试验方法。结果可以使目标DNA片段指数倍的扩增。扩增的目的片段可通过琼脂凝胶电泳检测到，或将扩增的目的片段与DNA芯片进行反应然后进行检测。
另一方面，本发明提供了如下的用于药品中主要病原菌检测的引物，其中用于金黄色葡萄球菌的1、命名为SAU-1的引物(A)，核苷酸序列为5’CCAGATGAGTTGCACAAATCG3’(SEQ ID NO.1)2、命名为SAU-2的引物(B)，核苷酸序列为5’CACCAAATAGTGACGAGTTA3’(SEQ ID NO.2)用于检测沙门菌的3、命名为SAl-1的引物(C)，核苷酸序列为5’GGCGAGCAGTTTGTCTGTC3’(SEQ ID NO.3)4、命名为SAl-3的引物(D)，核苷酸序列为5’GTTTCGCCTGGCTGATACG3’(SEQ ID NO.4)用于检测志贺菌的5、命名为Shi-1的引物(E)，核苷酸序列为5’CAACACTGGATGATCTCAG3’(SEQ ID NO5)6、命名为Shi-2的引物(F)，核苷酸序列为5’CCCCCTCAACTGCTAATA3’(SEQ ID NO.6)7、命名为Shi-3的引物(G)，核苷酸序列为
5’TGTATCACAGATATGGCATGC3’(SEQ ID NO.7)8、命名为Shi-4的引物(H)，核苷酸序列为5’TCCGGAGATTGTTCCATGTG3’(SEQ ID NO.8)用于检测大肠埃希菌的9、命名为Eco-1的引物(I)，核苷酸序列为5’ATTAACCCTCACTAAAG3’(SEQ ID NO.9)10、命名为Eco-2的引物(J)，起核苷酸序列为5’CGATGAAGAACGCAGCG3’(SEQ ID NO.10)用于检测铜绿假单胞菌的11、命名为Pae-1的引物(K)，核苷酸序列为5’GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC3’(SEQ ID NO.11)用于鉴别活菌与死菌用的引物12、命名为Lv-16SrR-1的引物，核苷酸序列为5’GCCGCCAGTGTGCTGGAATT3’(SEQ ID NO.12)13、命名为Lv-16SrR-2的引物，核苷酸序列为5’TAGATGCATGCTCGAGCGGC3’(SEQ ID NO.13)14、命名为Lv-16sRNA的引物(M)，核苷酸序列为5’GATTAGAGTTTGATCATGGC3’以及检测梭菌的15、命名为TTC-1的正向引物(N)，核苷酸序列为5’TTTTTAGACCTAACAACC 3’16、命名为TTC-2的反向引物(O)，核苷酸序列为
5’TTAATCATTTGTCCATCC 3’另外，因为死菌一般并不影响药品和食品的安全，所以引入16sRNA探针引物来检测被检物中存在的细菌是否为活菌。检测方法的原理是由于细菌的RNA的半衰期很短，细菌死亡后其RNA很快降解，因此不能通过反转录过程进行DNA扩增。上面描述的引物是通过大量的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌DNA序列对比得到的，核酸序列比较软件阐明了基因的高度保守区。从这些区域选择特定的引物点并合成合适的引物。通过反复试验来决定引物的最佳序列。且引物最后的确定遵循以下标准从鉴定的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌中扩增出上述DNA产物。
II.从鉴定的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌以外的其它菌种不能产生目的产物。
III.从药品样品分离出的未鉴定的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌中扩增出目的产物。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌通过标准方法来测定形成目的产物的能力。培养物80℃放置10分钟，随后涂在生长培养基上，经过热处理能存活的细菌具有产生孢子的能力。表1概述了用于在一系列不同菌株培养物进行试验的引物性质的数据。这个引物可以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌上分别扩增出126-539(bp)碱基对的片段。
表1显示了引物从金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌中扩增目的基因的能力。不含目的基因的细菌，其不能产生目的带。
这些引物可用来筛选从药品提取的DNA，来检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌。这一方法与传统涂板技术相比极大地减少了周转时间。
下列步骤使药品中检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌获得成功。
样品中加入等体积胰豆胨培养基37℃放置45分钟(1毫升样品即足以对用于分析液体物质)，这使金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌生长，从这些菌种提取DNA。
II.煮沸样品10分钟以裂解细胞并释放DNA。
III.等份的样品通常为5微升，与20微升水，PCR珠(如U.S专利5,593,824中所描述，本文引入作参考)，及含有上述引物的2微升引物混合物混合。
IV.PCR热循环如下96℃变性2min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸5min。
