专利名称：动物脑酶解产物及其制备方法和医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物脑酶解产物及其制备方法，更尤其本发明披露了一类来自动物脑水解物的寡肽序列，这些寡肽序列为His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys及Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu。它们来自动物脑酶解产物，具有类似脑活素的生理活性，可用于治疗神经退行性疾病及脑损伤等。
背景技术：
脑活素由于可以促进蛋白质合成，而被临床用于治疗各种脑外伤。脑活素可以帮助保持神经元线粒体的完整，在临床上用于治疗各种与神经系统相关的疾病，例如治疗阿尔茨海默病一类的神经退行性疾病、治疗老年人的脑动脉硬化和脑动脉功能障碍。脑活素的广泛药理作用还使它对小儿急性偏瘫、卒中后痴呆、橄榄体萎缩、脑桥萎缩和小脑萎缩等脑疾病亦有明确疗效。
脑活素在奥地利、日本、德国、英国、罗马尼亚以及前苏联均有生产，我国依赖进口。各国厂家生产的脑活素都是动物脑组织的提取物，由大约75％游离氨基酸和25％寡肽构成。在脑活素40多年的临床应用中，报道了大量基础和临床研究工作(M.Hartbauer，B.Hutter-Paiter，G.Skofitsch andM.Windish Antiapoptotic effects of the peptidergic drug Cerebrolysinon primary cultures of embryonic chick cortical neurons.J.NeuralTransm.2001，108(4)，459-473；Francois Torreilles，Jaeques TouchonPathogenic theories and intrathecal analysis of the sporadic form ofAlzheimer’s disease.Progress in Neurobiology，2002，66，191-203；Gorbachevskaya N，Bashina V，Gratchev V，et al.Cerebrolysin therapyin Rett syndromeclinical and EEG mapping study.BRAIN DEV-JPN，2001，Suppl.1，S90-S93；Ruether E，Husmann R，Kinzler E，et al.A 28-week，double-blind，placebo-controlled study with Cerebrolysin in patientswith mild to moderate Alzheimer’s disease.INT CLIN PSYCHOPHARM，2001，16(5)，253-263；Yermackova N，Krasnov V Antioxidant effect ofcerebrolysin therapy of psychoorganic syndrome.EUR PSYCHIAT，2000Suppl.2(15)，435S-435S；Satou T，Itoh T，Tamai Y，et al.Neurotrophiceffects of FPF-1070(Cerebrolysin(R))on cultured neurons from chickenembryo dorsal root ganglia，ciliary ganglia，and sympathetic trunks.J NEURAL TRANSM，2000，107，1253-1262；Alvarez XA，Lombardi VRM，Fernandez-Novoa L，et al.Cerebrolysin (R)reduces microglialactivation in vivo and in vitroa potential mechanism ofneuroprotection.J NEURAL TRANSM，2000，SUPP(59)，281-292；WindischM Approach towards an integrative drug treatment of Alzheimer’sdisease.J NEURAL TRANSM，2000，SUPP(59)，301-313；Alvarez XA，LombardiVRM，Corzo L，et al.Oral Cerebrolysin(R)enhances brain alpha activityand improves cognitive performance in elderly control subjects.JNEURAL TRANSM，2000，SUPP(59)，315-328.)