专利名称：新的高灵敏度核酸解析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及以使用稀土类荧光络合物标记试剂作为发光色素为特征的高灵敏度的SNP解析方法，更详细地讲，涉及以使用稀土类荧光络合物标记试剂作为发光色素，根据时间分辨荧光测定对荧光发光进行测定为特征的高灵敏度核酸单核苷酸多态性解析法。另外，本发明涉及由特定的稀土类荧光络合物标记试剂以及特定的荧光猝灭标记试剂的组合构成的荧光发光控制用组合物。另外，本发明还涉及在FRET探针等高灵敏度标记探针中使用稀土类荧光络合物标记试剂作为发光色素，而且作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂为特征的高灵敏度标记探针，以及含有该探针的SNP解析用试剂盒。
背景技术：
以往，作为人基因组DNA的单核苷酸多态性(缩写为SNP)解析法，有TaqMan PCR法，MALDI-TOF/MS法，DNA芯片法、Invader法、利用RCA(rolling circle amplification)的方法等方法。这些方法各有其特征，可以用于各种各样的SNP的解析。
TaqMan PCR法是利用PCR反应的SNP解析法，具有解析步骤少的优点(T.Morris等，J.Clin.Microbiol.，1996，34，2933.K.J.Livak等，Genet.Anal.，1999，14，143)。然而，该方法对于解析1种SNP由于需要2种荧光标记探针，所以存在着标记探针制作费用高的缺点。
MALDI-TOF/MS(Matris assisted laser desorption-time offlight/mass spectrometry)法虽然具有对于1SNP解析只使用一条不标记的引物就可完成的优点(L.A.Haff，Genome Res.，1997，7，378.P.Ross等，Nat.Biotechnol.，1998，16，1347)，但存在着作业的步骤非常多，涉及到靶区域的PCR扩增、PCR产物的纯化、引物的延伸反应、引物延伸反应产物的纯化、质量测定样品的点印、质量分析等的缺点。
DNA芯片法具有一次可以进行大量SNP解析的优点(D.G.Wang等，Science，1998，280，1077.J.G.Hacia等，Nat.Genet.，1999，22，164.P.N.Glles等，Nat.Biotechnol.，1999，17，365)。该方法由于在DNA芯片上进行杂交前需要PCR，对于解析大量的SNP存在着事前必需要进行大量的PCR的缺点。
Invader法SNP解析的步骤少，不需要PCR和荧光标记等位基因特异低聚物，只是将共通的突出端(flap)加到各个等位基因特异低聚物中即可。
图1作为模式图给出了利用Invader法的核酸单核苷酸多态性解析法的梗概。该方法就象图1所示的那样，是判定在被检体DNA(靶DNA)中的「N」位置存在成为SNP的碱基的方法。为此使用报告探针(第一探针)、侵略者探针(invader probe)(第二探针)、以及检测用的FRET探针(FREP probe)(荧光共振能量转移探针(FREP(FiorescenceResonance Energy Transfer)探针)。报告探针在从被检体DNA的SNP的位置开始的5’一侧含有互补的碱基序列，还含有称之为「突出端」的碱基序列部分。该突出端部分的碱基序列成为与FRET探针的3’一侧的碱基序列互补的碱基序列。另外，侵略者探针是在被检体DNA的3’一侧含有互补碱基序列的探针。SNP位置(图1中「N」表示的位置)中的被检体DNA的碱基「N」是单核苷酸多态性部位的碱基、A、T、G、C中的一个。报告探针的碱基「N1」是可与N形成正常的碱基对的碱基，而侵略者探针的碱基「N2」是任意的碱基。
FRET探针是在3’侧含有用于结合突出端部分的单链部分的探针。FRET探针的5’侧全部或一部分已经形成了双链。在图1中，5’侧的全部虽然已经表示为形成双链，但未必需要全部都变成双链，这里是为了说明，按照图1进行说明。而在FRET探针的5’侧的末端部分，结合有发光色素「Ln」和消光物质「Q」。消光物质「Q」存在于发光色素「Ln」的一定距离内时，发光色素的发光被消光，观察不到发光。
