专利名称：底物定量方法
技术领域：
本发明涉及用氧化还原酶电化学定量试样中所含底物的定量方法。
背景技术：
已开发多种简易地测定及定量试样中存在的特定底物的方法。其中，近年利用酶所具有的底物选择性的催化作用进行高选择性测定及定量的方法引人注目，部分方法作为定量体液中特定成分的方法，使用于临床检查领域，以及一般人自我检查的领域。
对葡萄糖的电化学定量法进行说明，作为定量测定试样中的底物的方法的一例。葡萄糖氧化酶(以下简称GOx)是选择性催化葡萄糖氧化的酶。在含GOx和葡萄糖的反应液中，如存在一定量的氧化型电子载体(将反应中生成的电子从酶传递到电极的化合物)，随着葡萄糖的氧化，氧化型电子载体被还原，生成还原型电子载体。利用施加直流电流的电极氧化生成的还原型电子载体，测定流过的电流。这时流过的电流，跟GOx与葡萄糖反应生成的还原型电子载体的量成比例，且该还原型电子载体的量与葡萄糖的含量成比例，通过这一测定可定量葡萄糖。
在电极上干燥和载体酶和电子载体，可能制成生物传感器电极元件。基于这样的技术的一次性葡萄糖传感器的开发，近年受到人们关注。其代表例为日本特许第2517153号说明书所示的生物传感器。一次性葡萄糖传感器中，只要在可装卸的连接于测定器的传感器元件中引入试液，便容易测定葡萄糖浓度。
以上说明了简单地测定和定量试样中存在的特定底物的方法，作为一般的电化学测定法之一，而不是底物定量法，因在电极上施加交流电位而不加直流电位，所以存在测定所得的电信号的方法(以下称交流法)。这主要是得到有关于电极/电解液界面的结构的信息的方法，它是通过这样的测定法例如评价二次电池的载体活性物质的电极的特性。
如上所述，通过使用酶可实现底物选择性较高的测定，但至今所用的施加直流电位的电化学测定中，试样中所含的测定对象，即底物以外的物质的影响会引起测定误差。例如，以血液作为试样进行电化学测定的场合，血液中所含的抗坏血酸(维生素C)。尿酸及对乙酰氨基酚等易氧化的化合物会成为引起误差的原因。在施加直流电位的测定中这样的会产生误差的物质称为干扰性物质(interferingsustance)。
以下用图5说明以前的方法中干扰性物质产生电流误差的原因。图5是表示溶解有GOx、电子载体和葡萄糖的溶液，以及干扰性物质的溶液所得的电极电位和电流的关系的图。用以前的方法定量葡萄糖时，通常在电极上施加能使电子载体充分氧化的电位E1，而得到电流。在电极上施加E1的场合，如图5所示，干扰性物质在电极上也充分进行电化学氧化。因该干扰性物质的电化学氧化而流过的电流(I3)与葡萄糖的相应电流(I1)重叠，所以葡萄糖的测定产生正误差。假定使用可使电子载体中等程度氧化的电位，例如图5所示的E2，也不能避免干扰性物质的电流，而且干扰性物质产生的电流在总电流中所占比例增加，S/N比值恶化。
如使用具有比干扰性物质不被氧化的电位E3负的氧化还原电位的化合物作电子载体，理论上不发生误差。用这样的化合物进行葡萄糖定量已作了几次尝试。但在该情况下，由于GOx与该化合物间的电位差变小，它们之间的电子移动速度非常慢，或者根本不发生。结果是进行葡萄糖定量的电流，其检出的可能限度并没变大，或者为检出电流要很长时间，而且不能得到全部电流，这是它的问题。
而且干扰性物质的血浓度因人而异，且同一个体也每天有所变化。因此预测干扰性物质的血中浓度产生的测定误差，对其进行校正，在以前的测定中是非常困难的。
为校正或除去干扰性物质的影响，已尝试了各种方法。例如美国专利6340428号公报中揭示了除了工作电极和对电极以外，还设置测定干扰性物质用的第三电极校正干扰性物质的影响，和传感器。通过在进行酶反应以及其后用工作电极测定底物之前，用第三电极进行试样中所含干扰性物质的测定，可实现良好的校正。
作为除去干扰性物质的影响的方法，开发了通过将阻滞干扰性物质向电极扩散的膜配置在电极上，抑制干扰性物质所产生的电流的方法。例如Wang，J.等在Electroanalysis 1996，8，1127-1130中揭示了聚(邻苯二胺)膜的使用。
这样，用于测定和定量试样中存在的特定底物的以前使用直流电位的电化学方法中，为实现干扰性物质的影响校正或除去，必须使传感器元件或电极的结构变得复杂。
本发明考虑到以前的上述问题，目的在于提供一种通过结构简单的测定体系，能正确定量试液中所含底物而不产生干扰性物质引起的测定误差的方法。
发明内容
本发明涉及底物的定量方法，它是使用电极系统和试剂系统，定量含有溶解的干扰性物质和底物的试液的上述底物的方法，其特征为包括下列工序(a)在含氧化还原酶及电子载体的试剂系统存在下，向包括工作电极和对电极的电极系统中供给含溶解的干扰性物质和底物的试液的工序，(b)在上述工作电极上施加交流电位，使上述电子载体发生氧化还原反应的工序，(c)用上述电极系统测定上述氧化还原反应产生的电信号的工序，以及(d)根据上述电信号定量上述底物的工序。
在上述工序(a)中，较好将上述工作电极和上述对电极配置在同一平面上。
