专利名称：人胎儿膀胱来源的上皮细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及发育生物学和细胞生物学领域，更具体地，涉及纯化的人胎儿膀胱来源的上皮细胞和人胎儿膀胱上皮细胞系。
背景技术：
人的膀胱实质上是双层的器官，由肌肉外壁和作为内腔衬里的高度特异化的上皮组成。分化的膀胱上皮的特征是在内腔表面上存在膀胱表面细胞或伞状细胞的膀胱上皮斑(urothelial plaque)。这些斑的特征是高度不寻常的膜结构，即不对称单位膜(AUM)，其内腔片的厚度为胞质片的两倍。内腔片的增厚是由于存在具有半晶状组织的颗粒，这些颗粒主要由四种跨膜蛋白组成，这些蛋白为uroplakin(UP)Ia(27kDa)、UP Ib(28kDa)、UPII(15kDa)和UP III(47kDa)。认为UP III在膀胱上皮的糖萼的形成中起作用，并且可能通过其胞质部分与细胞骨架相互作用。Hu等，2000，J.CellBiol.151(5)961-72。
在内皮组织中发现膀胱的发育起源。膀胱来自泄殖腔——一个共用的腔，膀胱和下消化道都来自该腔。随着发育进行，泄殖腔分成后肠和尿生殖窦。膀胱的肌肉壁由来自膀胱上皮的信号从邻近的间充质诱导而来，尽管信号的身份还不知道。
在美国的男性中，膀胱癌占所有恶性肿瘤的约2％和所有尿道恶性肿瘤的约7％，尽管妇女的发病率只有男人的约1/3。此外，种族起一定作用，非洲-美国男人的发病率为年龄相当的非西班牙白种男人的发病率的近两倍。美国癌症协会估计下一年将有超过50,000新的膀胱癌病例，估计其中9,500人死亡。对于表面的、轻度疾病，化疗在膀胱内(直接到膀胱)应用以在肿瘤部位浓缩药物和消除切除术后剩余的任何肿瘤物质。全身性化疗和/或放疗用于重度疾病，通常与根治性膀胱切除术联合。然而，因为约50％患有高阶段、高等级肿瘤的病人在膀胱切除术后最终复发，在这些病人中很少进行手术以减轻症状。
除了种族和性别因素，化学品的暴露也是膀胱癌的已建立的危险因素。化学品暴露危险因素中首要的是吸烟，但是职业性暴露，特别是暴露了芳基胺，也是重要的危险因素。
许多研究人员已经描述了用uroplakin抗体分析膀胱上皮细胞的分化状态或者诊断转移性膀胱癌。Yu等，1992，Epith.Cell Biol.14-b 12；Moll等1993 Verh.Deutsc.Ges.Path.77和Moll等1995.Am.J.Pathol.1471383-1397。
膀胱上皮细胞的体外研究通常使用来自膀胱瘤或原代膀胱上皮细胞的细胞系，尽管已报道了有限数目的来自正常膀胱上皮组织的细胞系(Christensen等，1984，Anticancer Res.4319-38)。国际专利申请WO02/102997公开了来自未受精的后减数分裂I二倍体生殖细胞的纯合干细胞，该干细胞据称可分化成多种细胞类型。也见，Keay等，1996，J.Urol.156(6)2073-8；和Owens等，1976，J.Natl.Cancer Inst.56(4)843-9。
发明内容
一方面本发明涉及来自人胎儿膀胱的上皮细胞的基本纯的群体，这些上皮细胞能够分化成膀胱上皮和/或前列腺上皮。因此，能够分化成膀胱上皮或前列腺上皮是指能够分化成两种细胞类型中的一种。细胞可以培养于无血清的营养培养基中，并且可以具有基本无血清生物分子的细胞表面。本发明的来自人胎儿膀胱的上皮细胞表达H19标记基因。
另一方面，本发明提供了一种分离来自膀胱的上皮细胞的基本纯的群体的方法，包括(a)维持足以允许人胎儿膀胱来源的上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；其中人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经维持在足以允许膀胱来源的上皮细胞从显微解剖的膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清的营养培养基中以形成单层集落的适宜培养基中；其中膀胱来源上皮细胞的来源已经在无血清的培养基中在足以维持膀胱来源的上皮细胞的培养条件下培养，其中无血清的培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物质；和(b)传代培养所述单层集落以得到膀胱来源上皮细胞的基本纯的群体。在一些实施方案中，无血清的营养培养基还含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。
另一方面，本发明提供了一种生产基本纯的人胎儿膀胱来源上皮细胞群体的方法，它包括显微解剖人胎儿膀胱来源上皮细胞的来源；在足以维持所述膀胱来源的上皮细胞的培养条件下将膀胱来源上皮细胞的来源置于无血清的营养培养基中，其中无血清的培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物；维持足以允许膀胱来源上皮细胞从所述膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清的营养培养基中的适宜培养条件；维持足以允许膀胱来源上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；和传代培养所述单层集落以得到膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。该方法中所用培养基还可以含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。因此，本发明的人胎儿膀胱来源上皮细胞不是来自生殖细胞。
另一方面，本发明提供了人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体，这些细胞通过下面的方法产生，该方法包括(a)维持足以允许人胎儿膀胱来源的上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；其中人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经维持在足以允许该膀胱来源上皮细胞从显微解剖的膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清的营养培养基中以形成单层集落的适宜培养条件中；其中膀胱来源上皮细胞的来源已经在无血清的培养基中在足以维持膀胱来源的上皮细胞的培养条件下培养，其中无血清的培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物质；和(b)传代培养所述单层集落以得到膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。在一些实施方案中，用于所述方法中的无血清的营养培养基还含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。
另一方面，本发明提供了通过下面的方法产生的基本纯的人胎儿膀胱来源上皮细胞群体，该方法包括显微解剖人胎儿膀胱来源上皮细胞的来源；在足以维持所述膀胱来源的上皮细胞的培养条件下将膀胱来源上皮细胞的来源置于无血清的营养培养基中，其中无血清的培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物；维持足以允许膀胱来源的上皮细胞从所述膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清的营养培养基中的适宜培养条件；维持足以允许膀胱来源的上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；并传代培养所述单层集落以得到膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。该方法中所用培养基还可以含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。