V.PCR反应物与电泳上样储存染料混合，在2％的琼脂糖凝胶上电泳。
VI.将琼脂糖凝胶染色观察目的产物。
有些样品可能含有干扰PCR扩增的物质，在这种情况下，可将样品用胰豆胨培养基进行10倍或100倍的稀释可克服这种干扰。在检测任何样品时都需要有阳性几阴性对照，电泳时需有标准分子量对照物。
试验中所用到的菌株及结果见表1-5。
表1 金黄色葡萄球菌检测用引物(Sau-1+Sau-2)产生486bp核苷酸细菌菌株 来源PCR测试金黄色葡萄球菌ATCC25923 ATCC +金黄色葡萄球菌CMCC26001 CMCC +金黄色葡萄球菌CMCC26002 CMCC +金黄色葡萄球菌CMCC26012 CMCC +破伤风梭菌CMCC64001 CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢杆菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢杆菌ATCC4525 ATCC -产气夹膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化脓链球菌ATCC19615 ATCC -粪肠球菌ATCC29212 ATCC -粪肠球菌ATCC14506 ATCC -类鼻疽假单胞菌CMCC53051 CMCC -鲍曼不动杆菌 -奇异变形杆菌CMCC49003 CMCC -普罗菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸橼酸菌CMCC48017 CMCC -枸橼酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所表2 沙门菌检测用引物(Sal-1+Sal-2)产生539bp核苷酸细菌菌株 来源PCR测试鼠伤寒沙门菌CMCC47729 CMCC +鼠伤寒沙门菌CMCC50013 CMCC +肠炎沙门菌CMCC50040 CMCC +
肠炎沙门菌CMCC50041CMCC +伤寒沙门菌CMCC50038CMCC +鸭沙门菌CMCC50083 CMCC +猪霍乱沙门菌CMCC47649 CMCC +德比沙门菌CMCC50112CMCC +都柏林沙门菌CMCC50042 CMCC +破伤风梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢杆菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢杆菌ATCC4525 ATCC -产气夹膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化脓链球菌ATCC19615ATCC -粪肠球菌ATCC29212 ATCC -粪肠球菌ATCC14506 ATCC -类鼻疽假单胞菌CMCC53051CMCC -鲍曼不动杆菌 -奇异变形杆菌CMCC49003 CMCC -普罗菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸橼酸菌CMCC48017 CMCC -枸橼酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所表3 铜绿假单胞菌检测用引物(Pae-1+Pae-2)产生435bp核苷酸细菌菌株 来源PCR测试铜绿假单胞菌ATCC27853 ATCC +铜绿假单胞菌ATCC27313 ATCC +铜绿假单胞菌CMCC10119 ATCC +铜绿假单胞菌CMCC10121 CMCC +铜绿假单胞菌CMCC10101 CMCC +破伤风梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢杆菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢杆菌ATCC4525 ATCC -产气夹膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化脓链球菌ATCC19615ATCC -粪肠球菌ATCC29212 ATCC -粪肠球菌ATCC14506 ATCC -类鼻疽假单胞菌CMCC53051CMCC -鲍曼不动杆菌 -奇异变形杆菌CMCC49003 CMCC -
普罗菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸橼酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所表4 大肠埃希菌检测用引物(Eco-1+Eco-2)产生126bp核苷酸细菌菌株 来源PCR测试大肠埃希菌CMCC44101CMCC +大肠埃希菌CMCC44123CMCC +大肠埃希菌CMCC44126CMCC +大肠埃希菌CMCC44134CMCC +大肠埃希菌CMCC44203CMCC +大肠埃希菌CMCC44210CMCC +破伤风梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢杆菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢杆菌ATCC4525 ATCC -产气夹膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化脓链球菌ATCC19615ATCC -粪肠球菌ATCC29212 ATCC -粪肠球菌ATCC14506 ATCC -类鼻疽假单胞菌CMCC53051CMCC -鲍曼不动杆菌 -奇异变形杆菌CMCC49003 CMCC -普罗菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸橼酸菌CMCC48017 CMCC -枸橼酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所表5 志贺菌检测用引物(Eco-1+Eco-2)产生349bp核苷酸细菌菌株 来源PCR测试福氏志贺菌CMCC51061CMCC +鲍氏志贺菌CMCC51149CMCC +志贺氏志贺菌CMCC51054 CMCC +宋内氏志贺菌CMCC51081 CMCC +摩根变形杆菌CMCC49086 CMCC +破伤风梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC -
枯草芽孢杆菌ATCC6051ATCC -地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢杆菌ATCC4525ATCC -产气夹膜梭菌ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化脓链球菌ATCC19615 ATCC -粪肠球菌ATCC29212 ATCC -粪肠球菌ATCC14506 ATCC -类鼻疽假单胞菌CMCC53051 CMCC -鲍曼不动杆菌 -奇异变形杆菌CMCC49003 CMCC -普罗菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸橼酸菌CMCC48017 CMCC -枸橼酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所另外，本发明提供了一种药品中相关病原菌检测专用的DNA芯片(PPDC)以及利用该DNA芯片检测病原菌的方法。本发明的DNA芯片的探针阵列设计如下在一显微镜载玻片表面，根据图1构建14个区域位点(5mm×5mm)，每个位点按图1所示将金黄色葡萄球菌Sau-1、Sau-2；沙门菌SAl-1、SAl-2；志贺菌Shi-1、Shi-2、Shi-3、Shi-4；大肠埃希菌Eco-1、Eco-1；铜绿假单胞菌Pae-1和破伤风梭菌TTC-1、TTC-2特异性探针顺序排列。这样可同时检测药品检测中规定的病原菌。每一探针的点样面积约为1.5mm×1.5mm，所述PPDC陈列的制作过程为先在载玻片上设计专用芯片的模式图。将预先合成好的特异性单股DNA探针，用微量点样针器通过直接物理接触固定于特定位点上。
其中金黄色葡萄球菌Sau-1特异性探针为CATGTATCAGCAATAAAC(SEB gene)金黄色葡萄球菌Sau-2特异性探针为ATTAAGGACAGTAAGTTA(SEBgene)沙门菌SAl-1特异性探针为CTCCGCTCATGTATCGA(araC gene)沙门菌SAl-2特异性探针为TCTCATCACATCACTAA(araC gene)志贺菌Shi-1特异性探针为CAACAATTCTTCCCTG(invE gene)志贺菌Shi-2特异性探针为AAATTTGCCCCC(invE gene)志贺菌Shi-3特异性探针为CCTAAGCATATTTCTGC(ipaH gene)志贺菌Shi-4特异性探针为GCCAAAGCTGCCTGCA(i paH gene)大肠埃希菌Eco-1特异性探针为TTCTCACAGATAACTGTG(uidAgene)大肠埃希菌Eco-2特异性探针为ATGCGATCTATATCACGC(uidAgene)铜绿假单胞菌Pae-1特异性探针为TCTCTTCCGGCAGGCCGAT(rpmH gene)活菌检测用16sRNA特异性探针为CATCACTTGATAGTTTAAAG破伤风梭菌TTC-1特异性探针为CAATAATTAGCTCTAT(Tetanustoxin C gene)破伤风梭菌TTC-2特异性探针为CTTTTAGGGATTTATC(Tetanustoxin C gene)
在本发明的另一方面提供了一种检测用PPDC试剂盒，该PPDC试剂盒的组成为芯片 5片杂交盖玻片10片dNTP/PCR引物系列混合液(引物A、B、C、D、E、F、G、各10ulH、I、J、K、M、N、O)2x杂交缓冲液 500ul在PPDC试剂盒中将合成的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌和破伤风梭菌特异性的单股DNA探针固定于载玻片上，被检物经特异引物进行聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction)扩增其基因序列，扩增后的靶基因序列变性产生单股的DNA，扩增时由Cy5荧光物标记。Cy5荧光物标记的基因序列与固相阵列杂交。结合在探针上的被检测核酸量与其碱基构成和靶-探针匹配的量所决定。被检测核酸可通过激光共焦显微镜检测杂交信号强弱和分布，并根据陈列中各位点探针分子的杂交信号强度直接鉴定被检物中是否是否污染有上述病原菌及鉴定其为何种病原菌。


