专利名称：西伯利亚灵芝及其抗Hiv和消除自由基功能的制作方法
在俄罗斯寒冷的西伯利亚北部山区，生长着茂密的白桦林和岳桦林，狩猎的猎人在追捕猎物的同时开枪误伤了白桦树的躯干，白桦树为了保护伤口的感染和抵御寒冷侵袭，渐渐长起了一个类似伞状的菌核体，最大达10kg之多，这就是所谓的愈伤组织。当地的狩猎人最早发现它具有强身健体的功能。
本发明的高活性抗Hiv制剂[特开平9-191891]，就是在上述背景的基础上发生、发展的。该抗Hiv制剂号称西伯利亚灵芝其学名为Fuscoporia obliqual，本发明利用西伯利亚灵芝的水提取物和组织培养的提取物(Fuscoporia obliqual’s extract缩写为FOE)进行急性毒性、抗Hiv体外试验。
1、西伯利亚灵芝的组织培养1.1 实施例1模拟白桦林的环境、通风、微弱的斜阳、恒湿、PH＝6-6.5，培养基为白桦木屑，将西伯利亚灵芝的菌核体接种在木屑上，温度在25-30℃。在培养箱中光照为40W日光灯连续培养48小时，收集木屑和长出的斑点似的灵芝。
1.2 实施例2将上述木屑和灵芝用100℃水煮沸20分钟后，过滤，滤液减压浓缩，放入红外线烤箱在50℃以下烤干，粉碎，过80目筛网，按1kg/袋包装成产品(见附
图1)称FOE原粉。
2、天然西伯利亚灵芝的提取2.1 实施例3取10g野生西伯利亚灵芝在60℃烤箱中烤干，粉碎成40目，取5g加入滤纸筒中置于索氏提取皿的中间回流渠中，然后再从冷凝管中加入100ml 95％的乙醇加热回流2小时，直至深棕色逐渐转入底层的平底烧瓶中。乙醇呈澄明状态，将底层的平底烧瓶乙醇提取液制成干粉(附图2)切下换成干净的空瓶，从冷凝管上端加入100ml无离子水，加热回流2小时，直至平底烧瓶中呈深棕色溶液，称为FOE水溶液，然后制成干粉(见附图3)。
3、FOE原粉和FOE溶液的急性毒性试验3.1.1 大鼠急性毒性试验按霍恩氏法。选取Wistar健康成年大鼠40只，分成四组，每组10只，雌雄各半。平均体重雌性大鼠为202.1(190-217)克，雄性大鼠为200.9(181-216)克。样品经研磨成粉状后用蒸馏水配制成溶液，一次灌胃给受试物，剂量为10.00、4.64、2.15、1.00g/kg，每100克体重灌胃量为1ml，观察十四天内动物中毒反应和死亡情况。
3.1.2 结果大鼠急性毒性试验结果见表3-1。在观察期间内各组大鼠均未见异常反应，生长情况良好，无死亡发生，动物终重雌性为218.6(206-231)克，雄性为218.7(198-233)克。经查表受试物大鼠经口LD50雄、雌性均大于10g/kg，根据急性毒性分级标准属实际无毒。
表3-1 对大鼠的急性毒性
3.2.1 小鼠急性毒性试验按霍恩氏法。先取昆明种健康小鼠40只，分成四组，每组10只，雌雄各半。平均体重雌性小鼠为19.7(18.4-21.5)克，雄性小鼠为19.6(18.1-21.5)克。样品用蒸馏水配制成溶液，一次灌胃给受试物，剂量为10.00、4.64、2.15、1.00g/kg，每20克体重灌胃量为0.4ml，观察十四天内动物中毒反应和死亡情况。
3.2.2 结果小鼠急性经口毒性试验结果见表3-2。在观察期间内各组小鼠均未见异常反应，生长情况良好，无死亡发生，小鼠终重雌鼠为28.4(26.1-30.8)克，雄鼠为29.3(26.5-32.8)克。经查表受试物大鼠经口LD50雄、雌性均大于10g/kg，根据急性毒性分级标准属实际无毒。
表3-2 对小鼠的急性毒性