另一方面，本发明涉及维持能够分化成膀胱或前列腺上皮的基本纯的人胎儿膀胱来源上皮细胞群体和维持或培养这些人胎儿膀胱来源的上皮细胞使得这些细胞维持分化能力且避免衰老的方法。
另一方面，本发明涉及向异源受体提供免疫原来源的方法和将人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体作为免疫原的用途。在一些实施方案中，本发明提供了一种向异源受体提供免疫原来源的方法，包括向所述受体施用有效量的本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞以诱导所述受体中的免疫应答。
另一方面，本发明涉及在异源受体中引起免疫应答的方法，包括向所述受体施用有效量的本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞以诱导所述受体中的免疫应答。
另一方面，本发明涉及产生从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化而来的人膀胱上皮细胞群体的方法，包括将本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够使所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
另一方面，本发明涉及通过下述方法产生的从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化而来的人膀胱上皮细胞群体，该方法包括将本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
另一方面，本发明涉及产生从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化而来的人前列腺上皮细胞群体的方法，包括将本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
另一方面，本发明涉及通过下述方法产生的从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化而来的人前列腺上皮细胞群体，该方法包括将本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
在本发明的另一方面，本发明涉及使用人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体和将此人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体产生人胎儿前列腺上皮细胞的人组织模型的方法。
在本发明的另一方面，本发明涉及产生人膀胱组织模型的方法，包括使用人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体和将人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞进一步分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
在本发明的另一方面，本发明涉及通过下面的方法产生的人膀胱组织模型，该方法包括将本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
在本发明的另一方面，本发明涉及产生人胎儿前列腺上皮细胞的人组织模型的方法，包括使用人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体和将人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体。
在本发明的另一方面，本发明涉及产生人前列腺组织模型的方法，包括使用人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体和将人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
在本发明的另一方面，本发明涉及通过下面的方法产生的人前列腺组织模型，该方法包括将人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
在本发明的另一方面，本发明涉及提供细胞治疗的方法，由此人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体或从其分化的细胞被导入受体。在一些实施方案中，本发明涉及一种给受体提供细胞治疗的方法，包括向所述受体施用多个本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞到所述受体体内，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞首先在无血清的培养基中生长，然后施用于所述受体身体内能够支持所述膀胱来源的上皮细胞生长和分化的位置。在一些实施方案中，本发明的人胎儿膀胱来源的上皮细胞被施用于受体膀胱的内腔中。
在本发明的另一方面，本发明涉及提供细胞治疗的方法，其中由人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化出的人前列腺上皮细胞的基本纯群体被导入受体。
在本发明的另一方面，本发明涉及提供用于开发治疗药物的手段的方法，其中人胎儿膀胱来源的上皮细的基本纯的群体被用作将作为所要开发的药物的靶标的人膀胱上皮细胞或这些细胞的组分的来源。
在本发明的另一方面，本发明涉及提供用于开发治疗药物的手段的方法，其中人胎儿膀胱来源的上皮细的基本纯的群体被用作将作为所要开发的药物的靶标的人膀胱上皮细胞或前列腺上皮细胞的来源。
在本发明的另一方面，本发明涉及在生物测定试验的开发中或为生物测定试验提供来自那些细胞的核酸或蛋白质的来源的方法，包括从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分离核酸或蛋白质，并用所述核酸或蛋白质作为生物测定试验中的一种或多种主要组分。另一方面，本发明涉及在生物测定试验的开发中或为生物测定试验提供人胎儿膀胱来源上皮细胞的来源的方法，包括在生物测定试验中使用人胎儿膀胱来源的上皮细胞。
附图简述本专利申请文件包括至少一幅彩色附图。在需要并支付了必须费用后美国专利和商标局将提供具有彩色附图的该专利申请的复件。
图1A显示在相差显微镜100×(Nikon)下观察到的第1代人胎儿膀胱来源的上皮细胞样品的显微照片。图1B、1C、1D、1E和1F显示第1代人胎儿膀胱来源的上皮细胞经免疫组织化学(IHC)染色后的样品的显微照片。图1B显示了无第一抗体的阴性对照。图1C显示了用细胞角蛋白7染色。图1D显示了用抗人平滑肌α肌动蛋白的抗体染色。图1E显示用细胞角蛋白-19染色。图1F显示用uroplakin染色。褐色区域为阳性染色，蓝色为细胞核染色。
图2显示来自含有人胎儿膀胱来源的上皮细胞和大鼠膀胱间充质的组织重组体的切片的显微照片。图2A为用苏木精和曙红(H&E)染色的切片的显微照片。图2B显示用抗人平滑肌α-肌动蛋白抗体染色的切片。图2C和2D显示分别用对人细胞角蛋白7和19有特异性的抗体染色。通过沉积褐色反应产物显示抗体结合。图2E显示用抗人uroplakin-III染色的切片，图2F显示对照(无一抗)。通过暗紫色/黑色反应产物的沉积指示的抗体结合可以在图2E的内腔表面上观察到。
