专利名称：一种固定化酶介孔反应器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物大分子蛋白酶的固定化技术，主要涉及一种固定化酶介孔反应器及其制备方法。
背景技术：
酶固定化是将酶固定在载体上，以解决反应后的酶与底物分离、回收和重复使用等问题。固定化酶的方法大体上可以分为两大类，一类是物理法，另一类是化学法。物理法是指酶与载体以较弱的作用力相互作用，这种弱的相互作用不会使酶的三维构象转换受到限制，因而不会影响酶的活力，但这种弱相互作用在催化反应中不可避免地会造成酶的流失，使酶活降低。化学法是指酶与载体以共价键等较强的作用力相互作用，虽然强相互作用可降低酶的流失，但同时导致酶的三维构型自由度降低，致使酶与底物作用时，酶的构象不能发生适当转换以适应底物的构型，即酶的活性位与底物的作用点不能发生有效的契合，从而导致酶活降低。一直以来，人们都在寻找有效的固定化酶方法。
自1992年介孔材料问世以来，引起了人们的高度关注。介孔材料具有比表面积高和孔径分布均一等特点，以介孔材料作为载体，可大幅度提高酶在载体上的负载量；另外，介孔材料表面多富含羟基，可以借助一定的相互作用提高酶在载体上的稳定性，所以介孔材料作为一类酶固定化的优良载体得到了重视。
文献1Humphrey H.P.Yiu，Paul A.Wright，Nigel P.Botting，Microporous and Mersoporous Materials 44-45，763，2001介绍了直接将胰岛素固定在MCM-41、MCM-48、SBA-15不同孔径大小的介孔材料中，实验结果表明，酶在介孔材料中的固定化效率可以达到90％。说明介孔材料很适合作为酶固定化的载体。但是当该固定化酶的介孔材料经长时间反应后还是有大量的酶流失，其流失的程度与介孔材料的孔径直接相关。对于小孔径的介孔材料，如果酶分子大于该介孔材料的孔径，则酶分子无法进入介孔内只能附着于孔的外表面，所以导致酶大量的流失；对于大孔径介孔材料，虽然酶分子易于进入孔内，但反应时酶也易于从敞开的孔口流失。
为了减少大孔径介孔材料固定化酶反应时酶的流失，文献2Diaz J.F.，Balkus K.J.，J.Mol.Catal.BEnzymatic 2，115，1996提出了用硅烷偶联剂来进行介孔材料的孔口改性，以达到缩小介孔材料孔口的目的。其先将细胞C固定在介孔材料MCM-41(孔径4nm)上，再用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷在其孔口进行接枝使孔口缩小。该接枝的方法有效减少了酶的流失，保持了酶活的稳定。但该方法仅适于采用孔径小于4nm的介孔材料固定酶分子尺寸小于4nm的小分子酶，如细胞C、木瓜蛋白酶、胰岛素和枯草杆菌蛋白酶等。当介孔材料的孔径大于4nm，由于该接枝方法使孔口缩小程度小，所以仍会有固定上的酶大量流失的现象。
发明内容
本发明的目的是，为了使介孔材料固定化酶适用于各种酶，并且使介孔材料更有效地固定化酶，避免反应过程中酶的流失，提出利用接枝、聚合手段对固定化酶介孔材料的孔口进行网状封口，构建一种介孔反应器。
本发明先将介孔材料加到游离酶的溶液中得到固定化酶的介孔材料(IME-MMM)；再将硅烷偶联剂接枝到固定化酶介孔材料的孔口周围，然后用热引发剂使硅烷偶联剂所含的双键进行聚合，形成的网状链将固定化酶介孔材料的孔口封住或缩小，这种孔口被网状封住或缩小的固定化酶介孔材料被叫做介孔反应器。
