专利名称：一种银染方法
技术领域：
本发明涉及一种银染方法。
背景技术：
分子生物学实验中，对DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的鉴定方法的建立都力求获得高灵敏度，同时操作简单，结果便于观察。DNA区带的染色，较常用的是溴化乙锭(EB)染色，结合道DNA分子上的EB被紫外照射激发产生荧光而达到观测目的，尽管这种方法操作简便快速，并且能够满足大多数实验要求的灵敏度，但是它有两点不足之处，(1)EB的致癌作用使得对凝胶的操作和处理变得复杂起来；(2)需要合适的紫外照射对核酸还具有二聚体化和畏缩作用。
为了克服上述缺点，发展了具有很高灵敏度的银染方法。银染方法的建立，始于1979年，如Switzer在文献1Switzer R.C.，Merrill C.R.，Shifrins.A highly sensitive silverstain foe detecting proteins and peptides in poluacrylamide gels.Anal Biochem，1979，98231中所述，其对蛋白进行了染色。1981年，此技术又被应用于核酸，如文献2Merril，C.R.，Goldman.D.，Sedman，S.A.，and Ebert，M.H.Sceince211，1981，1437-1438中所述。银染法对蛋白质与核酸的检测灵敏度均可达到纳克水平，促进了生物大分子结构与功能的研究。如今，银染法已经成为国内外众多实验室最为常用的检测方法之一。
通常，银染过程包括固定、银染、洗脱、显色和终止。电泳完毕后，首先用固定剂将核酸或蛋白质固定到凝胶上，然后是银染剂中的银离子与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原从而发生银棕色显色反映。根据银染所用的银试剂，可分为以酸性形式存在的硝酸银染色方法和以碱性形式存在的银氨染色方法，其中又以硝酸银染色方法更为普遍。
在文献3Carlos J.S.，Emmamuel D.N.，Andrew F.G Rapid silver staining and recoveryof PCR products separated on polyacrylamide gels.Biotechniques，1994，17(5)914中，Carlos采用10％的乙醇和0.5％的乙酸固定3min；再用10％乙醇、0.5％乙酸0.5％、0.2％硝酸银银染5min；经去离子水洗脱后，然后用32％氢氧化钠、0.12％甲醛显色5min；最后用10％乙醇、25％乙酸终止。
在文献4 Brannt J.B.，Gustavoca，Peter M.G Fast and sensitive silver staining of DNAin polyacrylamide gels.Anal Biochem.1991，19680中，Brant采用10％的乙醇固定3min；再用0.1％硝酸银、37％甲醛银染30min；经去离子水洗脱后，然后用30g/L碳酸钠、37％甲醛、Na2S2O3·5H2Omg/L显色2-5min；最后用10％乙酸终止。
在文献5孙飞舟，采用微卫星DNA标记评估中国地方猪种遗传多样性，中国农业大学博士学位论文，2002，P.32中，孙飞舟采用25％的乙醇固定；再用1％的硝酸氧化；用0.2％硝酸银染色；经去离子水洗脱后，然后用0.2％甲醛、3％碳酸钠显色5min；最后以10％乙酸终止显色。
目前的这些银染方法较为繁琐，其间的每一步在弃去各种液体后，均需用蒸馏水洗涤多次；所用时间也较长，约0.5-2小时；所用的试剂量也较多。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的银染方法步骤较为繁琐、所用时间较长、所用试剂量较多的缺陷，从而提供一种步骤简单、高效、快速的银染方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供一种银染方法，其包括如下步骤1)银染将凝胶加入到染色混合溶液中染色5～10分钟，所述的染色混合溶液为含20～75v％乙醇、0.5～3v％硝酸、0.05～0.8wt％硝酸银的水溶液；2)洗脱用去离子水洗涤步骤1)中经银染的凝胶1～5分钟；3)显色将步骤2)中处理的凝胶用显色液显色至条带清晰，所述显色液为含0.1～0.3v％甲醛、2～4wt％Na2CO3的水溶液；4)终止将步骤3)显色的凝胶用10v％乙酸的水溶液终止显色0.5～3分钟。
本发明提供的银染方法与与已有技术相比，其优点在于通过将银染方法中的固定液，氧化液以及显色液合而为一，减少了所用的试剂量，将步骤简化至三步，所用时间不到20分钟，使银染的效率大大提高，而且不影响银染敏感性。
具体实施例方式