图3.组织重组体中人膀胱上皮细胞系向前列腺上皮细胞的分化。图3A显示了在培养的膀胱上皮细胞系与新生大鼠精囊间充质重组前从膀胱上皮细胞系培养物释放的上皮细胞片的石蜡切片的H&E染色的显微照片。图3B显示了生长在SCID小鼠肾囊(Kidney Capsule)下6个月的膀胱上皮细胞系与大鼠精囊间充质的组织重组体的石蜡切片的H&E染色的显微照片。注意典型的前列腺结构。图3C显示了与如图3B相同的组织重组体中前列腺特异抗原(PSA)的免疫组织化学染色的显微照片。注意上皮细胞内衬中的强阳性褐色染色。该切片通过苏木精负染，让细胞核染成蓝色。
具体实施例方式
下面提供的本发明的详细描述用于帮助本领域技术人员实施本发明。这些详述不应被理解为对本发明的限制，本领域普通技术人员可以修改此处公开的实施方案而不脱离本发明的精神和范围。在整个公开中，将各种出版物、专利、公开的专利说明书引用作为参考。此处将这些出版物、专利和公开的专利的公开内容完整引入本申请作为参考。
除非特别说明，本发明的实施将使用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域技术人员能力范围内。见，例如《分子克隆实验室指南》，(Molecular Laboratory Manual)第二版，Sambrook，等(1989)；Current Protocols In Molecular Biology F.M.Ausubel，等编辑(1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)系列，Academic Press，Inc.；《PCR 2实践方法》(PCR 2A practicalApproach)，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor，编辑(1995)，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Harlow和Lane编辑(1988)，《成人和儿童泌尿学》(Adult and Pediatric Urology)，J.Gillenwater等编辑(2002)，和《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)，R.I.Freshney，编辑(1987)。
定义如在说明书和权利要求书中所用的，术语“膀胱来源的上皮细胞”、“膀胱来源上皮细胞”和“膀胱来源细胞”可互换使用，指来自人胎儿膀胱上皮组织的细胞。这些细胞能够在体外分裂和传代。
“抗体”是能够结合抗原的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的免疫球蛋白分子，也包括抗独特型抗体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的突变体、片段、融合蛋白、人源化蛋白和修饰物。
“单克隆抗体”指均质的抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然的和非天然的)组成。单克隆抗体高度特异，针对单个抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv)、单链(ScFv)、其突变体、含有抗体部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体，和包含具有所需特异性的抗原识别位点并能够结合抗原的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。并不旨在对抗体的来源和抗体产生的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物，等)进行限制。
“人源化”抗体指该分子具有来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余的免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或者仅仅包含嫁接到可变结构域中的适当构架区上的互补决定区(CDRs)。
术语“抗原”为可以包括一个或多个抗体可以结合的表位的分子。抗原为可以具有免疫原性质，即诱导免疫应答的物质。抗原被认为是一种免疫原。如此处所用的，术语“抗原”旨在表示全长蛋白及其含有或包括一个或多个表位的肽片段。
术语“表面抗原”和“细胞表面抗原”在这里可互换使用，指细胞的质膜组分。这些组分包括，但不限于，整合膜蛋白和外周膜蛋白、糖蛋白、多糖、脂质和糖基磷脂酰肌酵(GPI)-连接的蛋白。“整合膜蛋白”为穿越细胞质膜脂质双层的跨膜蛋白。典型的整合膜蛋白由至少一个通常含有疏水氨基酸残基的跨膜片段组成。外周膜蛋白不延伸入脂质双层的疏水内部，并且它们通过与其他膜蛋白的非共价键相互作用结合到膜表面。GPI-连接的蛋白是通过插入到脂质双层中的脂质尾巴固定在细胞表面的蛋白。
“免疫原”指诱导免疫应答的任何物质。为免疫原的物质被描述为“免疫原的”。免疫应答的诱导包括但不限于激活体液应答(例如产生抗体)或细胞应答(例如致敏细胞毒性T细胞)、炎症反应(例如，白细胞的募集)和分泌细胞因子和淋巴因子。
应用于用于免疫或移植的细胞的术语“异源的”指细胞来自与受体基因型不同的实体。例如，异源细胞可来自不同的物种或者与受体相同物种的不同个体。来自一种物种的个体的胚胎细胞与相同物种的成体异源。应用于受体的“异源的”指受体是与将要导入受体体中的细胞的来源在基因型上不同的实体。
“外植块”指从人类胎儿中取出的膀胱组织。通常地，外植块用作膀胱来源细胞的来源。可通过几种方法完成从外植块分离细胞。一种方法是将膀胱上皮组织外植块(完整组织或切成小片)置于培养基中并允许上皮细胞自然地从固体组织块迁移到培养基中。另一种方法是将组织用酶消化或者用机械力使细胞脱离固体组织。
当至少约50％胎儿膀胱来源的上皮细胞表面，更优选地至少约75％胎儿膀胱来源的上皮细胞表面，甚至更优选地至少约90％胎儿膀胱来源的上皮细胞表面，最优选至少约95％胎儿膀胱来源的上皮细胞表面没有来自血清的血清生物分子结合于细胞表面，以致抗原位点或抗体结合位点可以被抗体或抗体的一部分结合或者这些位点不能被抗体或抗体的一部分接近进行抗原性识别时，细胞表面“基本上无血清生物分子”。可以通过显微镜或流式细胞计数器测量细胞的大小来确定细胞表面。例如，具有各种已知大小的合成珠子通常用于流式细胞计数器的校准。可将小量校准过的珠子与膀胱来源的上皮细胞混合并通过流式细胞计数器分析所得群体。然后，膀胱来源的上皮细胞可以与校准过的珠子进行大小比较。因为珠子的大小已知，可以完成细胞表面积的计算。
如此处所用的，细胞的“基本纯”的群体为含有至少约85％目的细胞，优选至少约90％，更优选至少约95％或更多(如98％或更多)的目的细胞的细胞群体。
如此处所用的，“移植重组体”指人胎儿膀胱来源的细胞和间充质组织的组合单位。间充质组织可以是膀胱来源的或非膀胱来源的(例如膀胱间充质、精囊间充质)。间充质组织可以来自与移植受体异源的物种。间充质组织也可以来自非人类物种。移植重组体可以在基质，优选软的生物学基质(例如琼脂)上孵育1到96小时，更优选地约6小时到48小时，更优选地，过夜孵育约24小时。
如此处所用的，“血清”指哺乳动物血凝固后剩余的血的液态相。
如此处所用的，“血清生物分子”指在血清中发现的生物学组分。实例包括，但不限于，白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。血清生物分子可包括在血清中天然发现的或者在加工和处理血清后得到的全部的或部分的生物学组分。
术语“哺乳动物”指包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、猿、运动动物和宠物在内的温血脊椎动物。