该介孔反应器具体制备步骤如下A.将酶、缓冲液按照质量/体积比为1∶5～7(g/l)的比例加到三口瓶中，按缓冲溶液体积3～4倍的量加入去离子水，混合均匀；再将介孔材料(或载体)按酶∶载体＝1∶1～2的质量比加入锥形瓶，摇均后封住锥形瓶的瓶口，置于0～30℃的摇床中，保持摇床震荡速率100～200r/min震荡6h～24h，得到固定化酶载体(IME-MMM)。
B.将硅烷偶联剂按10～20ml/g的比例溶入有机溶剂，配制硅烷偶联剂溶液。
C.将步骤A得到的IME-MMM用冷丙酮充分洗涤以去除其中的水分，然后置于四口瓶中，将四口瓶置于50℃～90℃的水浴锅内，在通N2气保护的条件下，加入硅烷偶联剂溶液，硅烷偶联剂溶液的加入量按硅烷偶联剂IME-MMM＝4～6∶1的比例确定，边加入边进行电磁搅拌，在四口瓶的上方装有冷凝器使蒸发的溶剂回到四口瓶中，反应进行2～8h，得到孔口接枝硅烷偶联剂的固定化酶介孔材料。
D.向步骤C的四口瓶再加入热引发剂，保持水浴锅温度为50℃～90℃，使硅烷偶联剂含有的双键进行聚合，热引发剂的用量为硅烷偶联剂用量的1～3wt％.聚合反应进行6～16h后停止、冷却，将产物用冷丙酮溶液充分洗涤去其中的水分，得到介孔反应器。
步骤A所用的介孔材料应是孔径分布均一的一维或三维的直通孔结构材料，可选用SBA-15、MCM-41、MCM-48或FSM中的一种；优选SBA-15。
所用的酶是具有球形或椭圆形外形，溶于水且分子尺寸在3.7nm以上的酶，可选猪胰脂肪酶、辣根过氧化酶、球蛋白酶、胰岛素中的一种。
所用的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，缓冲值范围在PH＝7～8，每一种酶都有其最佳的缓冲值。缓冲液的加入是为了使酶更好地发挥催化效果。
步骤B所用的硅烷偶联剂是含有较长的烷基链且在烷基链的端头含有双键的硅烷，可选r-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(商品名KH-570)、7-辛基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷(商品名A-171)或乙烯基三乙氧基硅烷(商品名A-151)中的一种。优选KH-570或7-辛基三甲氧基硅烷；所用的有机溶剂是能溶解所用硅烷偶联剂的非极性溶剂，可选庚烷、辛烷、苯、甲苯、二氯甲烷之一。
步骤C所用的热引发剂可以是偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化二苯甲酰(BPO)、过氧化十二酰、异丙苯过氧化氢、过氧化特戊酸特丁酯中的一种，优选AIBN和BPO。
分别对步骤C和步骤D得到的产物进行低温N2吸-脱附等温线测定，得到图2、图3所示的等温线。通过图型可以看出，步骤C得到的介孔材料仍是一维的孔状结构，而步骤D得到了肚大口小的形状，即瓶颈状结构。
通过对介孔反应器样品的结构特征分析表明介孔反应器仍具有很好的长程有序结构，其孔口直径远小于酶分子的大小，因此酶分子被稳定地固定在介孔材料内，不易随反应的进行而流失。
用以上方法制备的介孔反应器的微观结构如图1所示，酶分子被固定在介孔材料内，介孔材料的孔口由于硅烷偶联剂聚合形成的链网结构而被缩小，使得介孔材料的孔口直径远小于酶分子的大小，该方法可以根据载体孔径的大小而进行各种尺寸酶分子的固定化。通过调变硅烷偶联剂的链长而达到有效地缩小孔口的目的，因此这个方法更适合为数众多的大分子酶的固定化。