在上述工序(a)中，较好将上述工作电极和上述对电极隔着空间相对配置。
上述底物的定量方法，较好再包括在上述工作电极上施加直流电位的工序(e)，以及测定上述工序(e)中产生的电信号的工序(f)。
上述工序(b)中，较好是上述交流电位的中心电位，相对于上述电子载体的氧化还原电位，在-0.1V～+0.1V的范围内，并且在上述干扰性物质的上述工作电极上的反应处于扩散控速区域的电位范围中，是比最负的电位负0.05V的电位更正的电位。
上述电信号较好是阻抗。
上述电极系统较好还包括参比电极。
上述工作电极较好是旋转圆盘电极或微电极。
上述氧化还原酶较好是葡萄糖氧化酶或吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，上述电子载体较好是二茂铁羧酸。
上述氧化还原酶较好是吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，上述电子载体较好是六氰酸钌。
图1是本发明一实施例所用的生物传感器除去试剂系统后的立体图。
图2是显示图1的生物传感器主要部分的纵截面图(X-X线截面图)。
图3是标出本发明实施例中阻抗Z的实数部分和虚数部分的图。
图4是显示用于实施本发明底物的定量方法的测定装置的一例的结构的图。
图5是表示以前的方法，由溶解有GOx、电子载体及葡萄糖的溶液以及干扰性物质的溶液所得的电极电位和电流的关系的图。
发明实施方式本发明的底物定量方法，其特征在于，包括(a)在含氧化还原酶及电子载体的试剂系统存在下，向包括工作电极和对电极的电极系统供给含溶解有干扰性物质和底物的试液的工序，(b)在上述工作电极上施加交流电位，使上述电子载体发生氧化还原反应的工序，(c)用上述电极系统测定上述氧化还原反应产生的电位号的工序，以及(d)根据上述电信号定量上述底物的工序。
使用这样的本发明的底物定量方法，可能不受干扰性物质影响而进行底物的测定。其理由说明如下交流测定是用某个恒定的直流电位作中心电位，使振幅微小的交流电位成分与该中心电位重叠，使所含的交流电位施加在工作电极上，测定所得电信号的测定法。可用例如图4所示的装置作测定装置。
图4所示的测定装置包括波发生器2、i/E转换器(converter)3、锁定放大器4、恒电位计(稳压器)5及低通滤波器6。用波形发生器2生成交流电位，以恒电流计5控制中心电位。然后生物传感器1的工作电极上的反应产生的电流由i/E转换器3转换成电信号，经锁定放大器4及低通滤波器6，分别得到交流成分和直流成分。通过利用这些成分，如后所述，可进行底物的定量。
以下一边与直流循环伏安法相比较，一边对交流测定进行说明。首先考虑用干扰性物质不溶解的试液，而使用与上述本实施方式的底物定量方法同样的电极系统和试剂系统的场合的直流循环伏安法。这一场合观测电流(I)与电位(E)之间的所谓催化波。即使在电位扫描速度快的场合，通常也可得到不含电子载体引起的阳极(或阴极)峰的S形波形。在得到此S形波形的系统中，如用较慢的电位扫描速度进行直接循环伏安法测定，几乎不能观测到阳极波与阴极波之间的滞后。因此这一场合电流变化对电位变化的比(dI/dE)，根据欧姆定律，实际上表示系统的电阻成分(R)的倒数。
下面考虑同样系统进行交流测定的情况。如上所述，在用较慢的电位扫描速度的直流循环伏安法中几乎不存在滞后，与此同样，在用较低频率进行交流测定时，交流电流(Iac)和交流电位(Eac)之间几乎不产生相位差。因而这时系统的电阻成分阻抗(Z)来自dIac/dEac。测定后，将其实数部分标给于横轴，负的虚数部分标给于纵轴(复阻抗标给)。由于如上所述，在较低频率时电流—电位间几乎没有相位差，标给的数据组存在于实数轴附近，有某一较大的|Z0|。如慢慢提高频率，系统的电容成分出现影响，因而Z的大小减小，标绘的数据组形成近似于直径|Z0|的圆弧的曲线。
交流法中的dIac/dEac与直流循环伏安法同样，随着系统所含底物量的增加而增大。因此复阻抗标绘中的|Z0|随底物量的增加而减少，结果，所得圆弧直径的大小随底物量的增加而减少。因而通过测定交流法所得的电信号，可能测定或定量试液中所含底物的量。这里，如设定施加在工作电极的交流电位的中心电位在电子载体的氧化还原电位附近(例如图5中E2附近)，dIac/dEac变大，且随着底物的量发生变化，电信号的变化量变大，较为理想。
另一方面，考虑使用仅含干扰性物质的场合。这一场合，在干扰性物质在电极上的反应几乎处于扩散控速的电位范围(如图5中E4～E1)内，直流循环伏安法中的dI/dE的大小变得实际上几乎可以忽略。因此，在交流测定中，施加在工作电极上的交流电位的中心电位处在上述电位范围内的场合，干扰性物质引起的电流变化(dIac/dEac)相对于电位调制实际上几乎不存在。