人胎儿膀胱来源的上皮细胞的分离和维持本发明的胎儿膀胱上皮细胞分离自人胎儿膀胱组织。胎儿的年龄可以为妊娠的约第6周到约第40周，优选约第8周到约第30周，更优选约第14周到约第21周，更优选约第16周。可通过大体解剖、外观、胎儿内的位置鉴定胎儿膀胱。膀胱位于腹壁附近下腹中线。除了通过定位和外观鉴定，还可通过膀胱连接(通过膀胱的顶部表面)到脐尿管(尿囊的残迹，在成人中为中膀胱脐韧带)来鉴定。一旦鉴定，切出胎儿膀胱并用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗，优选洗几次。解剖除去邻近组织和多余的结缔组织，然后再次用PBS洗涤膀胱。将整个膀胱切碎成约1mm立方体，悬浮在基础培养基中，转移到离心管，并离心以沉淀切碎的组织。除去上清液，然后将组织重悬在另外的基础培养基中，然后转移到培养皿。可以使用各种基础培养基以维持液体的pH在促进胎儿膀胱上皮细胞存活的范围内。非限制性的实例包括F12/DMEM，Han’s F10(Sigma)、CMRL-1066、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)、OPTI-MEM(GIBCO BRL)和Iscove氏改良的Eagle培养基(IMEM)。此外，也可以使用在Ham和Wallace(1979)Meth.Enz.，5844，Barnes和Santo(1980)Anal.Biochem.，102255，或Mather，J.P.和Roberts，P.E.(1998)《细胞和组织培养介绍》(Introduction to cell andTissue)，Plenum Press，纽约中描述的任何基础营养培养基。
将基础培养基加到培养皿中，并将组织在37℃下在湿润空气中孵育。为了得到促进胎儿膀胱上皮细胞存活和生长的更优条件，可将各种营养物加入以补充基础培养基(从而产生“营养培养基”)。实例包括，但不限于，胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚(维生素E)、孕酮、heregulin(HRG)、角质细胞生长因子(KGF)和抑酶肽。在优选的实施方案中，使用下面量的营养物来促进胎儿膀胱上皮细胞的存活和生长至少约10ng/ml胰岛素且不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml转铁蛋白且不超过约100μg/ml转铁蛋白，更优选约10μg/ml转铁蛋白；至少约0.1μg/mlα-生育酚且不超过约1mg/mlα-生育酚，更优选约5μg/mlα-生育酚；至少约0.3nM孕酮且不超过约300nM孕酮，更优选约3nM孕酮；至少约1ng/ml KGF且不超过约100ng/ml KGF，更优选约10ng/ml KGF，至少约0.5nM HRG且不超过约500nM HRG，更优选约5nM HRG，至少约1μg/ml抑酶肽和不超过约100μg/ml抑酶肽，更优选约25μg/ml抑酶肽。抗生素和/或抗真菌剂，如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入到培养基中，但是优选仅仅在培养的初始阶段(例如头2到5天)加入抗生素/抗真菌剂。人胎儿膀胱上皮细胞优选培养在无血清的培养基中。
胎儿膀胱上皮细胞从胎儿膀胱组织迁移到胎儿膀胱组织所在的培养基中。在多数情况下，成纤维细胞类细胞也迁移出膀胱组织。不与培养皿贴壁的剩余切碎的组织将流入培养基中，并且将通过培养短时间(例如1-2周)后的培养基更换而清除。将成纤维细胞类细胞从培养基中除去以产生胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。优选地，通过培养物的轻度蛋白水解消化、优选在存在钙螯合剂如EDTA时除去成纤维细胞类细胞。在蛋白水解处理(例如用胰蛋白酶-EDTA溶液，如GIBCO BRL产品号25300-054)过程中通过显微镜，优选使用倒置相差显微镜观察培养物以检测成纤维细胞类细胞的脱离。当成纤维细胞类细胞脱离后，通过抽吸将它们从培养物中除去。用PBS洗涤培养物中剩余的细胞，并在新鲜培养基中培养。
胎儿膀胱上皮细胞可以生长在不用或用不同基质包被的组织培养容器(例如烧瓶、盘，等)中。可用的基质的非限制性实例包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、聚赖氨酸、硝基纤维素、尼龙和聚四氟乙烯。组织培养容器的大小与容器中放置的膀胱上皮组织的量成比例。技术人员可以通过逐步增加组织培养容器中放置的胎儿膀胱组织来确定组织培养容器的正确的大小。当胎儿膀胱组织最初被置于组织培养容器中时，培养基通常在总体的混浊中是清澈的。当细胞迁移出并离开膀胱组织小块时，培养基将变得更不透明和更混浊。在培养基高度混浊时，通过加入另外的新鲜培养基或完全改变培养基将更多营养培养基置于组织培养容器中以补充被膀胱来源细胞消耗的营养。额外地或者备选地，当培养基变混浊时，可从组织培养容器取出少量细胞并例如用台盼蓝染色来检查细胞存活力。含有超出限度的太多细胞的组织培养容器将开始显示出降低的细胞存活力。
胎儿膀胱来源的上皮细胞的连续培养通常包括将细胞转移到一个或多个新的培养容器中。优选地，在培养容器中细胞超过限度(例如，通过降低的细胞存活力显示)前进行转移。可将细胞转移到其他更大(例如更大的体积)的容器中以容纳数量不断增加的细胞。备选地，细胞可以“分”到几个单独的含有新鲜营养培养基的组织培养容器中(也叫做“传代培养”)。以这种方式，可以得到并增殖胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。
优选通过酶促处理使细胞从塑料组织培养容器的表面脱离以将细胞从组织培养容器取出。在更优选的实施方案中，使用有效量的酶(如胶原酶-分散酶)以将胎儿膀胱上皮细胞从组织培养瓶壁上分离。有效量为至少约10％，更优选至少约1％，最优选至少约0.1％胶原酶-分散酶(按重量计)。
细胞从组织培养容器表面脱离后，用基础培养基、优选此处公开的营养培养基洗除酶，并将细胞置于含有营养培养基、优选此处公开的营养培养基的新的培养容器中。在优选的实施方案中，角质细胞生长因子(KGF)(也叫做成纤维细胞生长因子7(FGF7)和heregulin(HRG)用作培养基补充成分中的生长因子以促进膀胱来源的上皮细胞的增殖和存活。
饲喂胎儿膀胱来源的上皮细胞的频率依赖于细胞的营养代谢速率。营养代谢的速率越高，细胞需要越频繁的饲喂。通常，随着细胞代谢培养基中的营养物，培养基酸性将增加。一些营养培养基(例如RPMI-1640，DMEM，EMEM，等)含有指示酸性的pH敏感染料，从而当培养基变酸时培养基改变颜色。然后可将营养培养基加到现有培养基中以得到维持细胞生命和促进细胞生长的酸度。备选地，可从组织培养容器取出小部分细胞并例如用台盼蓝染色估计细胞的存活力。如果营养培养基已经被代谢，细胞存活力就差(例如，小于50％)。优选提高胎儿膀胱来源的上皮细胞的生存和生长的饲喂频率为约一周两次。本发明的胎儿膀胱来源的上皮细胞可被多次传代(多达12次)而不衰老。
胎儿膀胱来源的上皮细胞的鉴定以此处公开的方式分离的本发明的胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体具有几种限定特征。可通过形态或特定标记物或两种技术的组合完成胎儿膀胱来源的上皮细胞的鉴定。
胎儿膀胱来源的上皮细胞的形态学特征是移行上皮细胞特征。这些细胞长成成簇的上皮细胞集落。作为移行上皮，形态学有些变化。有紧密多边形上皮细胞、具有纤细突起的伸长的细胞和形态在这两种细胞之间的其他细胞。伸长的细胞有时形成细胞束。紧密多边形细胞似乎是较少分化的膀胱上皮细胞，因为这些细胞较少表达或不表达分化的膀胱细胞标记，如细胞角蛋白7&19，和uroplakin III。伸长的细胞和扩大的圆形细胞表达更多的分化特征。