附图1为药品相关病原菌检测DNA芯片(PPDC)示意图；附图2为A-O引物PCR扩增的电泳图片，其中图1从左至右依次为引物(Shi-1+Shi-2)检测福氏志贺菌CMCC51061产生349bp片段的核苷酸；引物(Pae-1)检测铜绿假单胞菌ATCC27853产生435bp片段的核苷酸；引物(Eco-1+Eco-2)检测大肠埃希菌CMCC44101产生460bp片段的核苷酸；引物(Sau-1+Sau-2)检测金黄色葡萄球菌ATCC25923产生486bp片段的核苷酸；引物(Sa1-1+Sa1-2)检测鼠伤寒沙门菌CMCC47729产生539bp核苷酸；引物(TTC-1+TTC-2)检测破伤风梭菌CMCC64001产生1536bp核苷酸；产生539bp核苷酸；核酸分子量参照物自上而下为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp。
下列是进一步描述本发明的实施例。这些实施例不应被认为是对本发明的限制。本领域技术人员应理解在形式上和详细内容上的各种改变并不违背在所附权利要求中详细标明的本发明的实质和范围。
实施例1待检药品的处理将待测药品样品加到无菌水中得到1％(W/V)溶液。该溶液经混合均匀后形成溶液或悬液。随后将其与等体积的胰豆胨培养基混合，在37℃孵育45分钟。
实施例2煮沸裂解及PCR扩增金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌生长后，煮沸10分钟。在煮沸过程中注意试管要打开。5微升样品加入到商品化预制备的PCR缓和物中。混合物提供PCR反应所需的试剂。每个终体积为25微升的PCR反应中含有1.5个单位的Taq DNA聚合酶、10毫摩尔的Tris-HCl(室温pH＝9.0)、50毫摩尔的KCl、1.5毫摩尔的MgCl2、200毫摩尔的每种核苷酸。无菌水及TTC引物加到PCR反应体系中。引物的浓度为0.5毫摩尔。PCR管放在热循环仪上使用上面所描述的程序进行扩增。
实施例3PCR产物的检测可通过产生大约126-539碱基对分子量范围内的PCR产物来测定样品中是否存在金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌。来自特定样品的PCR产物的出现说明金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌和铜绿假单胞菌检测阳性。下表6所示为熊胆粉、复方丹参片和板蓝根冲剂三种药品的PCR检测限度。
表6 三种不同药品中PCR检测限度样品 菌数/克药品PCR结果金黄色葡萄球菌ATCC25923培养物 1.5±0.7 +金黄色葡萄球菌CMCC26001培养物 1.4±0.5 +熊胆粉 2.1±1.0 +复方丹参片 1.4±0.7 +板蓝根冲剂 2.2±1.1 +铜绿假单胞菌ATCC27853培养物1.3±1.0 +铜绿假单胞菌CMCC10121培养物1.4±0.8 +熊胆粉 1.9±1.3 +复方丹参片 2.0±1.1 +板蓝根冲剂 1.8±0.8 +鼠伤寒沙门菌CMCC47729培养物1.7±0.8 +肠炎沙门菌CMCC50041培养物 1.9±1.0 +熊胆粉 2.7±1.2 +复方丹参片 2.1±1.4 +板蓝根冲剂 1.6±1.1 +大肠埃希菌CMCC44101培养物 1.9±0.7 +大肠埃希菌CMCC44123培养物 1.6±0.8 +熊胆粉 1.9±1.2 +复方丹参片 2.3±1.1 +板蓝根冲剂 2.1±1.2 +福氏志贺菌CMCC51061培养物 2.0±1.1 +鲍氏志贺菌CMCC51149培养物 1.4±0.8 +志贺氏志贺菌CMCC51054培养物2.1±0.9 +熊胆粉 2.0±1.0 +复方丹参片 2.2±0.8 +板蓝根冲剂 1.8±1.1 +实施例4PPDC试剂盒检测操作程序没有包含在实验中所采用的试剂盒中的试剂和设备BE缓冲液、TRIS、不合Rnase和Dnase的PCR试管、激光激光共聚焦显微镜等。PPDC试剂盒检测操作程序如下1.取被检物1mg或1ml加入10ml增菌肉汤经6小时增菌。
2.离心取沉淀物，取适量加入系列dNTP/PCR引物管中，进行PCR扩增。
3.扩增后的DNA序列变性，与PPDC试剂盒中的DNA芯片的相应位点的单股DNA探针进行杂交。
4.激光共聚焦显微镜检测阵列中各位点的荧光信号，确定结果。
尽管本发明针对具体实施方案已加以描述，但对于本领域技术人员来讲本发明的很多其它形式及改进是显而易见的。附加的权利要求及本发明通常应该被解释为可以覆盖所有上述的包含在本发明的主旨范围内的明显的其它形式和改进。
权利要求
1.一种用于系统地检测药品中主要病原微生物的方法，该方法包括A)使用选自主要病原微生物的引物从待测药品的细菌总细胞DNA中通过PCR扩增出所述主要病原微生物DNA的一部分；B)检测扩增产物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的主要病原微生物为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌。
3.如权利要求2所述的方法，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌为需氧菌。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述用于扩增金黄色葡萄球菌DNA的引物(A)和引物(B)序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于扩增沙门菌DNA的引物(C)和引物(D)序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；用于扩增志贺菌DNA的引物(E)、引物(F)、引物(G)和引物(H)序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；用于扩增大肠埃希氏菌DNA的引物(I)和引物(J)序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；用于扩增铜绿假单胞菌DNA的引物序列为SEQ ID NO.11(K)。