在电极上并行地进行多个电化学反应的场合，所得的电流基本上是各电化学反应流过的电流的简单的和。例如，在图5中两个溶液组成组合起来的电解液中，用电位E1的场合，所得电流为I＝I1+I3.这样，关于电流与电位的关系以及由此关系所得的R和Z的讨论，即使使用底物和干扰性物质混合而成的试液，并使用与上述本实施方式的底物定量方法同样的电极系统和试剂系统的场合，上述含底物的电解液，并单独含干扰性物质的电解液的说明，对底物及干扰性物质仍分别成立，其结果，例如电位E2附近的dIac/dEac与上述含底物而不含干扰性物质的电解液所得结果实际上基本相同，干扰性物质对dIac/dEac基本没有影响。
根据以上理由，按照本发明一实施方式的底物定量方法，可能进行底物的定量而不受干扰性物质影响。
本发明的底物定量方法的上述工序(a)中，较好将上述工作电极和上述对电极配置在同一平面上。这样可能更简便地定量底物。
该情况下，可使用包括绝缘性的(第1的)基板、含配置在上述(第1的)基板上的工作电极及对电极的电极系统，以及含氧化还原酶及电子载体的试剂系统的生物传感器。
上述工序(a)中，较好将上述工作电极和上述对电极隔着空间相对配置。
这一场合，可使用包括绝缘性的第1基板、绝缘性的第2基板、含有配置在上述第1基板上的工作电极和配置在上述第2基板上的对电极的电极系统，以及含氧化还原酶及电子载体的试剂系统的生物传感器。
这里，本发明的底物定量方法，较好还包括在上述工作电极上施加直流电位的工序(e)、测定上述工序(e)产生的上述电信号的工序(f)。这样，工序(f)中测得的上述电信号，由于含有有关底物和干扰性物质的信息，通过与交流测定组合，可能根据工序(c)中测定的电信号及工序(f)中测定的电信号，不仅定量底物，还可定量干扰性物质。
交流电位的中心电位，较好设定在电子载体的氧化还原电位附近。上述中心电位，相对于电子载体的氧化还原电位，较好是在-0.4V～+0.4V的范围内，更好是在-0.1V～+0.1V的范围内。
交流电位的中心电位(Ecen(V))较好设定在干扰性物质在工作电极上的反应为扩散控速区域的电位范围内或在其附近。特别好是相对于干扰性物质的在工作电极上的反应为扩散控速区域的电位范围中最负的电位(Emin(V))负0.05V的电位更正的电位，即上述中心电位和上述最负电位，满足Ecen＞Emin-5(V)。这样，相对于施加在工作电极上的电位的调制，可使电子载体产生的电流变化变大，且干扰性物质产生的电流变化几乎没有。因此用底物和干扰性物质混合的试液以交流法测定底物，可能更完全地排除干扰性物质的影响。
这些电子载体的氧化还原电位、以及干扰性物质的反应成为扩散控速的电位，可用溶解了上述物质的0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)制成电解液，与适当的参比电极组合，而用玻璃碳或金属电极作工作电极，根据循环伏安法估算。
生物传感器载持的电子载体的氧化还原电位，可通过用上述磷酸缓冲液从生物传感器中与共存物一起溶解、提取电子载体，用所得的液体进行循环伏安法估算。
施加在工作电极上的交流电位是指相对于与上述工作电极一起组合而使用的对电极或参比电极的电位(电压)。而本发明中的交流电位(电压)，可以是具有依赖于时间t而连续或离散地调制的波形的电位，是包含近似的交流电位的概念。即本发明中的交流电位，可以是至少周期地满足E(t1)＜E(t2)及E(t2)＞E(t3)或者E(t1)＞E(t2)及E(t2)＞E(t3)(其中t1＜t2＜t3)的电位。作为含有这种波形的波，可例举正弦波、矩形波及阶梯形波等。
本发明底物定量方法中所用的电信号，只要是随着电化学反应的进行发生变化的电信号即可，例如可列举电流、导纳、阻抗等。其中，在施加的电位具有正弦波、或实际上近似正弦波的阶梯形波的波形时，电信号较好是阻抗。作为电信号也可用电流或导纳，但较好是将它们转换成阻抗，根据所得的阻抗输出底物的量。在施加矩形波的场合，得到电流作为电信号，根据该电信号的时间和对交流电位的依赖性(变化)，可得到关于底物的量的信息。
电极系统较好还包括参比电极。这样，由于施加在工作电极上的电位稳定，可更稳定地进行底物测定。作为所用的参比电极，可用Ag/AgCl或饱和甘汞电极(SCE)等，但并不限于此，只要是电位稳定的电极，也可使用其他电极。
本发明的底物定量方法中所用的工作电极，可无特别限制地使用以前公知的工作电极。其中，工作电极较好是旋转圆盘电极(以下简称RDE)或微电极。如使用以一定速度旋转的RDE，或者其电极面积使电子载体向电极表面的侧向扩散对电化学反应影响程度小的微电极，与使用静止的大电极(bulk electrode)的情况比较，可使电子载体对于施加于工作电极的电位的调制产生的电流变化变得更大。因此可使对于底物的敏感性更加提高。微电极的半径(圆形的场合)较好是50μm，更好在50μm以下、20μm以上。另外，在使用这些电极的直流伏安图中，即使在无催化反应的场合以及电位扫描速度较大的场合，阳极和阴极波之间的滞后也非常小，这也提示，可用更高频率稳定地进行本发明用交流法的底物测定。