可用于检测胎儿膀胱来源的上皮细胞的标记物包括但不限于胎儿膀胱来源的上皮细胞表面上的细胞角蛋白(CK)1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18和19和uroplakin(例如uroplakin Ia、Ib、II和III)。通过利用对CK和uroplakin特异的抗体评价这些细胞表面标记物。可以使用的抗体的实例包括但不限于抗细胞角蛋白CK-7(Zymed 18-0234 lot00460118)、CK-19(NCL-CK19小鼠单克隆Novocastra Batch 100902)和抗uroplakin抗体(小鼠抗uroplakin III克隆AUI、mIgG1 Lot#105300aCat#RDI-PR0651108，RDI)。抗CK抗体和抗uroplakin抗体可用于免疫组织化学中或通过流式细胞技术法直接或间接染色膀胱来源的上皮细胞。
胎儿膀胱来源的上皮细胞也已用抗α肌动蛋白抗体(DAKOA/S克隆1A4编号M0851)染色，该抗体为平滑肌肌动蛋白标记物。结果为阴性，说明培养的胎儿膀胱来源的上皮细胞不含有任何平滑肌细胞。另一个可用于进一步表征的标记物是H19 imprint基因，如实施例3所例证的。
胎儿膀胱来源的上皮细胞的用途免疫原胎儿膀胱来源的上皮细胞的一种用途是用作免疫原。如本发明所公开的，独特的无血清培养条件使胎儿膀胱来源的上皮细胞的细胞表面没有可以结合到表面上的血清蛋白或血清生物分子。通过使用公开的无血清分离和培养技术避免了因血清生物分子结合而“掩盖”抗原位点的潜在问题。因此，针对当使用含有血清的培养条件时被“掩盖”而现重新可接近的抗原，可以形成一组抗体。
用此处公开的方法分离和培养的胎儿膀胱来源的上皮细胞可用作施用于异源受体的免疫原。向异源受体施用作为免疫原的胎儿膀胱来源的上皮细胞的方法包括但不限于免疫，通过直接接触如涂抹或刮擦装置施用于膜，通过气雾剂施用于粘膜，和经口施用。如本领域中熟知的，免疫可以是被动的或自动的免疫。可通过各种途径实施免疫方法，这些途径包括但不限于腹膜内注射、皮内注射、局部注射。免疫的受试者可包括哺乳动物，如小鼠。免疫途径和方案通常可与用于刺激和产生抗体的成熟的常规技术一致。尽管在本实施方案中使用小鼠，但是根据本发明的方法可以操作包括人在内的任何哺乳动物对象或来自该动物的抗体产生细胞作为产生哺乳动物杂交瘤细胞系的基础。典型地，用免疫原量的胎儿膀胱来源的上皮细胞腹膜内接种小鼠，然后用相似量的免疫原强化。备选地，生长在非生物膜基质上的细胞通过手术腹膜内移植到宿主哺乳动物体内。最后一次强化后几天收集淋巴细胞，优选来自小鼠的脾淋巴细胞并从中制备在融合中使用的细胞悬液。
用通常的体细胞杂交技术(Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature256495-497，由Buck，D.W.，等，(1982)In Vitro，18377-381改进)从淋巴细胞和永生的骨髓瘤细胞制备杂交瘤。现有的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和那些来自Salk Institute(细胞分配中心，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)的杂交瘤系，可用于杂交。杂交技术包括使用融合剂如聚乙二醇或者通过本领域中技术人员熟知的电技术融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。融合后，细胞从融合培养基分离并生长在选择性生长培养基如HAT培养基中以消除未杂交的亲本细胞。此处描述的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一个备选方案，用EBV永生化的B细胞产生本发明的单克隆抗体。如果需要，扩增杂交瘤并亚克隆，上清液通过常规免疫测定方法(例如放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)测定抗免疫原的活性。
可用公知方法使产生这些抗体的杂交瘤在体外或体内生长。如果需要，可通过常规免疫球蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤从培养基或体液中分离出单克隆抗体。可除去不想要的活性(如果存在的话)，例如，通过使制品跑过由连接到固相的免疫原制成的吸附剂并从免疫原上洗脱或释放想要的抗体。
以此方式，可用本发明的胎儿膀胱来源的上皮细胞产生针对胎儿膀胱来源上皮细胞特异性细胞表面抗原的一组新抗体。结合人胎儿膀胱来源上皮细胞的代表性细胞表面抗原的单克隆抗体群也可用PCT WO 00/37503中描述的方法产生。一旦通过此处公开的方法制备了胎儿膀胱来源上皮细胞的细胞表面抗原的单克隆抗体，这些抗体具有几种用途。
可以对抗体测序和克隆，目的是产生重组抗体或人源化抗体。胎儿膀胱来源上皮细胞的特异性抗体的其他用途包括，但不限于，生物试验和纯化(例如，通过流式细胞计数法或淘洗方法分离胎儿膀胱来源的上皮细胞)、治疗应用(如，通过抗体与靶细胞结合促进或阻止细胞生长或者通过抗体与靶细胞结合促进或阻止细胞物质生长)、生物学标记物(例如鉴定其他胎儿膀胱来源的细胞)和临床诊断(例如鉴定癌性膀胱上皮细胞)。
药物开发人胎儿膀胱来源的上皮细胞(或来自人胎儿膀胱来源的上皮细胞的分化细胞)的另一用途涉及药物开发。因为人胎儿膀胱来源的上皮细胞群体以前还没有被以该公开方式分离和培养，该胎儿膀胱来源的上皮细胞群体可能分泌迄今没有发现或鉴定的蛋白。以前使用血清的培养技术可抑制蛋白分泌。或者，当蛋白分泌和与血清生物分子相互作用时蛋白可能在功能、构象或活性方面发生改变。而胎儿膀胱来源的上皮细胞分泌的蛋白受到最小的血清分子干扰，从而可能更具有生理学和拓扑学上的准确性。因此，胎儿膀胱来源的上皮细胞分泌的蛋白可用作药物开发的靶标。在一个实施方案中，可制备药物以体内靶定胎儿膀胱来源的上皮细胞和/或从胎儿膀胱来源的上皮细胞分化出的细胞上的特定蛋白。药物的结合可促进膀胱细胞分化成完全分化的膀胱上皮细胞。当需要新生膀胱上皮细胞时，例如在膀胱相关的放疗或囊内化疗(可能损害或破坏膀胱上皮)后，可以使用该方法。
在另一种用途中，人胎儿膀胱来源的上皮细胞(或来自人胎儿膀胱来源上皮细胞的分化细胞)可用于开发或发现与膀胱来源的上皮细胞相互作用的小分子。这些小分子可以是合成的或天然的，并且可用于抑制或促进膀胱来源的上皮细胞的生长和/或分化。
在另一种用途中，人胎儿膀胱来源的上皮细胞(或从中分化的细胞)可在一种或多种药物开发中用作将作为开发中的药物的靶标的组织特异性组分的来源。
细胞治疗在另一种用途中，胎儿膀胱来源的上皮细胞系用于细胞治疗。胎儿膀胱来源的上皮细胞的移植是细胞治疗的一个实例。为了实践该用途，分离胎儿膀胱来源的上皮细胞并用公开的方法在无血清的营养成分确定的培养基中培养。如此处公开的，可以传代此细胞群体以扩增可得到用于移植的胎儿膀胱来源上皮细胞的数量。然后可将胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于受体并允许其重新定居(repopulation)于膀胱的内腔表面。备选地，胎儿膀胱来源的上皮细胞可用作基因治疗的细胞载体，其中胎儿膀胱来源的上皮细胞用一种或多种基因转染并施用于受体，优选通过囊内施用。在另一实施方案中，胎儿膀胱来源的上皮细胞在含有细胞并限制其他细胞进入的装置(例如Theracyte)中使用以限制免疫系统应答。
在前列腺环境中也可以利用本发明胎儿膀胱来源的上皮细胞的可塑性。因此，可将胎儿膀胱来源的上皮细胞移植到个体的前列腺中以重新定居或扩增前列腺上皮。通过施用已遗传修饰的胎儿膀胱上皮细胞，例如将一种或多种基因转染入胎儿膀胱来源的上皮细胞，然后将其移植到前列腺中，也可将胎儿膀胱来源的上皮细胞用作基因治疗中向前列腺递送基因的细胞载体。