在Invader法中，首先在被检体DNA中结合报告探针和侵略者探针，此时报告探针的碱基「N1」和被检体DNA的碱基「N」的碱基对间象Invader(入侵者)那样插入了侵略者探针的碱基「N2」。表示这样状态的是图1最上段给出的状态。
如果使特异作用于这样的3碱基纠缠在一起的状态的裂解酶(结构特异性5’核酸酶structure-specific 5’nuclease)作用，则该裂解酶在碱基「N1」的位置切断报告探针，只使突出端部分的片段形成。然后该突出端部分与FRET探针的3’侧结合。表示该状态的是图1的中段。此时，含有突出端部分的碱基「N1」的前端部分变成了插入FRET探针的双链部分那样的状态。该状态是与先前的入侵的状态同样，成为裂解酶作用的特异切断位置。然后，利用该裂解酶，将FRET探针的5’末端侧从插入了突出端部分的部分切断。
被切断的FRET探针的5’侧结合着发光色素「Ln」，由于该切断，发光色素「Ln」与消光物质「Q」脱离，结果可以观察到发光色素「Ln」的发光。表示这样状态的是图1的最下段给出的状态。发光色素「Ln」由消光物质「Q」开放，变成显示出本来的发光。
在报告探针的碱基「N1」与被检体DNA的碱基「N」不能形成正常的碱基对时，由于不能形成入侵者那样的状态，也就不能被裂解酶切断。因此，可以通过发光判定被检体DNA的碱基「N」是否是可以与报告探针的碱基「N1」形成正常碱基对的碱基。
这样，在Invader法中，被检体DNA不用说了，无论是报告探针还是侵略者探针也都不需要标记，需要标记的只是FRET探针。而且该FRET探针只与突出端部分的碱基序列有关，特别是与突出端部分的碱基「N1」也没有关系，由于对被检体DNA的碱基序列完全没有影响，是与被检体无关，根据可任意决定的突出端部分的碱基产生的探针，具有可以大量生产，探针制作费用大幅度减少的优点。
然而，在以往的方法中，由于测定灵敏度不充分，为了解析1SNP，需要数十毫微克的基因组DNA，要解析大量的SNP，存在着需要大量基因组DNA的缺点。
发明的公开鉴于上述那样的状况，本发明目的在于提供高灵敏度的SNP解析方法，提供利用微量的被检体DNA可以迅速进行大量的SNP解析的SNP解析方法。另外，本发明的目的还在于提供高灵敏度的发光色素，更详细地讲是提供由高灵敏度的发光色素和消光物质构成的荧光发色组合物。另外，本发明还提供在核酸SNP解析法中提供使用用高灵敏度的发光色素和消光物质构成的FRET探针等高灵敏度标记探针，以及使用该探针的时间分辨荧光测定的最高灵敏度的SNP解析法。
附图的简单说明图1是表示利用invader法的SNP解析法的梗概的模式图。
图2是表示本发明的FRET探针的例子的梗概的模式图。
图3是以用BPTA-Tb3+和Dabcyl构成的FRET探针的情形为例模式地表示本发明的SNP解析法的图。
图4表示本发明的荧光猝灭标记试剂Dabcyl的吸收光谱以及本发明的稀土类荧光络合物标记试剂BPTA-Tb3+的荧光发光光谱。图4的横轴为波长(nm)，左侧的纵轴表示荧光强度，右侧纵轴表示吸收。
图5表示在本发明的方法中，伴随着被检体DNA的浓度变化而引起的荧光强度的变化。图5的横轴为被检体DNA(靶DNA)的浓度(pM)，纵轴表示荧光强度。
实施发明的最好方式以往，稀土类荧光络合物标记试剂强烈依赖于配体的构造和组成，有时也有强的荧光强度，几种稀土类荧光络合物标记试剂已经被用于时间分解荧光分析中。然而，这些试剂是利用稀土类荧光络合物标记试剂的强的荧光强度的试剂，有关利用稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂的组合的发光控制还没有开发。本发明通过特定稀土类荧光络合物标记试剂和特定荧光猝灭标记试剂的组合，发现可以进行发光的控制。
即，本发明涉及SNP的解析方法，其特征是在通过使用含有发光色素和消光物质的FRET探针的invader法的SNP的解析方法或通过使用发卡结构的探针的分子信标(molecular beacon)法的SNP的解析方法等方法中，作为在高灵敏度标记探针中的发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂。更详细地讲，本发明涉及以使用含有以下通式(1)～(6)表示的任一种配体形成的稀土类荧光络合物标记试剂为特征的SNP的解析方法。再详细地讲，涉及以作为消光物质使用以下通式(7)～(9)表示的任一个荧光猝灭标记试剂为特征的SNP的解析方法。再详细地讲，本发明涉及作为荧光测定法以使用时间分辨荧光测定为特征的高灵敏度SNP的解析方法。