作为本发明的底物定量方法中使用的溶解干扰性物质的试液，可用溶解底物和干扰性物质的溶液，以及溶解底物和干扰性物质的体液，如血液、血浆、血清、尿及间质液等。作为干扰性物质可列举抗坏血酸(维生素C)、尿酸及对乙酰氨基酚等。
本发明的底物定量方法中使用的氧化还原酶，可根据溶解存在于试液中的作为测定对象的底物的种类选择适当的酶。例如作为测定对象的底物是葡萄糖场合，作为氧化还原酶，可列举葡萄糖氧化酶、吡咯并喹啉酮依赖性葡萄糖脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖性葡萄糖脱氢酶等；底物为胆固醇的场合，可列举胆固醇氧化酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性胆固醇脱氢酶及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖性胆固醇脱氢酶等。在上述氧化还原酶以外，根据作为测定对象的底物的种类还可使用例如乙醇脱氢酶、乳酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、乙酰辅酶A氧化酶、尿酸酶、谷氨酸脱氢酶、果糖脱氢酶等。
本发明底物定量方法中使用的电子载体，可列举二茂衍生物、铁/亚铁氰化物离子、六氰酸钌、锇-三(联吡啶鎓)、锇-二(联吡啶鎓)咪唑啉鎓等金属络合物、p-苯醌等醌衍生物、吩嗪硫酸二甲酯等吩嗪鎓衍生物、亚甲蓝等吩噻嗪鎓衍生物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等。
可使用对所用的酶有高的电子转换速度的电子载体作为上述酶的良好组合。这中间，更好是稳定性高的电子载体二茂铁衍生物、六氰酸钌、锇-三(联吡啶鎓)和锇-二(联吡啶鎓)咪唑。
其中，氧化还原电位较高的电子载体，在施加交流电位时得到的底物和干扰性物质生成的电信号可更好地分离，因此特别适合本发明的实施。
这些电子载体也可以是与聚合物骨格结合的形式、或其本身的一部分或全体形成聚合物链的形式。且氧也可能用作电子载体。电子载体可使用其中的一种或两以上。
以下用实施例详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例限制。
实施例1溶解0.2mM二茂铁羧酸及4μm葡萄糖氧化酶作为试剂系统，得pH7的磷酸缓冲液10ml。将此磷酸缓冲液10ml放入高硬玻璃制的容器内，用作电解液，用直径3mm的铂圆盘作工作电极，用2cm的方形铂板作对电极，组成电化学池。添加溶解有抗坏血酸的葡萄糖水溶液作为试液，使浓度分别为0.5mM及20mM(约400mg/dl)。
经一定时间后在工作电极上施加振幅0.01V的交流电位，其中心电位相对于对电极为+0.1V。该工作电极上的中心电位，相对于二茂铁羧酸的氧化还原电位在-0.1V～+0.1V的范围内，并且在抗坏血酸在工作电极上的反应处于扩散控速区域的电位区域内，是比最负的电位(对Ag/AgCl为0.18V(pH7))负0.05V的电位(即对Ag/AgCl为0.13V(pH7))更正的电位。使交流电位的频率在16mHz～10kHz范围内连续变化，具体用(1.6、2.5、4.0、6.3或10)×(10-2、10-1、1、10、102或103)Hz的值。
施加交流电位后再经过一定时间，测定阻抗Z，进行复阻抗标绘。如上所述，在较低频率时电流-电位间几乎不存在相位差，所以曲线出现在实数轴附近，当逐渐增加频率时，Z的大小减小，其标绘的数据组大体形成圆弧。
然后，改变葡萄糖浓度配制与上述相同的电解液。使抗坏血酸浓度保持恒定，为0.5mM，葡萄糖浓度为2、3、4、5、10mM。用这些电解液，与上述同样进行测定和标绘。随着使用较低葡萄糖浓度的电解液，所得圆弧的直径与葡萄糖浓度有一定的相关性，逐渐变大。在用不含抗坏血酸的葡萄糖水溶液作试液时，这种情况也相同。
因此，根据预先制作的表示所得的复阻抗标绘中圆弧直径的大小和葡萄糖浓度的关系的标准曲线，可从葡萄糖浓度未知的水溶液所得的复阻抗标绘的圆弧直径，求出葡萄糖水溶液浓度，而不受抗坏血酸影响。这样，通过使用本发明的底物定量方法，可用结构简单的测定系统正确地定量试液中所含的底物，而不会因干扰性物质而产生测定误差。
实施例2本实施例不用实施例1所用的电化学池，而用按以下步骤制作的生物传感器，与实施例1同样进行测定。本实施例中制作图1及图2所示结构的生物传感器。
图1是本实施例所用生物传感器除去试剂系统后的分解立体图。在玻璃制的电绝缘性基板1上设置树脂制的电极图案掩膜，通过溅金形成工作电极2和对电极3。在金和玻璃间形成铬层作为粘合层，提高两者之间的密合性。该工作电极2和对电极3分别经导线4和5电连接至生物传感器外部的测定用接头。