用文献1的方法制备出固定化酶介孔材料IME-MMM(样品1)，用文献2的方法制备出孔口接枝的IME-MMM(样品2)，与本发明实施例1～3制备出介孔反应器进行酶活稳定性的对比测定。将上述三个样品分别在常温下，放于磷酸缓冲液里搅拌3～5h后进行酶活的测定，测定的具体方法为在37℃恒温的条件下，以浓度6.8％的三乙酸甘油酯为底物，反应10min后取出样品进行离心分离，分离后得到的滤液以酚酞作为指示剂，用NaOH进行滴定，从而计算出第一次反应的酶活；分离后得到的固体重复上述的测定方法，得到第二次反应的酶活，如此重复测定5次，测得的结果见表1。这种测定方法被称为间歇操作法。
表1.酶活稳定性对比测定
本发明具有如下显著效益本发明制备的介孔反应器仍孔口直径远小于酶分子的大小，使酶分子被稳定地固定在介孔材料内，可有效地抑制酶的流失，保持酶活的操作稳定性。本发明扩大了介孔材料作为酶固定化载体的应用范围，更进一步利用了介孔材料作为酶固定化载体的优点；同时也扩大了生物蛋白酶固定在介孔材料中的数量，使由原来仅有的小分子酶固定化而扩展为较大分子蛋白酶的固定化。
图1是介孔反应器微观结构模型示意图。
图2是一维直通孔道的介孔材料低温N2吸-脱附等温线图3介孔反应器形成后低温N2吸-脱附等温线
具体实施例方式实施例1A.称取0.25g猪胰脂肪酶(平均分子直径为4～5nm)充分溶于pH＝7.7的1.25ml磷酸缓冲液中，再加入49ml去离子水，混合后加入0.5g SBA-15载体(平均孔径为6.6nm)，封口后放于30℃的摇床中固定12h，摇床震荡速率保持150r/min。得到SBA-15固定化酶IME-SBA。
B.将3g KH-570硅烷偶联剂加入到30ml甲苯溶剂中并充分混合。
C.将步骤A得到的固定化酶IME-SBA，用冷丙酮充分洗涤至干，全部加入带有冷凝器的四口瓶中，在N2气保护下，将步骤B的硅烷偶联剂溶液加入四口瓶中，边加入边搅拌，持续3小时，得到孔口接枝上硅烷偶联剂的固定化酶介孔材料，简称IME-SBA-MA；D.再往上述反应液中加入0.03g引发剂AIBN，保持70℃的恒温使聚合反应进行8h，将得到的介孔反应器用冷丙酮溶液充分洗涤，在常温下放于pH＝7.7的15ml磷酸缓冲液里搅拌3h以保持其酶活性。
将得到的介孔反应器进行酶活稳定性测定，连续5次测得的该介孔反应器的酶活和固定化酶的相对活力见表1。
通过对介孔反应器的样品的结构特征分析，表明介孔反应器仍具有很好的长程有序结构；通过KH-570硅烷偶联剂上C＝O官能团在1702cm-1波数向高波数的移动，说明KH-570中的C＝C双键发生了聚合。通过介孔反应器形成后，等温线由原来的H1型滞后环转变为明显的H2型滞后环，表明介孔材料形成了具有肚大口小的形状(即瓶颈状结构)。并且其孔口直径为3.7nm。
实施例2将步骤B中的KH-570用辛基三甲氧基硅烷偶联剂代替，其它同实施例1。
将得到的介孔反应器进行酶活稳定性测定，连续5次测得的该介孔反应器的酶活和固定化酶的相对活力见表1。
实施例3将B步骤中的甲苯溶剂用二氯甲烷溶剂代替，其它同实施例1。
将得到的介孔反应器进行酶活稳定性测定，连续5次测得的该介孔反应器的酶活和固定化酶的相对活力见表1。
权利要求
1.一种固定化酶介孔反应器的制备方法，具体制备步骤如下A.将酶、缓冲液按照质量/体积比为1∶5～7(g/l)的比例加到三口瓶中，按缓冲溶液体积3～4倍的量加入去离子水，混合均匀；再将介孔材料按酶∶介孔材料＝1∶1～2的质量比加入锥形瓶，摇均后封住锥形瓶的瓶口，置于0～30℃的摇床中，保持摇床震荡速率100～200r/min震荡6h～24h，得到固定化酶载体IME-MMM；B.将硅烷偶联剂按10～20ml/g的比例溶入有机溶剂，配制硅烷偶联剂溶液；C.