另外，本发明还涉及由特定的稀土类荧光络合物标记试剂以及特定的荧光猝灭标记试剂的组合构成的荧光发光控制用组合物。更详细地讲，涉及到含有由以下通式(1)～(6)表示的配体和稀土类元素构成的稀土类荧光络合物标记试剂的1种或2种或其以上，以及由以下通式(7)～(9)构成的荧光猝灭标记试剂的1种或2种或其以上构成的荧光发光控制用组合物。
(1)～(6)中，n表示1～4的整数，R表示含有取代基的芳基，R’表示氨基、羟基、羧基、磺酸基、或异硫氰酸酯基)。
(式(7)～(9)中，m表示1～4的整数，R1、R2中任一方表示用于与载体或核酸进行固定的连接基，而另一方表示氢原子或烷基，R3表示用于对载体或核酸进行固定的连接基)。
另外，本发明涉及作为发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂，且作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂的FRET探针等高灵敏度标记探针，更详细讲，作为发光色素使用1种或2种或其以上由上述通式(1)～(6)表示的配体和稀土类元素构成的稀土类荧光络合物标记试剂，且作为消光物质使用1种或2种或其以上由上述通式(7)～(9)构成的荧光猝灭标记试剂的高灵敏度标记探针。
另外，本发明涉及含有上述本发明的高灵敏度标记探针的SNP解析用组合物或SNP解析试剂盒。
本发明的特征是作为图1中的发光色素，使用稀土类荧光络合物标记试剂「Ln」、更详细讲使用由上述通式(1)～(6)表示的配体和稀土类离子构成的稀土类荧光络合物标记试剂，且作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂「Q」，更详细地讲，使用由上述通式(7)～(9)构成的荧光猝灭标记试剂。
图2给出了本发明的FRET探针的例子。在该例子中，稀土类荧光络合物标记试剂「Ln」被表示在探针的5’末端，但本发明的FRET探针并不限定于此。本发明的FRET探针只要是荧光猝灭标记试剂「Q」位于对由稀土类荧光络合物标记试剂「Ln」引起的荧光进行消光的充分的距离，而且稀土类荧光络合物标记试剂「Ln」或荧光猝灭标记试剂「Q」位于当变成入侵者(invader)状态时被裂解酶切断后游离的位置，通过裂解，两者分离，两者的距离被保持在对于观察发光充分的距离即可，并不限定于图2例举的位置。
为了更具体说明本发明，作为稀土类荧光络合物标记试剂，使用铽离子和有机配体N，N，N1，N1-[2，6-双(3-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶]四乙酸(N，N，N1，N1-[2，6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-4-phenylpyridine]tetrakis(acetic acid))(上述通式(2)中的置换基R为苯基的物质，以下缩写为BPTA)构成的铽络合物荧光标记试剂(以下缩写为BPTA-Tb3+)，作为荧光猝灭标记试剂使用式(9)表示的化合物(以下缩写为Dabcyl)进行说明。BPTA以及其N-羟基酰琥珀酰亚胺单酯(缩写为NHS-BPTA)的合成根据本发明人报道的方法(J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem.，2001，73，1869)进行。BPTA-Tb3+的化学结构如下。
另外，作为DNA寡核苷酸使用如下序列。作为被检体DNA使用如下的序列，3TGTGTCACAGGAGGGCGAGGAGGACTCGTGGGAGGAGGAGAAGG5′作为报告探针使用如下序列5′AACGAGGCGCACCCCTCCTCCTCTTCC3′作为侵略者探针使用如下序列。