。这些成就不仅使发明人认识到脑活素组成的复杂性，也为它的进一步研究保留了一个较大的空间。
我国在动物脑(尤其是猪脑)水解物的生理应用方面也做了很多工作，已经发现我们自己制备的猪脑水解物具有脑活素的功能。已有的对脑活素的功能及其构成复杂性的报道使发明人认识到，确定猪脑水解物的活性部位，进而确定其中的活性寡肽有明显的重要性。
发明内容
发明概述因此，本发明的一个目的是提供动物脑酶解产物，该产物用包括以下步骤的方法来制备将新鲜动物脑组织脱脂，脱脂后的动物脑粉末在酸性蛋白酶的作用下在酸性环境中酶解，酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用凝胶色谱法纯化，冻干，获得动物脑酶解产物。
本发明的另一个目的是提供制备动物脑酶解产物的方法，包括
将新鲜动物脑组织脱脂，脱脂后的动物脑粉末在酸性蛋白酶的作用下在酸性环境中酶解，酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用凝胶色谱法纯化，冻干，获得动物脑酶解产物。
本发明的又一个目的是提供由以上方法获得的包括寡肽His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys及Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu的动物脑酶解产物。
本发明的再一个目的是提供由以上方法获得的具有脑活素活性的寡肽His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys或Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu。
本发明的还有一个目的是提供上述动物脑酶解产物或活性寡肽在制备治疗神经系统疾病如神经退行性疾病，脑损伤，脑动脉硬化，脑动脉功能障碍，小儿急性偏瘫，卒中后痴呆，橄榄体萎缩，脑桥萎缩和小脑萎缩等的药物中的用途。
本发明中所述的动物包括猪，牛，羊，人等。
本发明的详细描述发明人经过反复实验发现，通过将新鲜动物脑组织脱脂，脱脂后的动物脑粉末在酸性蛋白酶的作用下在酸性环境中酶解，酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用凝胶色谱法纯化，冻干，获得了具有强的脑细胞保护作用的动物脑酶解产物。
新鲜动物脑组织可以在索氏提取器中用丙酮和乙醚脱脂。
酶解优选用酸性蛋白酶在pH2-4，优选约pH3，在35-50℃，优选约45℃下进行30-72小时，优选约48小时。
酶解过程中可用冰乙酸保持酶解物的酸性环境。
得到的酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，得到的残留物用Sephadex G-15柱分离，用洗脱液(纯净水或稀醋酸溶液)洗脱(流速5-12ml/hr)，收集到七种馏分F1-F7。各馏分经冷冻干燥，得到七种对应的冻干粉FD1-FD7。七种组分经细胞模型MPP+(适用于神经系统疾病的研究)筛选，确定活性最强的FD2为活性部位。
如图2和图3所示，发明人比较了脱脂猪脑酶解物和FD2的高效液相色谱结果，确认了Sephadex G-15分离确实相当程度上纯化了该酶解物。发明人对FD2进行了LC/ESI/MS/MS分析，确定了FD2中包含了五种多肽。发明人采用质谱检索工具MASCOT(http//www.matrixscience.com)确定了与五种多肽质谱数据对应的序列为His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys及Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu的寡肽。发明人检索了1962年至2002年的CA，认识到这些序列都未见文献报道。