人组织模型胎儿膀胱来源的上皮细胞的另一种用途是在非人哺乳动物中产生人组织模型。将胎儿膀胱来源的上皮细胞置于间充质组织上部以形成移植重组体。间充质组织可以是膀胱来源的或非膀胱来源的组织，并且可来自与胎儿膀胱来源的上皮细胞所分离自的物种不同的物种。在工作实施例中，人胎儿膀胱来源的上皮细胞被置于大鼠膀胱间充质组织上部以形成移植重组体。另一示例性移植重组体为置于前列腺间充质(例如大鼠精囊间充质)上部的胎儿膀胱来源的上皮细胞。技术人员可以以逐步的方式，通过首先用此处公开的方法分离人胎儿膀胱来源的上皮细胞然后与来自不同器官的间充质组织组合来确定最优组合。在一些实施方案中，不同物种，例如大鼠，被用作与人胎儿膀胱来源的上皮细胞组合的间充质组织的来源。异源物种的使用使得可以采用人特异性标记物来确定分化的胎儿膀胱来源细胞的身份。如果使用大鼠间充质组织，则可减少假阳性的可能性。
含有置于间充质组织上的胎儿膀胱来源上皮细胞球体的移植重组体培养于软基质上，如琼脂上，优选约半天到约3天，更优选约1天，然后置于受体哺乳动物的肾囊下。可能的受体哺乳动物包括但不限于小鼠和大鼠。通常地在移植情况中，供体组织易于被受体免疫系统攻击。为减轻移植排斥，可使用几种技术。一种方法是用亚致死剂量的辐射来照射受体以破坏可以攻击移植物的免疫细胞。另一种方法是给予受体环孢菌素或其他T细胞免疫抑制药物。使用小鼠作为受体哺乳动物时，有许多方法可能减轻移植排斥。一种方法是使用免疫缺陷小鼠(裸鼠或重度联合免疫缺陷或SCID)。
在工作实施例中，人胎儿膀胱来源的上皮细胞球体置于大鼠膀胱间充质组织或大鼠精囊间充质上并置于免疫缺陷小鼠的肾囊下。移植重组体保留在受体中约1周到约52周，优选约5周到约40周，更优选约6周到约10周，甚至更优选约8周，之后收获移植物并分析胎儿膀胱来源的上皮细胞的分化。在一些情况下，需要分析移植物的小部分。如此处公开的对胎儿膀胱来源的上皮细胞和来自胎儿膀胱来源上皮细胞的细胞特异的标记物可以用于免疫组织化学分析。此外，一种或多种此类标志的组合可以与细胞形态学联合使用以确定移植的功效。
在一个实施方案中，在SCID(重度联合免疫缺陷)小鼠中产生人胎儿膀胱来源的模型。通过利用按此处公开的方法分离并培养的人胎儿膀胱来源的上皮细胞并使用此人胎儿膀胱来源的上皮细胞制备移植重组体，可得到该胎儿膀胱来源的模型。然后将移植重组体置于小鼠的肾囊下。移植在肾囊下约1到10周，优选约6到8周后，收获移植物或其部分并通过免疫组织化学分析。可以使用的胎儿膀胱来源上皮细胞上的细胞表面标记物包括，但不限于，CK 1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18和19、前列腺特异抗原(PSA)、酸性和碱性磷酸酶、uroplakin Ia、Ib、III和H19 imprinted基因。此处公开的抗CK抗体或抗uroplakin抗体用于分析膀胱组织模型系统的功效，而PSA抗体用于分析前列腺组织模型系统。评价胎儿膀胱来源的上皮细胞分化的结果的另一种方法是形态学。膀胱来源的上皮细胞形成移行上皮，而当与膀胱间充质组织重组时将总是形成衬有膀胱上皮的中空结构。与精囊间充质重组的膀胱来源的上皮细胞采取前列腺上皮典型的形态。形态学可与细胞表面标记组合用于更完全的评价。
通过这些方法，本发明还提供了产生分化的人膀胱上皮细胞和人前列腺上皮细胞的群体的方法。
生物测定此处公开的人胎儿膀胱来源的上皮细胞(或从中分化的细胞)和这些细胞的组分可用于各种生物测定中。在一种用途中，膀胱来源的上皮细胞被用于确定分化需要哪些生物因子。通过以逐步的方式将膀胱来源的上皮细胞和不同生物化合物(例如激素、特异生长因子，等)组合使用，可以发现一种或多种特定生物化合物以诱导分化成膀胱细胞或前列腺细胞。
本发明还涉及提供生物测定用核酸或蛋白质的来源的方法，包括从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分离核酸或蛋白质，并用所述核酸或蛋白质作为生物测定中的一种或多种主要成分。膀胱来源的上皮细胞在生物测定中的其他用途为差异显示(例如mRNA差异显示)和使用来自膀胱来源上皮细胞的分泌蛋白的蛋白-蛋白相互作用。可用例如酵母双杂交系统等技术确定蛋白-蛋白相互作用。来自膀胱来源的上皮细胞的蛋白可用于鉴定与膀胱来源的上皮细胞相互作用的其他未知蛋白或其他细胞类型。这些未知的蛋白可以是下面的一种或多种生长因子、激素、酶、转录因子、翻译因子和肿瘤抑制剂。涉及膀胱来源的上皮细胞和这些细胞形成的蛋白-蛋白相互作用和蛋白-蛋白或甚至细胞-细胞接触的效果的生物测定可用于确定周围组织(如间充质组织)怎样有助于膀胱来源的上皮细胞分化。
下面的实施例提供了胎儿膀胱来源的上皮细胞的分离、鉴定和用途的详细描述。无论怎样，这些实施例不旨在限制本发明。
实施例实施例1胎儿膀胱来源的上皮细胞的分离妊娠龄为14-21周的人胎儿膀胱组织来自加利福利亚阿拉米达的高等生物科学研究所(Advanced Bioscience Research)。组织到达后，马上将它们用20ml冷PBS洗涤三次。将膀胱除去多余结缔组织，再用冷PBS洗涤两次，然后用刀片或剪子在解剖显微镜下切成小段(约1mm碎块)。
将切碎的组织悬浮在10ml OPTI-MEM(Invitrogen LifeTechnologies)中，然后用塑料吸液管转移到15ml离心管中，塑料吸液管已经用牛血清白蛋白预先包被以使结合到移液管壁的组织最少。在1000rpm下，切碎的组织在Heraeus Megafuge 2.0(Cat#75003485)中离心5分钟，以沉淀切碎组织。吸除上清液并将沉淀重悬浮在6ml新鲜OPTI-MEM中。
转移组织悬浮液并分装到用组织培养基处理过的6孔组织培养板的6个孔中。向孔中再加入3ml营养培养基(10μg/ml胰岛素、10μg/ml转铁蛋白、5μg/mlα-生育酚(Sigma目录号T3251)、25μg/ml抑酶肽、3nM孕酮、10ng/ml KGF、5nM HRG、OPT-IMEM中的100μg/ml庆大霉素)，然后将板在含有95％空气，5％CO2气体的湿润培养箱中37℃下孵育。培养头2天后不再使用庆大霉素。
通过限制性蛋白质水解从培养物除去成纤维细胞。用0.5ml0.05％EDTA-胰蛋白酶(Gibco BRL)短暂胰蛋白酶消化培养物并在相差显微镜下观察直到成纤维细胞收缩。充分摇动培养板使成纤维细胞从板上脱离下来。当成纤维细胞从基质脱离后，通过吸出培养基和脱落的细胞除去成纤维细胞。用5ml PBS洗涤培养物两次，然后用新鲜营养培养基饲喂。
所得胎儿膀胱来源的上皮细胞的纯化群体传代多达12次。通过胰蛋白酶(1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA，Invitrogen Life Technology目录号25300-054)或胶原酶/分散酶(3mg/ml，Roche Molecular Biochemicals(目录号269638))消化使细胞脱离培养容器。收集脱离的细胞，沉淀(1000rpm 5分钟)，用基本培养基洗涤两次，重新悬浮在新鲜营养培养基中，并再次铺板。
实施例2免疫组织化学鉴定将在四孔室载片中培养的胎儿膀胱来源的上皮细胞单层用冷PBS洗涤3次，在-20℃用100％试剂醇固定5分钟。然后，将固定的载片在空气中过夜干燥。细胞依次在封闭缓冲液(PBS中5％山羊血清)中孵育约1小时，在第一抗体中孵育过夜，在过氧化物酶连接的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)亲和纯(affinipurity)F(ab)2片段中孵育约1小时。在这些步骤之间，用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。所用的第一抗体为按照供应商的推荐稀释的细胞角蛋白7和19、uroplakin III和α-肌动蛋白。为了使抗体染色的细胞显色，将胎儿膀胱来源的上皮细胞在过氧化物酶底物DAB/H2O2(Sigma制备)中孵育。
一些细胞对uroplakin III和细胞角蛋白7和19为阳性。这些细胞通常位于上皮细胞集落的边缘。位于上皮细胞集落中心的较少分化的细胞对这些标记物为阴性。培养物中无细胞对α-肌动蛋白呈阳性。用uroplakinIII(一种对膀胱上皮高度特异的标记物)的阳性染色说明该细胞为膀胱上皮细胞，而缺乏对α-肌动蛋白的染色说明培养物没有被平滑肌细胞污染。