5′ACACAGTGTCCTCCCCGCTCCTCCTGAGCAC3′作为对稀土类荧光络合物标记试剂BPTA-Tb3+以及荧光猝灭标记试剂Dabcyl进行了固定化的FRET探针使用如下结构的探针。
使用这些试剂，根据图1所示的invader法的概要，进行实验。图3给出了具体方法的概要。图3的被检体DNA(靶DNA)的下划线部分表示要检测SNP的位置。
测定了Dabcyl的吸收光谱和BPTA-Tb3+的荧光发光光谱，结果如图4所示。图4的横轴为波长(nm)，左侧的纵轴表示荧光强度，右侧纵轴表示吸收。图4的虚线表示Dabcyl的吸收光谱，实线表示BPTA-Tb3+的荧光发光光谱。
通过将Dabcyl的吸收光谱和BPTA-Tb3+的荧光发光光谱重合，两者一靠近，BPTA-Tb3+的荧光发光被Dabcyl消光。反之，两者一离开，BPTA-Tb3+可以发出强荧光。即，在FRET探针中，由于Dabcyl和BPTA-Tb3+处于近距离，BPTA-Tb3+的荧光被消光。然而，随着图3所示的反应，BPTA-Tb3+标记碱基部位依次被切断，当BPTA-Tb3+与Dabcyl一分离，随之BPTA-Tb3+的荧光随着切断反应逐渐增强。通过用时间分辨荧光测定法测定该荧光，可以对处于靶DNA的SNP进行解析。
相反，当靶DNA中没有SNP时，由于不会发生第一探针、第二探针和靶DNA杂交反应后的切断反应，其突出端和FRET探针的杂交反应和其反应后的切断反应也不会发生，所以虽然可以测定由非特异反应引起的少量的荧光增强，但测不到象有SNP时那样的BPTA-Tb3+的强荧光增强。
图5表示伴随着被检体DNA的浓度变化而引起的荧光强度的变化。图5的横轴为被检体DNA(靶DNA)的浓度(pM)，纵轴表示荧光强度。被检体DNA(靶DNA)的浓度为0的位置表示背景的荧光强度。结果，检测灵敏度如果以背景+2SD(标准偏差)作为基准，大约是0.008pM(8×10-15M)。这与以往的使用有机物标记试剂的方法相比，可知是约2个数量级的高灵敏度。
因此，作为发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂，且作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂的本发明方法与以往的使用有机荧光标记试剂的方法相比，灵敏度极高，而且反应后的荧光信号/噪音比也大。这是由于稀土类荧光络合物标记试剂引起的荧光寿命非常长，所以反应后的荧光信号长，可以利用时间分解测定法，而且可以有效地除去具有短荧光寿命的背景噪音的缘故。在使用以往的用有机荧光色素构成的FRET探针时，例如使用荧光素和Cy3构成的FRET探针时(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，8272)，对于反应后的荧光素的荧光测定，由于Cy3对于荧光素的荧光极大波长也有强的荧光，所以产生大的背景噪音。而在本发明的方法中，由于可以使用时间分解测定法，可完全除去只有短荧光寿命的Cy3的荧光，获得最高灵敏度的测定。另外，作为稀土类荧光络合物标记试剂使用铕荧光络合物标记试剂以及作为荧光猝灭标记试剂使用Cy5时也可以获得同样的结果。
本发明的稀土类荧光络合物标记试剂是由稀土类元素的络合物构成的。作为稀土类元素可列举镧系的各种元素，优选钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)、或镝(Dy)等。这些稀土类元素即使是0价的状态也可以，通常为离子状态，优选以3价阳离子的状态形成络合物。
作为本发明的稀土类荧光络合物标记试剂的优选配体，可列举上述通式(1)～(6)表示的配体。在上述通式(1)～(6)表示的配体中，作为取代基R的芳基，可列举苯基或萘基等碳环式芳香族基、环中含有1～3个氮原子、氧原子或硫原子的5～7员的杂环芳香族基。这些芳香族基可以是单环式、多环式、或缩合环式的。作为优选的芳基，可列举苯基、噻酚基、吡啶基等。取代基R的芳基含有取代基时，作为该取代基优选氨基、羟基、羧基、磺酸基、异硫氰酸酯基等极性官能团。也可以是这些官能团的烷基衍生物或卤化衍生物。作为更优选的取代基，可列举氨基、羧基、异硫氰酸酯基等。