用上述酶解产物进行活性实验，证明了本发明的酶解产物具有脑细胞保护作用，从而本发明的酶解产物或寡肽具有在制备治疗神经系统疾病如神经退行性疾病，脑损伤，脑动脉硬化，脑动脉功能障碍，小儿急性偏瘫，卒中后痴呆，橄榄体萎缩，脑桥萎缩和小脑萎缩等的药物中的用途。
本发明的动物酶解产物或寡肽可以单独使用，或以药物组合物的形式使用，药物组合物中可以含有制药领域中常用的载体和其它添加剂。本发明的动物酶解产物或寡肽可以制成非肠道给药方式或经肠道给药方式的适宜剂型。制备这些剂型的方法对本领域的普通技术人员来说是公知的。
附图1为紫外检测仪记录的脱脂猪脑酶解物Sephadex G-15柱色谱图，图中的七个峰对应馏分F1-F7；附图2为脱脂猪脑粉酶解物高效液相色谱图；附图3为馏分F2的高效液相色谱图，从附图2和附图3可以看到F2的纯度明显高于脱脂猪脑粉酶解物的纯度；附图4为质谱的总离子流图，图中保留时间为11.7分、13.7分、15.1分、16.2分和17.1分的五个峰为F2含的五种寡肽；附图5为F2中含的五种寡肽的质谱数据；和附图6为本发明酶解产物的制备及活性部分确定的流程图。
具体实施例方式
本发明用以下实施例进一步解释本发明。这些实施例仅仅是例证性的，决不含有任何限制本发明的含义。
实施例1脱脂猪脑粉的制备、酶解和酶解粉的分离如附图6所示，50g新鲜猪脑剔除脂肪及筋膜后搅碎，用滤纸包裹成长筒状，置100ml索氏提取器中，用500ml丙酮脱脂，10小时后取出滤纸筒，展开，捣开猪脑碎块，再裹成长筒状，继续脱脂10小时。取出滤纸筒，展开并捣碎。再用乙醚重复以上操作，得到的脱脂猪脑粉晾干，重20g，呈类白色。
在圆底烧瓶中，将50g脱脂猪脑粉与0.5g酸性蛋白酶及250ml去离子水混合。混合物用冰乙酸调pH3后于40-45℃搅拌24小时，期间每隔1小时测一次pH，并酌情不断补加冰乙酸，使酶解物的pH保持3。酶解物加热使沸腾30分钟，然后降至室温。酶解物过滤，滤液在60℃减压浓缩至50ml后抽滤。滤液冷冻干燥，得到40g酶解粉，为类白色絮状物。
500mg酶解粉用0.5ml醋酸水溶液(5％)溶解，得到的清澈溶液缓慢加到Sephadex G-15柱上(600mm×16mm)，用超纯水或5％醋酸洗脱(流量为5ml/hr)。用紫外检测仪(波长280nm)监控，如图1所示，收集到七种馏分。得到的馏分分别冷冻干燥，得到七种冻干粉。其中FD134.8mg、FD284.6mg、FD3250.0mg、FD420.7mg、FD55.6mg、FD63.8mg、FD70.9mg。
实施例2酶解粉的活性取大鼠小脑颗粒细胞，进行细胞模型MPP+实验，该模型适用于神经系统疾病的研究，以1×106个细胞/cm3接种于预先用10mg/l的多聚赖氨酸覆盖的96孔板中，200l/孔，置于37℃含5％(体积分数)CO2的培养箱中培养。24hr后更换为含10mol/l阿糖胞苷的培养液，以抑制非神经细胞的增殖。实验分为阳性对照组、模型组和FD1-FD7样品大、中两个剂量组，每组设6个孔。于培养第四天，FD1-FD7样品组分别加入终浓度为50g/ml、25g/ml的FD1-FD7样品溶液，阳性对照组加入500ng/ml的表皮生长因子(EGF)；加药24小时后，模型组和FD1-FD7样品组分别加入终浓度为100mol/l的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)，阳性对照加入等体积的培养基；37℃含5％(体积分数)CO2的培养箱中继续培养24hr后，取出96孔板，向每孔中加入20L 5mg/mL的四甲基偶氮唑盐(MTT)，其终浓度为0.5mg/ml，反应4hr后，吸去培养液，向每孔中加入200l的二甲基亚砜(DMSO)，轻轻吹打，使蓝色颗粒溶解，用全自动酶标仪在波长570nm处测其光密度值。实验重复三次，光密度值高表明细胞存活数高。每组设6个复孔，实验结果见附表1酶解粉活性测定结果表。表中的结果以均值±标准差(X±sd)表示；差异显著性用配对t检验。
附表1酶解粉活性测定结果表
##P＜0.01 VS normal；P＜0.05 VS model；**P＜0.01 VS model；***P＜0.001 VS model.