5.如权利要求3所述的方法，其中还使用鉴别活菌和死菌的引物。
6.如权利要求5所述的方法，其中鉴别活菌和死菌的引物的序列为SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13。
7.如权利要求1-7之一所述的方法，其中所述的扩增反应可以产生长度在126-539核苷酸范围的多核苷酸。
8.如权利要求1-6之一所述的方法，其中扩增产物的检测是通过琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量进行比较来完成的。
9.如权利要求1-6之一所述的方法，其中扩增产物的检测是在DNA芯片上通过扩增的DNA片段与DNA芯片的特异性探针进行杂交，然后用激光共聚焦显微镜检测每个探针分子的杂交信号强度来进行的。
10.根据权利要求9所述的方法，待检物在PCR扩增时，以Cy5荧光素进行标记。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的特异性探针分别为金黄色葡萄球菌Sau-1特异性探针CATGTATCAGCAATAAAC(SEB gene)；金黄色葡萄球菌Sau-2特异性探针ATTAAGGACAGTAAGTTA(SEB gene)；沙门菌SAl-1特异性探针CTCCGCTCATGTATCGA(araC gene)；沙门菌SAl-2特异性探针TCTCATCACATCACTAA(araC gene)；志贺菌Shi-1特异性探针CAACAATTCTTCCCTG(invE gene)；志贺菌Shi-2特异性探针AAATTTGCCCCC(invE gene)；志贺菌Shi-3特异性探针CCTAAGCATATTTCTGC(ipaH gene)；志贺菌Shi-4特异性探针GCCAAAGCTGCCTGCA(ipaH gene)；大肠埃希菌Eco-1特异性探针TTCTCACAGATAACTGTG(uidA gene)；大肠埃希菌Eco-2特异性探针ATGCGATCTATATCACGC(uidA gene)；铜绿假单胞菌Pae-1特异性探针TCTCTTCCGGCAGGCCGAT(rpmH gene)；活菌检测用16sRNA特异性探针为CATCACTTGATAGTTTAAAG；破伤风梭菌TTC-1特异性探针CAATAATTAGCTCTAT(Tetanus toxin C gene)；破伤风梭菌TTC-2特异性探针CTTTTAGGGATTTATC(Tetanus toxin C gene)。
12.用于权利要求9所述检测方法的DNA芯片，其探针阵列设计如下在一显微镜载玻片表面分两行构建14个区域位点(5mm×5mm)，将每个位点顺序排列金黄色葡萄球菌Sau-1、Sau-2特异性探针；沙门菌SAl-1、SAl-2特异性探针；志贺菌Shi-1、Shi-2、Shi-3、Shi-4特异性探针；大肠埃希菌Eco-1、Eco-1；铜绿假单胞菌Pae-1和破伤风梭菌TTC-1、TTC-2特异性探针，每一探针的点样面积约为1.5mm×1.5mm。
13.根据权利要求12的DNA芯片，其预先合成好的特异性单股DNA探针是通过微量点样针器直接物理接触固定于所述的特定区域位点上。
14.一种可用于权利要求9所述检测方法的PPDC试剂盒，其组成包括芯片 5片杂交盖玻片10片dNTP/PCR引物系列混各10ul合液(引物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、M、N、O)2x杂交缓冲液 500ul用于药品中主要病原微生物DNA的PCR扩增的引物，其中包括用于扩增金黄色葡萄球菌DNA的引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于扩增沙门菌DNA的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；用于扩增志贺菌DNA的引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；用于扩增大肠埃希氏菌DNA的引物序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；用于扩增铜绿假单胞菌DNA的引物序列SEQ ID NO.11。
全文摘要
本发明描述了一种利用聚合酶链式反应(PCR)技术检测药品中主要病原微生物的方法，特别涉及一种利用聚合酶链式反应特异性扩增主要病原微生物的特定的基因片段来检测药品中主要病原微生物的方法，和用于PCR的新的核酸引物，引物所扩增的基因片段可以用于检测药品中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌，以及涉及用于检测PCR产物的探针和DNA芯片以及包含该DNA芯片的试剂盒。
文档编号C12Q1/04GK1514022SQ0313764
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者胡昌勤, 马越, 李景云, 张力, 张新妹 申请人:中国药品生物制品检定所