实施例3胎儿膀胱细胞分子标记物H19 imprinted基因mRNA的检测H19 imprinted基因mRNA被表征为在人胎儿膀胱细胞中特异表达但不在正常成人膀胱细胞中表达的标记物(Elkin等，1995，FEBS Lett.374(1)57-61；Cooper等，1996，J.Urol.155(6)2120-27)。为检测H19 mRNA，用购自Qiagen的RNeasy试剂盒(Cat#74104)根据供应商提供的方案从复制的第2代胎儿膀胱来源的上皮细胞培养物(每个培养物约105个细胞)提取总RNA。对每个样品在50μl水中洗脱最终总RNA。用cDNA合成试剂盒(Promega Corporation Cat A3500)，利用随机引物，根据供应商提供的方案将总RNA(每个样品9.5μl)在20μl反应中反转录成第一链cDNA。用Roche Biochemical生产的高保真PCR master mix(Cat#2 140 314)如下设置PCR反应。
表1
*H19F引物序列5’-ttccaggcagaaagagcaag-3’**H19R引物序列5’-tgccatgtccctgtctgac-3’两种引物都通过Invitrogen定制寡核苷酸合成方法合成，并溶于水，浓度为2.5O.D.260nm/ml。使用该对引物，针对特定H19 mRNA的预测的PCR产物为117个碱基对。
在Techne GeniusTM热循环仪中进行PCR反应，热循环仪设定为94℃3分钟用于最初变性，25个循环在94℃30秒变性和在60℃30秒退火和延伸。最后延伸为72℃7分钟。通过在Tris硼酸缓冲液中制备的2％琼脂糖凝胶中80伏下电泳2小时分级分离PCR产物，用溴乙锭染色，通过紫外光照射显色。用Kodak image station 440CF拍摄荧光照片。
人胎儿膀胱来源的上皮细胞cDNA的扩增产生预测大小(约117bp)的PCR扩增产物的清晰带。当总RNA用作模板时没有观察到扩增产物。该结果证明RT-PCR产物是从H19 mRNA扩增而来。
实施例4人膀胱组织建模从新生(24小时)Sprague-Dawley大鼠幼崽解剖膀胱间充质并转移到含有1％胰蛋白酶的盘中并在4℃孵育90分钟。除去培养基并在含有20％FBS的DMEM中洗涤原基几次以中和胰蛋白酶活性。然后将膀胱上皮和连接的间充质在解剖显微镜下进一步分离。为了产生组织重组体，将没连接上皮的间充质置于含有具1％FBS的DMEM的0.4％琼脂板的表面上。应该注意到将间充质和组织重组体短暂暴露于含血清的培养基不被认为在含血清的培养基中“培养”。
通过用0.5％胶原酶/分散酶处理来收获原代胎儿人膀胱来源的上皮细胞。膀胱来源的上皮细胞成片状脱离下来。然后用无菌镊子将细胞片置于间充质的顶部，并将组织在95％空气5％CO2的湿润空气中在37℃孵育过夜。第二天，将组织重组物移植到CD1裸鼠的肾囊下面。
移植后8周处死宿主小鼠，回收组织并在10％中性福尔马林中过夜固定。通过使用一系列梯度乙醇溶液将固定组织脱水，并在Histo-Clear溶液中透明。然后将组织包埋在石蜡中并以6μm切片。对于基本染色，将切片在Histo-Clear中脱蜡，在梯度乙醇溶液中重水化并用苏木精和曙红(H&E)染色。
对于免疫组织化学，使用了抗人平滑肌组织α-肌动蛋白、抗人uroplakin、抗人细胞角蛋白7和抗人细胞角蛋白19抗体。对于细胞角蛋白7和19免疫组织化学，进行抗原修复方案。简单地说，将切片浸泡在Target Retrieval溶液(Dako，Cat#1699，10×母液的1∶10稀释液)溶液中，用微波炉(Panasonic，Model NN-7523，120V，12.8A)高功率加热30分钟，然后冷却到室温(约25℃)。对抗人平滑肌α-肌动蛋白和uroplakin III不进行抗原修复。
将切片用Milli-Q H2O中的3％H2O2封闭20分钟，并用1×PBS洗涤3次，每次2分钟。然后用ImmedgeTM笔(Vector Laboratories，目录号H-4000)对切片画圈并用1×PBS中的0.5％Tween-20洗涤一次2分钟。将切片进一步用1×PBS中的5％山羊血清(封闭缓冲液)封闭1小时。加入第一抗体以覆盖切片(约500μl)。所用第一抗体为小鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白(Dako Cat#M0851，不稀释直接使用)、小鼠抗uroplakin III克隆AUI(Cat#RDI-PR0651108，Research Diagnostic Inc，.Flanders，NewJersey，1∶500稀释)、小鼠抗人细胞角蛋白7(Cat#18-0234，Zymed，1∶50)和小鼠抗人细胞角蛋白19 NCL-CK19(Cat#100902，Novocastra，1∶100)。第一抗体孵育在4℃下进行过夜。
过夜孵育后，除去多余的第一抗体并用含有0.5％Tween-20的1×PBS洗涤切片三次，每次2分钟。加入第二抗体——1∶500稀释的生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(Cat#E0433，Dako)(每个切片加500μl)，并在室温孵育1小时。再用含有0.5％Tween-20的1×PBS洗涤切片三次，每次2分钟，并用Vectastain ABC Elite试剂盒(Cat#PK-6100，Vector)根据生产商提供的方案处理。载片在含有0.015％过氧化氢的0.1M NaAc，(pH5.0)中的1mg/ml DAB溶液(二氨基联苯胺，Sigma，Cat#D-5905)中显影。最后，载片在水中洗涤，用苏木精(Cat#HXHHEGAL，AmericanMaster Tech Scientific)负染以鉴别核，并在梯度乙醇(70％，80％，95％，100％)(Harleco，Cat#65347/85)中脱水。
结果如图1和2所示。图1a显示了组织重组体的H&E染色切片。图1b、1c和1d分别显示了α-肌动蛋白、人细胞角蛋白7和人细胞角蛋白19染色。注意，细胞角蛋白染色限于组织重组体内形成的内衬内腔的上皮细胞层。图2a显示了用抗人uroplakin抗体的染色(图2b是只用第二抗体的对照)。染色局限于重组体中上皮细胞层的内腔表面，如在正常的原位膀胱上皮细胞中发现的一样。应该注意到抗uroplakin III抗体只染胎儿膀胱来源的上皮细胞的一部分，表明组织重组体中胎儿膀胱来源的上皮细胞的分化的可变水平。
实施例5人前列腺组织建模从新生(出生当天)Sprague-Dawley大鼠幼崽解剖精囊间充质并转移到含有1％胰蛋白酶的盘中并在4℃孵育90分钟。除去培养基并在含有20％FBS的DMEM中洗涤原基几次以中和胰蛋白酶活性。然后精囊上皮和连接的间充质在解剖显微镜下进一步分离。为了产生组织重组体，将没连接上皮的间充质置于含有具FBS的DMEM的0.4％琼脂板的表面上，将如实施例4所述培养和收获的人胎儿膀胱来源的细胞置于间充质上，允许其在95％空气5％CO2的湿润气氛中在37℃过夜粘附。应该注意，将间充质和组织重组体短暂暴露于含血清的培养基中不被认为在含血清的培养基中“培养”。
将组织重组体移植到雄性SCID小鼠的肾囊下。移植后6个月处死宿主并回收移植物。
如实施例4处理固定的组织，并通过免疫组织化学对前列腺特异抗原染色。对于免疫组织化学，将切片用histoclear脱蜡并通过系列乙醇到磷酸盐缓冲液进行水合。通过3％过氧化氢封闭内源过氧化物酶15分钟。然后在4℃用抗前列腺特异抗原的抗体(Dako corporation，California)孵育组织切片过夜。在PBS中洗涤样品然后在第二抗体(山羊抗小鼠生物素化抗体，dako corporation，California)中孵育，接着在亲和素-生物素复合物中孵育。染色在二氨基联苯胺(DAB)中进行。在水中充分洗涤样品以除去多余的DAB，在梯度乙醇中脱水，二甲苯中透明并用盖玻片封片。结果显示当膀胱上皮细胞与精囊间充质重组时已经在形态上和生化上分化成前列腺上皮细胞，如图3所示。