从表中可以看出FD2、FD1、FD4、FD6、FD7、FD5都有一定的细胞保护作用，其中以FD2的活性最强。
实施例3质谱检测将FD2冻干粉配制成1.0mg/ml的样品溶液在液质联用仪器上进行检测。获得了如图4所示的质谱的总离子流图和如图5所示的五个多肽的质谱数据图。
实验仪器Agilent 1100series，1100series LC/MSD Trap色谱柱ZORBAX 300SB-C18 2.1mm×15cm粒径5m(HP公司产品)流动相A0.5％甲酸水溶液 B乙腈液相色谱梯度Time/min B％0 10.02.0 10.035.0 55.040.0 75.045.0 90.0流速0.4ml/min紫外检测波长210nm质谱参数设置离子模式 正离子离子源 ESI干燥气温度 350℃雾化气压力 35.00psi载气流量 9.001/min喷雾电压 3500Vm/z离子流范围100-2000实验确定了FD2中包含了五种多肽并分别得到了这五种多肽的质谱数据。
实施例4推测可能的氨基酸序列将液质联用仪器检测出的五种多肽的质谱数据分别通过检索工具Mascot(http//www.matrixscience.com)进行检索。
检索过程中分别应用了五个数据库，并选择五个数据库均有的结果，以保证所得结果的准确性。
检索过程中选用参数如下
搜索类型 Sequence Query数据库 NCBInr/MSDB/SWISSPROT/OWL/RANDOM物种 哺乳动物修饰变化 氧化(M)质量值 单一同位素肽质量误差 ±1Da肽带电荷状态 1+，2+，3+最大酶未切开数 1实验仪器 ESI-TRAP经过数据检索，确定了与五种质谱数据对应的序列为His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys及Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu。
权利要求
1.动物脑酶解产物，该产物用包括以下步骤的方法来制备将新鲜动物脑组织脱脂，脱脂后的动物脑粉末在酸性蛋白酶的作用下在酸性环境中酶解，酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用凝胶色谱法纯化，冻干，获得动物脑酶解产物。
2.根据权利要求1的动物脑酶解产物，包括寡肽His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys及Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu。
3.制备动物脑酶解产物的方法，包括将新鲜动物脑组织脱脂，脱脂后的动物脑粉末在酸性蛋白酶的作用下在酸性环境中酶解，酶解物过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用凝胶色谱法纯化，冻干，获得动物脑酶解产物。
4.具有脑活素活性的寡肽，选自His-Ala-Leu-Leu-Leu、Ala-His-Leu-Leu-Ile、Met-Leu-Leu-Ser-Cys、Ala-His-Leu-Leu-Leu、His-Ala-Ile-Leu-Ile、Ala-His-Leu-Ile-Leu、Asn-Glu-Asp-Leu-Cys-Ser、Asn-Glu-Asn-Asn-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Ile-Leu-Ile-Ser-Cys、Lys-Asp-Asn-Leu-Leu-Ile-Ser-Cys或Gln-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu。
5.权利要求1或2的动物脑酶解产物在制备治疗神经系统疾病的药物中的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述神经系统系统疾病为神经退行性疾病，脑损伤，脑动脉硬化，脑动脉功能障碍，小儿急性偏瘫，卒中后痴呆，橄榄体萎缩，脑桥萎缩或小脑萎缩。
7.权利要求4的寡肽在制备治疗神经系统疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中所述神经系统系统疾病为神经退行性疾病，脑损伤，脑动脉硬化，脑动脉功能障碍，小儿急性偏瘫，卒中后痴呆，橄榄体萎缩，脑桥萎缩或小脑萎缩。
9.根据权利要求1或2的动物脑酶解产物，其中所述动物包括猪，牛，羊，人等。
10.权利要求3的制备动物脑酶解产物的方法，其中所述动物包括猪，牛，羊，人等。
全文摘要
本发明涉及动物脑酶解产物及其制备方法，更尤其本发明披露了一类来自动物脑水解物的寡肽序列，这些寡肽序列为His－Ala－Leu－Leu－Leu、Ala－His－Leu－Leu－Ile、Met－Leu－Leu－Ser－Cys、Ala－His－Leu－Leu－Leu、His－Ala－Ile－Leu－Ile、Ala－His－Leu－Ile－Leu、Asn－Glu－Asp－Leu－Cys－Ser、Asn－Glu－Asn－Asn－Ile－Ser－Cys、Lys－Asp－Asn－Ile－Leu－Ile－Ser－Cys、Lys－Asp－Asn－Leu－Leu－Ile－Ser－Cys及Gln－Pro－Leu－Leu－Leu－Leu－Leu－Pro－Leu。它们来自动物脑酶解产物，具有类似脑物素的生理活性，可用于治疗神经退行性疾病及脑损伤等。
文档编号C12P21/02GK1566358SQ03137969
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者徐秉玖, 彭师奇, 张晓楠, 王超, 赵明, 陈阳 申请人:北京北医投资管理有限公司医药科技开发分公司