在上述通式(1)～(6)表示的配体中，取代基R’可以例示氨基、羟基、羧基、磺酸基或异硫氰酸酯基，但并不限定于这些，优选极性的官能团。另外，也可以是这些官能团的烷基衍生物或卤化衍生物。作为更优选的取代基，可列举氨基、羧基、异硫氰酸酯基等。
作为本发明的荧光猝灭标记试剂的优选例子，可列举上述通式(7)～(9)表示的化合物。
本发明的通式(7)表示的荧光猝灭标记试剂的取代基R1、R2至少有一方是用于与载体或核酸进行固定的连接基。取代基R1、R2的另一方不是连接基时，剩下的一方表示氢原子或烷基，优选是表示烷基。作为本说明书中的烷基，是碳数1～20、优选是碳数1～10、碳数1～7的直链或支链状的烷基。作为优选的烷基，可列举甲基、乙基、异丙基等。另外作为通式(7)～(9)中的取代基R1、R2或R3的用于固定于载体或核酸的连接基，只要是具有用于固定于载体或核酸的适当的长度和用于固定化的反应性的基团的连接基都可以，可以根据载体或核酸的种类适当选择。作为这样的连接基是通过碳数3～30、碳数5～20，优选是碳数5～15的直链状的亚烷基与目的载体或核酸结合的连接基，这些亚烷基的1个或2个或其以上的碳原子可以用氧原子、氮原子、硫原子等其他原子取代，另外这些亚烷基的1个或2个或其以上的碳原子、氮原子或硫原子也可以被氧代(＝O)、卤素、羟基、氨基、烷基等取代。
本发明中使用的修饰FRET核酸探针(修饰DNA寡核苷酸)的制备法可以根据任一个众所周知的核酸探针制备法进行。例如，寡核苷酸的合成可以通过任一个磷酰亚胺法(ホスホロァミダイト法)使用DNA自动合成仪进行。纯化可以利用反相HPLC进行。另外荧光猝灭标记试剂的导入可以使用例如下面的化学式(10)表示的Dabcyl-dT，
或下面化学式(11)表示的TAMRA-dT， 或下面化学式(12)表示的Cy3-dC， 或下面化学式(13)表示的Cy5-dC等色素的衍生物，
(式(10)～(13)中，DMTO表示4-单甲氧基三苯甲基，iPr表示2-丙基)，按照常规方法进行。
另外，稀土类荧光络合物标记试剂的导入，使用5’末端等氨基修饰了的寡核苷酸，与由化学式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)表示的任一个配体和稀土类离子构成的荧光络合物标记试剂反应即可，纯化可以通过反相HPLC或电泳、凝胶过滤色谱进行。
作为本发明的高灵敏度标记探针，是在SNP解析用中使用的标记探针，是使本发明的稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂组合后可以使用的标记探针。作为本发明的高灵敏度标记探针，可列举例如，invader法中的FRET探针、分子信标法中的具有发卡结构的探针、TaqManPCr法中的TaqMan探针，但并不限定于这些探针。
另外，日本专利申请2002-063960说明书、以及日本专利申请2003-061958说明书记载的内容都收入到了本说明书。
实施例以下通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1(铽荧光标记试剂BPTA-Tb3+的制造)铽荧光标记试剂BPTA-Tb3+是由铽离子和有机配体BPTA构成的络合物，BPTA以及其N-羟基琥珀酰亚胺单酯(缩写为NHS-BPTA)根据本发明人报道的方法(J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem..2001，73，1869)制造。
实施例2(DNA寡核苷酸的制备)图3所示寡核苷酸都是通过磷酰亚胺法使用DNA自动合成仪合成的。纯化使用反相HPLC进行。被检体DNA(靶DNA)中带下划线的碱基表示SNP的部位。
FRET探针的制备首先通过DNA自动合成仪合成用5’氨基和Dabcyl修饰的DNA寡核苷酸，再用NHS-BPTA-Tb3+标记其5’氨基制备的。
实施例3(SNP测定)被检体DNA(靶DNA)的SNP测定根据以往方法(例如文献NatureBiotechnology，1999，17，292以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，8272所述的方法)进行。图3给出了其原理。即，向含有报告探针(第一探针)、侵略者探针(第二探针)、被检体DNA(靶DNA)和FRET探针的溶液中作为裂解酶加入突出端内切核酸酶I同功酶，于63℃下温育4小时后，进行时间分辨荧光测定。