权利要求
1.人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体，其中所述细胞具有分化成膀胱或前列腺上皮的能力。
2.根据权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体，其中所述细胞维持在无血清的培养基中。
3.根据权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体，其中所述细胞的细胞表面基本无血清生物分子。
4.含有权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体的组织培养容器。
5.分离人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体的方法，包括(a)显微解剖人胎儿膀胱来源的上皮细胞的来源；(b)将膀胱来源上皮细胞的来源置于无血清营养培养基中放在足以支持胎儿膀胱上皮细胞的培养条件下，其中无血清培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物质；(c)维持足以允许胎儿膀胱来源的上皮细胞从膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清营养培养基中的适宜培养条件；(d)维持足以允许膀胱来源的上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；和(e)传代培养所述单层集落以得到膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。
6.根据权利要求5的方法，其中所述无血清营养培养基还含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。
7.人胎儿膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体，其通过包括下述步骤的方法制备(a)显微解剖人胎儿膀胱来源的上皮细胞的来源；(b)将膀胱来源上皮细胞的来源置于无血清营养培养基中放在足以支持胎儿膀胱上皮细胞的培养条件下，其中无血清培养基含有包括胰岛素、转铁蛋白、α-生育酚和抑酶肽在内的营养物质；(c)维持足以允许胎儿膀胱来源的上皮细胞从膀胱来源上皮细胞的来源迁移到无血清营养培养基中的适宜培养条件；(d)维持足以允许膀胱来源的上皮细胞形成单层集落的适宜培养条件；和(e)传代培养所述单层集落以得到膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体。
8.根据权利要求7的细胞群体，其中在所述方法中使用的无血清营养培养基还含有孕酮、角质细胞生长因子(KGF)和heregulin(HRG)。
9.给异源受体提供免疫原来源的方法，包括向所述受体施用有效量的权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞以在所述受体中诱导免疫应答。
10.在异源受体中引起免疫应答的方法，包括向所述受体施用有效量的权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞以在所述受体中诱导免疫应答。
11.产生从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化的人膀胱上皮细胞群体的方法，包括将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
12.从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化出的人膀胱上皮细胞群体，其通过包括下述步骤的方法产生将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
13.产生从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化出的人前列腺上皮细胞群体的方法，包括将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
14.从人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化出的人前列腺上皮细胞群体，其通过包括以下步骤的方法产生将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
15.在非人哺乳动物受体中产生人膀胱组织模型的方法，包括将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
16.人膀胱组织模型，其通过包括以下步骤的方法产生将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人膀胱上皮细胞的间充质组织离体重组。
17.在非人哺乳动物受体中产生人前列腺组织模型的方法，包括将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
18.人前列腺组织模型，其通过包括下述步骤的方法产生将权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞施用于非人哺乳动物受体身体内能够支持所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞生长的位置，其中所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞已经与能够实现所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞分化成人前列腺上皮细胞的间充质组织离体重组。
19.为至少一种药物的药物开发提供膀胱来源的组织特异性生物学组分的来源的方法，包括分离权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体，并用其所述膀胱来源的上皮细胞或这些细胞的任何细胞部分作为所开发的药物的靶标。
20.为至少一种药物的药物开发提供人胎儿膀胱来源的上皮细胞的来源的方法，包括提供权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体，并用其所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞作为所开发的药物的靶标。
21.提供用于生物测定的核酸或蛋白质的来源的方法，包括从权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞分离核酸或蛋白质和用所述核酸或蛋白质作为生物测定中的一种或多种主要组分。
22.提供用于生物测定的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的来源的方法，包括提供权利要求1的人胎儿膀胱来源的上皮细胞的群体，并在生物测定中使用所述人胎儿膀胱来源的上皮细胞。
全文摘要
本发明公开了人膀胱来源的上皮细胞的基本纯的群体，以及分离和培养膀胱来源的上皮细胞的方法。此外，还公开了人膀胱来源的上皮细胞和从其分化出的细胞的一些用途。
文档编号C12M3/00GK1638640SQ03805524
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月12日
发明者李荣皓, 潘壮宇 申请人:雷文生物技术公司