工作电极2上形成含氧化还原酶及电子载体的试剂系统层之后，在基板1上按图1点划线所示的位置关系粘合有狭缝6的隔层7及附有空气孔8的盖板9，制作生物传感器。隔层7的狭缝6这部分形成试液供给通道。传感器端部的狭缝6这部分形成试液供给通道。传感器端部的狭缝6的开口的端部，作为试料进入试液供给通道的供给口。
图2是本发明生物传感器器的纵剖面图。在基板1上形成的工作电极2上，形成含氧化还原酶及电子载体的试剂系统11。如图2所示，在工作电极2和对电极3构成的电极系统上形成试剂系统11。
如使试液与作为图2所示结构的传感器的试液供给通道的狭缝6的开口端接触，试液由于毛细现象被导入试液通道，溶解于试剂系统11而进行酶反应。这里，如预先用卵磷酯等两亲性试剂进行试液供给通道的处理，试液的导入会更均匀、顺利。
这样，在设有电极系统的基板1上将由隔层7和盖板9组成的盖板部件组合，在与基板1形成的间隙中形成从试液供给口导入试液至电极系统的试液供给通道，就能使向传感器供给的含有作为测定对象的底物的试液的量保持一定，从而提高测定的精度。
设有试液供给通道的传感器中，只要试剂系统设置于露出在试液供给通道的部分能溶解于所供给的试液中即可，不限于电极系统上。例如，可设置在盖板9露出在试液供给通道中的部分、不与基板1的电极系统接触而设置于露出在试液供给通道中的部分。试剂系统可分成几个，一个设在基板上，另一个设在盖板部件的一侧。这时，分开的各层，未必要求含有所有试剂。例如，氧化还原酶和电子载体可包含在各自的层中。
也可不用盖板9，而用对电极3或工作电极2中的某一个和与其对应的导线5或4一起形成的绝缘性的第2基板。这时由于基板1、隔层7和第2基板形成试液供应通道，可使供给传感器的试液量保持一定，能提高测定的精度。
用二茂铁羧酸和葡萄糖氧化酶制得试剂系统11，将溶有0.5mM抗坏血酸的20mM葡萄糖水溶液作为试液滴入如上制作的传感器的试液供给通道的开口部即隔层7的狭缝6的开口端部，供给传感器。经过一定时间后在工作电极2上施加交流电位，其中心电位相对于对电极3为+0.1V、振幅为0.01V。交流电位的频率和实施例1所述的值相同。再经一定时间后，测定阻抗Z，进行复阻抗标绘。结果和实施例1同样，当频率较低时，曲线在实数轴附近出现，当频率缓慢升高时，Z的大小减少，而标绘的数据组大体上形成圆弧。
然后，与实施例1所述的电解液同样，配制葡萄糖浓度不同的一系列电解液，将它们分别供给传感器，与上述同样测定，进行标绘。随着使用较低浓度葡萄糖的电解液，所得圆弧直径与葡萄糖浓度有一定的相关性，慢慢变大。这种情况在使用含抗坏血酸的葡萄糖水溶液作试液时也相同。
因此，用与实施例1同样的方法，能从所得的复阻抗标绘的圆弧直径求出葡萄糖水溶液的浓度而不受抗坏血酸影响。而且在某一频率时进行上述交流测定，也可能用所得Z的大小|Z|估计葡萄糖的浓度。这样，通过使用本发明的底物定量方法，可用结构简单的测定体系正确定量试液中所含的底物，而不产生干扰性物质引起的测量误差。
实施例3本实施例采用与实施例1同样组成的电解液(葡萄糖浓度20mM、抗坏血酸浓度0.5mM)及电化学池。经一定时间后，在工作电极上施加交流电位，该电位有某一独立频率，其中心电位相对于对电极为+0.1V、振幅为0.01V。再经一定时间后测定阻抗Z。然后，在工作电极上施加一定时间的直流电位，该直流电位相对于对电极为+0.3V，测定工作电极-对电极间所流过的直流电流I’。
与实施例1一样，用一系列葡萄糖浓度不同的电解液，与上述同样进行测定和标绘。随着使用较低浓度葡萄糖的电解液，与实施例1的结果同样，所得的Z与葡萄糖浓度有一定的相关性，逐渐变大，所以用Z值可估计葡萄糖浓度。
另外施加相对于对电极为+0.3V和直流电位，并在工作电极上施加一定时间时间，通过测定工作电极-对电极间流过的直流电流的方法，考察抗坏血酸不存在时的直流电流I和葡萄糖浓度的关系(I-G)以及葡萄糖不存在时的直流电流I与抗坏血酸浓度的关系(I-A)。可知I-G、I-A分别显示大致良好的比例关系。另一方面，可知在存在一定浓度抗坏血酸时直流电流I与葡萄糖浓度的关系，以及在存在一定浓度葡萄糖时直流电流I与抗坏血酸浓度的关系，分别显示大致良好的线性关系。可得出如下结论，即如上测定所得的直流电流I’为葡萄糖和抗坏血酸各自产生的电流和总和。
如上所述，可能用交流测定得到的Z值估计葡萄糖浓度。这样求得的葡萄糖浓度如应用于I-G关系，可从上述测定所得的I’中了解葡萄糖引起的分电流，减去它就可知道I’中起因于抗坏血酸的分电流。通过将该电流应用于I-A关系，结果就可能估计抗坏血酸浓度。
如这样按照本实施例的底物定量方法，就能同时进行不受干扰性物质影响的底物测定以及干扰性物质的定量。可以预先得出直流电流对葡萄糖及抗坏血酸的标准曲线，即I-G及I-A，而不用每次测定制作一次。
在本实施例中，在施加交流电位测定Z的步骤之后，实行施加直流电位测定I’的步骤，但也可把次序反过来实行这两步。也可与实施例2同样用生物传感器进行同样的测定。