测定装置是ARVO 1420(Wallac公司生产)。测定条件延迟时间为0.4毫秒，窗口时间(window time)为0.4毫秒，循环时间(cycle time)为1.0毫秒，激发波长＝320nm，测定波长＝545nm。
实施例4 BPTA在分子信标法中的应用(1)为了使BPTA应用于使用分子信标法的分子杂交信号的检测中，进行了如下所述的实验。
作为希望检测的靶序列合成了含有5’-GCTGGAGGGATGATACTTTGCA-3’序列的寡核苷酸。
作为分子信标使用的探针制备在5’末端通过(CH2)6间隔结合BPTA，在3’末端作为消光剂含有付加了DABCYL(4-二甲基氨基偶氮苯-4’-磺酰基)基团的5’-CCAAGCGCAAAGTATCATCCCTCCAGGCTTGG-3’序列的寡核苷酸。另外该序列中的5’-末端一侧和3’-末端一侧的6个残基是互补的，当这些序列间的序列与互补的碱基序列不杂交时，设计成形成茎结构，BPTA和DABYL应当存在于分子中、附近，BPTA激发的波长区域的光被DABCYL基吸收，结果来自BPTA的荧光被消光。
另外，作为非靶寡核苷酸使用5′-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3′序列。
反应在含有50μl的2mM MgCl2-0.6μM TbCl3的15mM Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液中，使用上述0.2μM的分子信标和0.6μM的靶序列(或非靶的)寡核苷酸，于室温下进行5分钟。反应后，作为杂交信号来自BPTA的荧光用WALLAC公司生产的ARVOTMSX 1420MultilabelCounter进行测定。另外，将没有添加靶序列(或非靶的)寡核苷酸的反应液作为反应的空白。
表I给出了测定结果。靶序列与非靶序列的荧光强度相比可以获得有意义的高信号。
表I序列 荧光强度靶序列 803,760非靶序列 95,728实施例5 BPTA在分子信标法中的应用(2)应用实施例4中使用的DABCYL的消光功能，使用BPTA标记寡DNA，检测DNA-碱基的差别。
在本实施例中，作为靶DNA，合成具有表II所示的碱基序列的4种寡核苷酸。
表II靶序列 碱基序列A5′-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3 ′B5′-CCATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3′C5′-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3′D5′-CCATGGTGTCTGTTTTAGGTTGCT-3′这些寡核苷酸设计成只是从5’末端开始的第16个碱基不同，其他序列都一样。作为BPTA标记探针，制备在5’末端含有通过(CH2)6间隔付加了BPTA的5’-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-3’序列的寡核苷酸。该序列与表II的靶序列A完全互补。而且，在适当的条件下，与存在1碱基错配(mismatch)的靶序列B～D相比，可以与靶序列A进行特异杂交。
另一方面，制备具有5’-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3’序列，3’末端付加了DABCYL的寡核苷酸(消光用寡核苷酸)。该序列由于与上述的BPTA标记探针的5’末端一侧1～20碱基序列互补，可以进行杂交，预期可以使来自游离的BPTA标记探针的荧光消光。因此，可以通过靶序列A(完全互补的序列)与B～D(有一个碱基不同的序列)间的信号强度差区分一个碱基的差别。