将步骤A得到的IME-MMM用冷丙酮充分洗涤以去除其中的水分，然后置于四口瓶中，将四口瓶置于50℃～90℃的水浴锅内，在通N2气保护的条件下，加入硅烷偶联剂溶液，硅烷偶联剂溶液的加入量按硅烷偶联剂∶IME-MMM＝4～6∶1的比例确定，边加入边进行电磁搅拌，在四口瓶的上方装有冷凝器使蒸发的溶剂回到四口瓶中，反应进行2～8h，得到孔口接枝硅烷偶联剂的固定化酶介孔材料；D.向步骤C的四口瓶再加入热引发剂，保持水浴锅温度为50℃～90℃，使硅烷偶联剂含有的双键进行聚合，热引发剂的用量为硅烷偶联剂用量的1～3wt％，聚合反应进行6～16h终止、冷却，将产物用冷丙酮溶液充分洗涤去其中的水分，得到固定化酶介孔反应器。
2.根据权利要求1所述的固定化酶介孔反应器的制备方法，其特征是步骤A所述的介孔材料应是孔径分布均一的一维或三维的直通孔结构材料；酶是具有球形或椭圆形外形，溶于水且分子尺寸在3.7nm以上的酶；缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，缓冲值范围在PH＝7～8；步骤B所述的硅烷偶联剂是含有较长的烷基链且在烷基链的端头含有双键的硅烷；有机溶剂是能溶解所用硅烷偶联剂的非极性溶剂。
3.根据权利要求2所述的固定化酶介孔反应器的制备方法，其特征是步骤A所述的介孔材料可选用SBA-15、MCM-41、MCM-48、FSM中的一种；酶可选用猪胰脂肪酶、辣根过氧化酶、球蛋白酶、胰岛素中的一种；步骤B所述的硅烷偶联剂可选用r-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷、7-辛基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷中的一种；有机溶剂可以是庚烷、辛烷、苯、甲苯、二氯甲烷中的一种；步骤C所述的热引发剂可以是偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰、过氧化十二酰、异丙苯过氧化氢、过氧化特戊酸特丁酯中的一种。
4.根据权利要求2、3所述的固定化酶介孔反应器的制备方法，其特征是步骤A所述的介孔材料优选SBA-15；步骤B所述的硅烷偶联剂优选r-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷、7-辛基三甲氧基硅烷；步骤C所述的热引发剂优选偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰。
5.一种固定化酶介孔反应器，主要技术特征是该反应器是采用权利要求1所述的制备方法制备得到的。
6.根据权利要求5所述的固定化酶介孔反应器，其主要特征是该介孔反应器的微观结构如图1所示，酶分子被固定在介孔材料内，介孔材料的孔口由硅烷偶联剂聚合形成的链网结构被缩小，介孔材料的孔口直径远小于酶分子的大小。
全文摘要
本发明介绍了一种用于酶固定化的介孔反应器及其制备方法，这种介孔反应器主要是在介孔材料孔内固定化酶，即利用介孔材料较大的孔径，通过孔内表面羟基基团与酶分子羧基氧原子相互作用，将酶分子固定在孔道内；再利用接枝技术将硅烷偶联剂接枝在介孔材料的孔口处；最后利用聚合硅烷偶联剂末端的双键聚合，在孔口处形成网状结构。通过这种方法制备的介孔反应器可以有效地将载体的孔口缩小，在抑制酶分子流失的同时还不会对底物和产物造成传质阻力，因而得到具有高催化活性和高操作稳定性的固定化酶。
文档编号C12M1/00GK1580233SQ03150039
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者段雪, 马辉, 何静 申请人:北京化工大学