实施例4本实施例使用电极系统还包括参比电极的电化学池。使用与实施例1同样的电解液、工作电极和对电极，用银/氯化银电极(Ag/AgCl电极)作参比电极，构成电化学池。添加溶有抗坏血酸的葡萄糖水溶液作试液，使其浓度依次为0.5mM及20mM(约400mg/dl)。
经过一定时间后，在工作电极上施加交流电位，其中心电位以参比电极为基准为+0.36V、振幅0.01V。该工作电极的中心电位相对于二茂铁羧酸的氧化还原电位在-0.1V～+0.1V的范围内，并且是比抗坏血酸在工作电极上的反应处于扩散控速区域的电位范围中最负的电位(对Ag/AgCl为0.18V(pH7))负0.05V的电位(对Ag/AgCl为0.03V(pH7))更正的电位。交流电位的频率与实施例1所用的值相同。
再经一定时间后，测定阻抗Z，进行复阻抗标绘，与实施例1同样，在频率较低时，曲线出现在实数轴上。而当频率逐渐升高时，Z的大小减少，其标绘的数据组大体形成圆弧。
然后，与实施例1所述的电解液同样，配制一系列葡萄糖浓度不同的电解液，用这些电解液，同上述一样进行测定的标绘。随着使用较低浓度葡萄糖的电解液，所得圆弧直径和葡萄糖浓度有一定的相关性，逐渐变大。在使用不含抗坏血酸的葡萄糖水溶液作试液时，情况也相同。
因此，按照和实施例1同样的方法，可从所得的复阻抗标绘的圆弧直径求出葡萄糖水溶液浓度而不受抗坏血酸影响。而在某一频率时进行上述交流测定，用所得的Z的大小|Z|也可能估计葡萄糖浓度。
使用参比电极，由于工作电极的电位的变动较稳定，所得的Z值比实施例1及2的情况更加稳定。这样，采用本实施例的底物定量方法，可更稳定地进行底物测定而不受抑制性的质的影响。
与实施例2同样制作传感器，向传感器供给含抗坏血酸和葡萄糖的试液后，立即通过氯化钾和球脂构成的盐桥，使银/氯化银电极与试液供给口附近的试液接触。除了施加在工作电极上的交流电位，其中心电位相对于参比电极为0.36V、振幅为0.01V之外，与实施例2同样进行交流测定。结果可得与实施例2中上述结果几乎同样的结果，但所得的Z值更加稳定。因此按照本实施例的底物定量方法，在与传感器同时使用参比电极时，可能更稳定地测定底物而不受干扰性物质影响。
在本实施例中，通过盐桥使银/氯化银电极与试液供给口附近的试液接触，但经丝网印刷在基板上制作，银/氯化银电极，使用时也可得到同样效果。
实施例5本实施例中，首先将1mM的六氰酸钌及0.6kU/ml的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶溶解制得pH7的磷酸缓冲液10ml作为试剂系统。将此磷酸缓冲液10mL置高硬玻璃制的容器内用作电解液，用直径3mm的铂圆盘作工作电极、用2cm的方形铂板作对电极、用Ag/AgCl(饱和KCl)作参比电极，构成电化学池。
经一定时间后，在工作电极上施加交流电位，其中心电位相对于参比电极为+0.9V、振幅为0.01。该工作电位的中心电位，相对于六氰酸钌的氧化还原电位在-0.4V～+0.4V的范围内，是比相对于抗坏血酸在工作电极上的反应为扩散控速区域的电位范围中最负的电位(对Ag/AgCl为0.18V(pH7))负0.05V的电位(对Ag/AgCl为0.13V(pH7))更正的电位。交流电位的频率连续地在16mHz～10kHz内变化，具体用与实施例1所示值相同的值。
施加交流电位再经过一定时间后，测定阻抗Z，进行复阻抗标绘。如图3●中所示，在不存在葡萄糖时，标绘几乎形成直线。添加葡萄糖水溶液作为试液，使其浓度为10mM，如图3的▲所示，标绘的数据组出现在实数轴附近，当频率逐渐提高时，Z的大小减少，标绘的数据组大体形成圆弧。
然后在上述电解液中添加抗坏血酸，使浓度变0.5mM。与上述相同，进行测定及标绘，如图3的■所示，如加入10mM葡萄糖水溶液时，所得的标绘的数据组大体显示相同的半圆。
这样在施加在工作电极上的交流电位的中心电位相对于电子载体的氧化还原电位在-0.4V～+0.4V的范围内，且比相对于干扰性物质在工作电极上的反应属扩散控速区域的电位范围内的最负的电位负0.05V的电位为正的电位时，也能从复阻抗数据组标绘的圆弧直径，求得葡萄糖水溶液的浓度而不受抗坏血酸影响。并且，在施加的交流电位其中心电位为0.8V，离六氰酸钌的氧化还原电位较近时，也同样可能定量，而且，本实施例证实，六氰酸钌在本发明中能发挥非常有效的电子载体功能，而吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶在本发明中是非常有效的氧化还原酶。
实施例6本实施例中，除工作电极是铂制的旋转圆盘电极(RDE)这点之外，使用与实施例1相同的电化学池，用与实施例1相同的试液和测定条件，进行测定。
所得结果实际上与实施例1大致相同，但与实施例1的结果比较，圆弧直径减少，较高频率时可得实数轴上的标绘。这是因为使用RDE时，与使用静止电极时相比较，对于施加在工作电极上的电位的调制，电子载体引起的电流变化变大了。