反应在含有50μl的2mM MgCl2-3μM TbCl3的15mM Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液中，使用上述1μM的BPTA标记探针和2μM的具有靶序列的寡核苷酸，2μM的消光用寡核苷酸，于室温下进行30分钟。反应后，作为杂交信号的来自BPTA的荧光用WALLAC公司生产的ARVOTMSX 1420 Multilabel Counter进行测定。另外，将没有添加靶序列(或非靶的)寡核苷酸的反应液作为反应的空白。
结果III所示。
表III靶序列荧光强度A 5,526,292B 344,573C 432,303D 496,235结果，完全互补的序列的信号与差别一个碱基的序列的信号相比可以获得有意义的高信号。即可以区分碱基序列中的一个碱基的差别。
产业上应用的可能性本发明提供利用用稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂构成的FRET探针，基于时间分辨荧光测定的高灵敏度核酸SNP解析法。利用本发明的方法即使被检体DNA的浓度约为0.008pM(8×10-15M)也可以解析，可以用极少量被检体DNA解析大量的SNP。
另外，利用本发明的方法，由于可以有效地除去具有短荧光寿命的背景噪音，所以，反应后的荧光信号/噪音比大，可以使解析精度显著提高。
序列表<110>松本和子<120>新的高灵敏度核酸解析法<130>JA924409<150>JP2002-063960<151>2002-03-08<150>JP2003-061958<151>2003-03-07<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>44<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>靶DNA<400>1ggaagaggag gagggtgctc aggaggagcg ggaggacact gtgt 44
<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一探针<400>2aacgaggcgc acccctcctc ctcttcc27<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二探针<400>3acacagtgtc ctcccgctcc tcctgagcac 30<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FRET探针
<400>4tcttgtctcg gtttttccga gacaagagtg cgcctcgtt 39<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>5gctggaggga tgatactttg ca 22<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子信标<400>6ccaagcgcaa agtatcatccctc caggcttgg 32
<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>7ccatggtgtc tgtttgaggt tgct 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>8ccatggtgtc tgtttcagg ttgct 24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列
<400>9ccatggtgtc tgtttaaggt tgct 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>10ccatggtgtc tgttttaggt tgct 2权利要求
1.一种SNP解析方法，其特征是在通过使用含有发光色素和消光物质的FRET探针的invader法的SNP的解析方法中，作为FRET探针中的发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂。