实施例1、将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，加入到20v％乙醇、0.5v％硝酸、0.05wt％硝酸银组成的水溶液染色混合溶液中染色5分钟；然后用去离子水洗涤经银染的凝胶1分钟；用含0.1v％甲醛、2wt％Na2CO3水溶液的显色液显色至条带清晰；用10v％乙酸终止显色0.5分钟。
实施例2、将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，加入到75v％乙醇、3v％硝酸、0.8wt％硝酸银组成的水溶液染色混合溶液中染色10分钟；然后用去离子水洗涤经银染的凝胶5分钟；用含0.3v％甲醛、4wt％Na2CO3水溶液的显色液显色至条带清晰；用10v％乙酸终止显色3分钟。
实施例3、将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，加入到25v％乙醇、1v％硝酸、0.2wt％硝酸银组成的水溶液染色混合溶液中染色8分钟；然后用去离子水洗涤经银染的凝胶3分钟；用含0.2v％甲醛、3wt％Na2CO3水溶液的显色液显色至条带清晰；用10v％乙酸终止显色1分钟。
比较例1、采用文献3的方法将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，用10％的乙醇和0.5％的乙酸固定3min；再用10％乙醇、0.5％乙酸0.5％、0.2％硝酸银银染5min；经去离子水洗脱后，然后用32％氢氧化钠、0.12％甲醛显色5min；最后用10％乙醇、25％乙酸终止。
比较例2、采用文献4的方法将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，用10％的乙醇固定3min；再用0.1％硝酸银、37％甲醛银染30min；经去离子水洗脱后，然后用30g/L碳酸钠、37％甲醛、Na2S2O3·5H2Omg/L显色2-5min；最后用10％乙酸终止。
比较例3、采用文献5的方法将电泳完毕的聚丙烯酰胺凝胶，取出后，凝胶切角标记，用25％的乙醇固定；再用1％的硝酸氧化；用0.2％硝酸银染色；经去离子水洗脱后，然后用0.2％甲醛、3％碳酸钠显色5min；最后以10％乙酸终止显色实施例1～3和比较例1～3的四种染色方法进行银染时，上样量完全一样，上样样品为DNA分子量pBR322/MspI marker，凝胶染色结果列于表1。
表1几种银染方法的比较结果方法 比较例1 比较例2 比较例3 实施例1～3操作时间 20min左右 1h左右 50min 最少可达10min背景 最浅 深 较深 较浅操作程序 较简单较繁较繁 简单灵敏度 一般 较高高 较高Mark变性胶 3.50ng0.44ng 0.44 0.44ng所有条带非变性胶 14.00ng 14.00ng 3.50 3.50ng至少变性胶 0.22ng0.03ng 0.03 0.03ng有一条带非变性胶 0.88ng0.88ng 0.22 0.22ng不易保存染色/显色液的保存 较易保存 易保存易保存需现用现配虽然银染技术广泛使用于国内外众多实验室，但是试验过程较繁琐，所用时间较长。本实验通过将以往银染方法中的固定液，氧化液以及显色液合而为一。从表1中可以看出，本发明提供的方法银染的灵敏度在变性PAGE凝胶中可达0.44ng，在非变性凝胶中可达3.5ng，在不影响灵敏度的情况下，大大的提高了效率。
显色液中0.5～3v％硝酸可以使背景颜色降低，大大的提高了银染检测的灵敏度。在染色后适当的延长洗涤时间可以使背景颜色降低。
本方法的各个步骤均可以延长时间，而不影响灵敏度。
除此以外，染色/固定液可以循环使用2-4次，而基本上不影响染色效果。
经过银染的凝胶，装入密封带中可以长期(至少半年)保存于室温当中，而基本不影响凝胶的质量以及灵敏度。
权利要求
1.一种银染方法，其包括如下步骤1)银染将凝胶加入到染色混合溶液中染色5～10分钟，所述的染色混合溶液为含20～75v％乙醇、0.5～3v％硝酸、0.05～0.8wt％硝酸银的水溶液；2)洗脱用去离子水洗涤步骤1)中经银染的凝胶1～5分钟；3)显色将步骤2)中处理的凝胶用显色液显色至条带清晰，所述显色液为含0.1～0.3v％甲醛、2～4wt％Na2CO3的水溶液；4)终止将步骤3)显色的凝胶用10v％乙酸的水溶液终止显色0.5～3分钟。
全文摘要
本发明涉及一种银染方法，其包括将凝胶加入到染色混合溶液中染色5～10分钟，所述的染色混合溶液为含20～75v％乙醇、0.5～3v％硝酸、0.05～0.8wt％硝酸银的水溶液；然后用去离子水洗涤经银染的凝胶1～5分钟；再用显色液显色至条带清晰，所述显色液为含0.1～0.3v％甲醛、2～4wt％Na
文档编号C12Q1/68GK1594594SQ03157070
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月12日 优先权日2003年9月12日
发明者杨宁, 曲鲁江, 吴桂琴, 李显耀 申请人:中国农业大学