然后与实施例1所述的电解液同样，配制葡萄糖浓度不同的一系列电解液，用它们分别与上述同样进行测定及标绘。随着用较低浓度葡萄糖的电解液，所得圆弧直径与葡萄糖浓度有一定的相关性，逐渐变大。这种情况在使用不含抗坏血酸的葡萄糖溶液作试液时，也是同样。用RDE代替静止电极对于电位调制引起的干扰性物质的电流变化的大小，也几乎未见影响。
因此根据其直径大小，可能测定葡萄糖浓度。特别是对于葡萄糖浓度的变化，Z值的变化比实施例1所得结果更大，Z值更加稳定。而且用某一频率进行交流测定，由所得Z值也可能估计葡萄糖浓度。使用RDE的这一效果，在使用静止电极并恒定地搅拌含试剂系统及试液的液体时也同样能得到。
用电极面积使电子载体向电极表面的侧向扩散对电化学反应的影响小的微电极，代替RDE，与本实施例同样进行测定时，也得到大致相同的结果。
微电极的大小，在将电极形状转换成圆时，在半径20μm～约50μm、电极面积1000～8000μm2的范围内，特别合适。作为电极，可使用将直径非常小的碳纤维、铂、金等封入玻璃毛细管并使电极表面露出而制得的电极，或市售的电极。并可使用利用光刻法或蚀刻法等半导体加工工艺在基板上制作的微电极。使用这样的微电极，特别适合于如实施例2用生物传感器进行测定的场合。
在本发明的底物定量方法中，如上使用RDE或微电极作为工作电极，可能稳定且高灵敏度地测定底物。
在以上实施例中，施加在工作电极上的交流电位的中心电位可根据所用电子载体的种类选择适当的值，以对电极为准为+0.1V，或以参比电极为准为+0.36V或+0.9V，但该值不受限制，只要在电子载体的氧化还原电位附近即可。根据是否用参比电极，该值发生变化，可选择较好的值。
以上实施例中，电位振幅为0.01V，此值不受限制，只要是实际上可进行交流测定的振幅即可。可使用的振幅值根据测定装置的性能决定，但较好为1～50mV。
以上实施例中交流电位的频率为16mHz～10kHz，但它们的值及范围不受限制。只要是由交流法得到的电信号随底物浓度显著变化的频率即可。
以上实施例所用的直流电位，以对电极为准为+0.3V，但此值不受限制，只要是可使电子载体和干扰性物质充分氧化(或还原)的电位即可，且可根据所用的电子载体的种类选择适当的值。并且使用参比电极的场合也可根据其种类变化，选择相应的适当的值。
施加直流电位所得的电信号，并不限于以上实施例所述的直流电流。例如也可以是工作电极上的通电电荷量。
以上实施例中所用的进行反应的一定时间，在本发明的实施中，只要是可能得出大致稳定的可能观测的大小的输出的时间即可。
电极材料在以上实施例中使用铂或金，但并不限于它们。使用其他材料的电极的例子，可举出钯和碳的电极。还可使用以铂、金、钯和碳中某一种作主要材料的混合材料的电极。以上实施例中，工作电极和对电极使用同一材料，但也可以是分别用不同材料制作的电极。
以上实施例中，使用在掩膜范围内的溅射法作为生物传感器中的电极及其图案的制作方法，但并不受此限制，例如也可用溅射法、离子电镀法、蒸镀法、化学蒸镀法中的某一种制作的金属膜，用光刻法、蚀刻法或其组合制作图案。图案的形成可用激光进行金属修剪而进行。也可用金属糊在基板上进行丝网印刷，形成电极图案。此外，也可将已形成图案的金属箔本身粘合在绝缘性基板上。电极材料是以碳为主要物质时，可在基板上进行丝网印刷，形成电极图案。
这些电极系统的形状、配置、个数、大小等并不限于以上实施例所示的情况。例如，工作电极和对电极也可分别在不同的绝缘性基板上形成，也可分别形成多个工作电极和对电极。形状也可以是梳型。而且导线和接头的形状、配置、个数、大小等也不限于上述实施例所示的情况。
对RDE的旋转速度没有限制。微电极的电极面积，只要在电子载体向电极表面的侧向扩散对电化学反应的贡献大小的范围内即可。
试液中底物和干扰性物质的浓度并不特别限制以上实施例中所述的值。试液的量也没有限制。
试剂系统中所含各试剂的量或浓度，不限于以上实施例所述的值。只要是酶反应及电化学反应可充分进行的量即可。
以上实施例中的整个试剂系统或试剂中所含试剂中的一个或多个可固定于工作电极，使酶、电子载体不溶化或非溶出化。固定化时，较好采用共价结合法、交联固定法或者利用配位结合或特异性结合的相互作用的固定化法。或者用高分子物质包埋酶、电子载体、产生拟似的固定化状态的方法，作为简易的试剂系统形成法也是有效的。所用的高分子可用疏水的，也可用亲水的，但后者更好。例如，作为亲水性高分子的例子，可列举水溶性纤维素衍生物的羧甲基化纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素等，或者聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酸、淀粉及其衍生物，马来酸酐聚合物、甲基丙烯酸酯衍生物等。