2.权利要求1所述的方法，其中稀土类荧光络合物标记试剂作为配体是含有以下通式(1)～(6)表示的任一种化合物， (式(1)～(6)中，n表示1～4的整数，R表示含有取代基的芳基，R’表示氨基、羟基、羧基、磺酸基、或异硫氰酸酯基)。
3.权利要求1或2所述的方法，其中稀土类荧光络合物标记试剂的稀土类元素是钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)、或镝(Dy)。
4.权利要求1～3中的任一项所述的方法，其中FRET探针中的消光物质是荧光猝灭标记试剂。
5.权利要求4所述的方法，其中荧光猝灭标记试剂是以下通式(7)～(9)表示的物质， (式(7)～(9)中，m表示1～4的整数，R1、R2中任一方表示用于与载体或核酸进行固定的连接基，而另一方表示氢原子或烷基，R3表示用于与载体或核酸进行固定的连接基)。
6.一种SNP解析方法，其特征是在权利要求1～5任一项所述的方法中，利用时间分辨荧光测定法测定荧光发光。
7.一种荧光发光控制用组合物，是由稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂的组合构成的，其中稀土类荧光络合物标记试剂是由含有以下通式(1)～(6)表示的配体中的至少1种的稀土类荧光络合物标记试剂的1种或2种以上构成的， (式(1)～(6)中，n表示1～4的整数，R表示含有取代基的芳基，R’表示氨基、羟基、羧基、磺酸基、或异硫氰酸酯基)，而荧光猝灭标记试剂是由以下通式(7)～(9)表示的物质的1种或2种以上构成的， (式(7)～(9)中，m表示1～4的整数，R1、R2中任一方表示用于与载体或核酸进行固定的连接基，而另一方表示氢原子或烷基，R3表示用于与载体或核酸进行固定的连接基)。
8.权利要求7所述荧光发光控制用组合物，其中稀土类荧光络合物标记试剂的稀土类元素是钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)、或镝(Dy)。
9.权利要求7或8所述荧光发光控制用组合物，荧光发光控制用组合物是SNP的解析用的物质，该SNP解析的特征是在通过使用含有发光色素和消光物质的FRET探针的invader法的SNP解析方法中，作为FRET探针中的发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂。
10.一种高灵敏度标记探针，其特征是在含有发光色素和消光物质的SNP解析用高灵敏度标记探针中，作为发光色素使用稀土类荧光络合物标记试剂，作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂。
11.权利要求10所述的高灵敏度标记探针，其中稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂是由权利要求7～9中任一项所述的稀土类荧光络合物标记试剂和荧光猝灭标记试剂的组合构成的。
12.权利要求10或11所述的高灵敏度标记探针，其中高灵敏度标记探针是FRET探针。
13.权利要求10或11所述的高灵敏度标记探针，其中高灵敏度标记探针是分子信标的探针。
14.一种SNP解析用试剂盒，含有权利要求10～13中任一项所述的高灵敏度标记探针形成。
全文摘要
本发明目的在于提供高灵敏度的SNP解析方法，更详细地讲，目的是提供利用微量的被检体DNA可以迅速进行大量的SNP解析的SNP解析方法。本发明还涉一种SNP解析方法，其特征是在通过使用含有发光色素和消光物质的FRET探针的invader法的SNP的解析方法中，作为FRET探针中的发光色素使用铕或铽等稀土类元素形成的稀土类荧光络合物标记试剂。另外，本发明还涉及由特定的稀土类荧光络合物标记试剂以及特定的荧光猝灭标记试剂的组合构成的荧光发光控制用组合物。另外，本发明还涉及在FRET探针等高灵敏度标记探针中使用稀土类荧光络合物标记试剂作为发光色素，而且作为消光物质使用荧光猝灭标记试剂为特征的高灵敏度标记探针，以及含有该探针的SNP解析用试剂盒。
文档编号C12N15/09GK1639334SQ0380552
公开日2005年7月13日 申请日期2003年3月10日 优先权日2002年3月8日
发明者松本和子, 袁景利 申请人:松本和子, 三菱丽阳株式会社