4、FOE原粉和FOE溶液体外抗Hiv试验分别从健康哺乳动物和被感染Hiv的哺乳动物中采集淋巴细胞各50％混合分成7个组，在96孔微型细胞培养板上，每组9个孔，其中1组为阳性对照组不加FOE，其余6组为试验组加FOE；在PH为6-6.5、温度为35℃的培养基(蛋白胨1g、糖蜜0.5g、琼脂1.5g)上在恒温恒光照(40W日光灯)培养箱中培养72小时后，观察被感染Hiv的淋巴细胞死亡率和健康淋巴细胞组增殖率并进行生物统计如表4-1。
表4-1 *实验组与阳性对照组比较**以被感染淋巴细胞的50％为基准，例如35％即实际死亡率为70％***指健康细胞增殖率，例如85％即原健康细胞为50％又增殖到85％，实际增殖25％，也就是Hiv细胞死亡率25％5、FOE醇溶液浓缩成FOE原粉消除自由基试验5.1 实施例4将FOE原粉溶于乙醇溶液，浓度为30mg/mlDPPH(1.1-二苯基-2-苦基肼自由基)0.5mM浓度的乙醇溶液2.25ml，100mM tris缓冲液(PH＝7.4)2.25ml，然后加入FOE乙醇溶液10-30ml，在暗处反应30分钟，在517mM吸光度达到极大吸收消失时求出FOE的添加量，其添加量为2200μg。作为阳性对照组，在维生素C、胱氨酸水溶液，一旦用维生素E乙醇溶液测定消除的活性，分别是80μg、120μg、200μg。
5.2 实施例5在动物体内消除自由基试验FOE对四氯化碳损坏肝的预防作用FOE原粉经口服被吸收状态时，为了证明发现了FOE在生物体内的抗氧化作用，探讨FOE的四氯化碳损坏肝的预防效果。
用5周的ICR10只，雌雄各半驯养1周后，在粉末饲料中加入FOE原粉制成混合饲料，自由摄取，经3日后，用花生油将1μl四氯化碳稀释至0.2ml灌胃(1μl/ml)24小时后采血，测定血浆的GOT、GPT，将FOE原粉试验组与阳性对照组比较P值，其P值＜0.05以下者为有显著效果，试验结果如表5-1所示。
表5-1
*P＜0.05**P＜0.016、结论6.1 西伯利亚灵芝醇提取物具有极高的抗氧化能力(即消除自由基的功能)6.2 西伯利亚灵芝水提物富含多糖(B-D-葡聚糖)，仅生药中含B-D-葡聚糖为8.5％。具有极强的抑制Hiv的效力。初步研究可能的抗Hiv的机理为B-D-葡聚糖切断Hiv病毒与其蛋白合成酶的联系，被阻断而凋亡。
权利要求
1.本发明发现FO及其组织培养物用乙醇或水的提取方法，它具有抗Hiv和消除自由基的用途；
2.根据权利要求1所述，FOE水溶液或原粉作为抗Hiv的制剂而FOE醇溶液作为抗自由基的制剂；
3.根据权利要求1所述，组织培养的条件为PH5.5-6.5，温度20-35℃及其指定的培养基；
4.根据权利要求1所述，FOE醇溶液回流温度75-80℃，FOE水提取回流温度为95-105℃；
5.根据权利要求1所述，作为高效抗Hiv的制剂为临床实际用量以FOE量计从5mg/ml-25mg/ml均具有高效抗Hiv的功能，随剂量增加药效呈线性关系；
6.健康哺乳动物与被感染Hiv的淋巴细胞中加入FOE(水性)混合培养后健康的淋巴细胞增值加速而感染Hiv的淋巴细胞被杀死；
7.水性FOE原粉作为自由基消除剂用于医药、食品、饮料、化妆品领域口服10mg-1000mg/日，外用为0.01-10％。
全文摘要
本发明发现的西伯利亚灵芝(学名Fuscoporiaobliqual缩写号FO)及其组织培养的提取物即使超低浓度，也具有活性极高的抗Hiv和消除自由基的功能，可以广泛用于医药、保健食品、饮料工业企业及其相关的营销策划公司开发新产品。
文档编号A23L1/30GK1579534SQ0314999
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者丁庆 申请人:北京君阳爱玛科技有限公司