以上实施例中试剂系统中更好含有pH缓冲剂。由此，可调整反应液的pH至适合酶活性的值，在测定时高效地发挥酶的功能，而且多数干扰性物质发生的电化学反应有质子参与，因此其干扰反应成为扩散控速的电位范围可随电解液的pH而变化，通过使用pH缓冲液，可能使该电位范围固定于一定的值。因此可更稳定地进行本发明的干扰性物质的影响的排除。作为pH缓冲剂，可用例如含磷酸盐、醋酸盐，硼酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐或甘氨酸中的一种或多种的缓冲剂。也可用上述盐的氢盐的一种或多种。也可使用用于所谓“良好缓冲液”的试剂。这些pH缓冲剂含在传感器中的场合的形态，可随传感器结构而变，例如可为固体，可为溶液。
以上实施例所述的生物传感器中，通过方便地规定一定量的含测定对象即底物的溶液，可提高测定精度，较好是包括隔层作为上述生物传感器的结构要素。然而与能采取一定体积试液的器具一起使用本发明所述的生物传感器时，隔层和盖板构成的盖板部件并不一定需要。
产业上利用的可能性根据上述的本发明，可提供能利用结构简单的测定体系，正确定量试液中所含的底物，而不因干扰性物质而产生测定误差。
权利要求
1.底物的定量方法，它是用电极系统及试剂系统定量含溶解的干扰性物质及底物的试液的上述底物的方法，其特征在于，包括(a)在含有氧化还原酶及电子载体的试剂系统存在下，向包括工作电极和对电极的电极系统中供给含溶解的干扰性物质和底物的试液的工序，(b)在上述工作电极上施加交流电位，使上述电子载体发生氧化还原反应的工序，(c)用上述电极系统测定上述氧化还原反应产生的电信号的工序，以及(d)根据上述电信号定量上述底物的工序。
2.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，在上述工序(a)中将上述工作电极和上述对电极配置在同一平面上。
3.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，在上述工序(a)中，将上述工作电极和上述对电极隔着空间相对配置。
4.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，还包括在上述工作电极上施加直流电位的工序(e)，以及测定上述工序(e)中产生的电信号的工序(f)。
5.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工序(b)中，上述交流电位的中心电位，相对于上述电子载体的氧化还原电位，在-0.4V～+0.4V的范围内，并且在上述干扰性物质的在上述工作电极上的反应处于扩散控速区域的电位范围中，是比最负的电位负0.05V的电位更正的电位。
6.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工序(b)中，上述交流电位的中心电位，相对于上述电子载体的氧化还原电位，在-0.1V～+0.1V的范围内，并且在上述干扰性物质的上述工作电极上的反应处于扩散控速区域的电位范围中，是比最负的电位负0.05V的电位更正的电位。
7.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述电信号为阻抗。
8.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述电极系统还包括参比电极。
9.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工作电极是旋转圆盘电极或微电极。
10.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶或吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶；上述电子载体是二茂铁羧酸。
11.根据权利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述氧化还原酶是吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶；上述电子载体是六氰酸钌。
全文摘要
提供用结构简易的测定体系，使干扰性物质不产生测定误差，正确定量试液中所含底物的方法。在使用电极系统和试剂系统，对含有溶解的干扰性物质和底物的试液的上述底物进行定量的方法中，(a)在含有氧化还原酶和电子载体的试剂系统存在下，向包括工作电极和对电极的电极系统供给含有溶解的干扰性物质和底物的试液，(b)在上述工作电极上加上交流电位，使上述电子载体发生氧化还原反应，(c)用上述电极系统测定上述氧化还原反应产生的电信号，然后(d)根据上述电信号定量上述底物。
文档编号C12Q1/26GK1639563SQ03805518
公开日2005年7月13日 申请日期2003年3月5日 优先权日2002年3月8日
发明者桑畑进, 中南贵裕 申请人:松下电器产业株式会社