专利名称：生产氨基酸的细菌及制备l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、尤其大肠杆菌(Escherichia coli)菌种的生产氨基酸的细菌，所述细菌在rpoS基因编码区的核苷酸序列中含有选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子及选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应终止密码子抑制基因。本发明还涉及使用这些细菌制备氨基酸、尤其是L-苏氨酸的方法。
现有技术L-氨基酸、尤其是L-苏氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物饲料中。
已知L-氨基酸可通过肠杆菌科菌株、尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵而生产。由于其极其重要，一直进行改良该制备方法的尝试。方法的改良可涉及发酵技术措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或通过例如离子交换层析对产物形式的加工方法，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法。以此方法可获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或对重要的调节代谢物有缺陷的并产生L-氨基酸如L-苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA工程方法也用于肠杆菌科生产L-氨基酸菌株的菌株改良，这通过扩增各个氨基酸生物合成基因并测试对氨基酸生产的作用而进行。
rpoS基因，也称为katF基因，其编码称为σ38因子或σS因子、σ38蛋白或σ38亚基或者RpoS蛋白的一种蛋白质。在文献中也见到如下不常用的关于rpoS基因的命名abrD、dpeB、appR、sigS、otsX和snrA。σS是RNA聚合酶的一个亚基，其控制多种不同基因的表达(Loewen等，Canadian Journal of Microbiology 44(8)707-717(1998))，其中调节机制通常未知。
关于rpoS或katF基因的核苷酸序列的数据可见于Mulvey和Loewen(Nucleic Acids Research 17(23)9979-9991(1989))及Blattner等(Science 2771453-1462(1997))所述。相应的数据也可见于国立医学图书馆(National Library of Medicine)(Bethesda，MD，USA)的国立生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)，登录号为X16400和AE000358。rpoS基因的翻译起始密码子由Loewen等确定(Journal of Bacteriology 175(7)2150-2153(1993))。
另外，在大肠杆菌菌株中已知许多rpoS等位基因，例如在W3110类型的菌株中(Ivanova等，Nucleic Acids Research 20(20)5479-5480(1992)及Jishage和Ishihama，Journal of Bacteriology 179(3)959-963(1997))。
WO 01/05939中示出通过在L-谷氨酸的生产菌株的rpoS基因中掺入一个缺失而完全关闭σ38因子之后，谷氨酸生产被改进。
Nagano等(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64(9)2012-2017(2000))报道了大肠杆菌W3110菌株及生产L-赖氨酸的突变体W196均含有一个rpoS等位基因，所述等位基因在相应于σ38蛋白的氨基酸序列第33位的位点含有一个琥珀终止密码子(TAG)。菌株W196在编码L-丝氨酸tRNA的serU基因中还含有一个突变，其被称为supD。
发明描述当在下文中提及氨基酸或L-氨基酸时，包括除了L-赖氨酸之外的所有蛋白原性(proteinogenic)氨基酸。特别是指L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸和L-色氨酸，其中优选L-苏氨酸。
“蛋白原性氨基酸”是指组成蛋白质的那些氨基酸。这些氨基酸包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸及L-硒代半胱氨酸。
本发明提供了来自肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的尤其是生产L-苏氨酸的细菌，其1)在rpoS基因的编码区的核苷酸序列中含有选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子，及2)含有选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应终止密码子的抑制基因。
本发明提供的细菌可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、任选地淀粉、任选地纤维素或者从甘油和乙醇中生产氨基酸。所述细菌是肠杆菌科的代表，其选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属中特别提及的是大肠杆菌，在沙雷氏菌属中特别提及的是粘质沙雷氏菌。
本发明提供的生产L-氨基酸的细菌除了可以生产所需的L-氨基酸之外还可以任选地生产L-赖氨酸作为二级产物。本发明的细菌生产的L-赖氨酸的量与所需的L-氨基酸的量相比至多为0到40％或者0到20％，优选至多0到10％，特别优选至多0到5％。这个百分比数据是重量百分比。
来自肠杆菌科生产L-苏氨酸的菌株优选具有选自如下一组的一或多个遗传或表型特征α-氨基-β-羟戊酸抗性，硫代赖氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺体素抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物如缬氨酸氧肟酸(valine hydroxamate)抗性，嘌呤类似物如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任选地部分及可补偿地需要L-异亮氨酸，需要间二氨基庚二酸，针对含苏氨酸二肽的营养缺陷，L-苏氨酸抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，任选地利用蔗糖的能力，苏氨酸操纵子的增强，高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的增强，优选反馈抗性形式，高丝氨酸激酶的增强，苏氨酸合酶的增强，天冬氨酸激酶的增强，任选地为反馈抗性形式，天冬氨酸半醛脱氢酶的增强，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，任选地为反馈抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强，转氢酶的增强，RhtB基因产物的增强，RhtC基因产物的增强，YfiK基因产物的增强，丙酮酸羧化酶的增强及乙酸形成的弱化。
琥珀型终止密码子已知是DNA分子编码链上具有碱基序列TAG的一种终止密码子，所述碱基序列TAG相应于由这个DNA分子解读的mRNA上的UAG。
赭石型终止密码子已知是DNA分子编码链上具有碱基序列TAA的一种终止密码子，所述碱基序列TAA相应于由这个DNA分子解读的mRNA上的UAA。
乳白型终止密码子已知是DNA分子编码链上具有碱基序列TGA的一种终止密码子，所述碱基序列TGA相应于由这个DNA分子解读的mRNA上的UGA。
终止密码子也称为无义突变(Edward A.BirgeBacterial andBacteriophage Genetics(Third Edition)，Springer Verlag，德国柏林1994)。
现有技术领域可获得rpoS基因的核苷酸序列。相应于登录号No.AE000358的rpoS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。相关RpoS基因产物或蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
SEQ ID NO3示出了rpoS等位基因的核苷酸序列，所述等位基因在分别相应于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的RpoS基因产物或蛋白质的氨基酸序列的第33位的核苷酸序列位置含有一个琥珀型终止密码子。
σ38因子的浓度可以通过定量“Western印迹”方法确定，所述方法如Jishage和Ishima(Journal of Bacteriology 177(23)6832-6835(1995))、Jishage等(Journal of Bacteriology 178(18)5447-5451(1996))及Jishage和Ishima(Journal of Bacteriology 179(3)959-963(1997))所述。
抑制作用一般理解为这样的作用，即“第一个”基因中的突变作用由“第二个”基因中的突变补偿或抑制。突变的第二个基因或第二个突变一般称为抑制因子或抑制基因。
抑制基因的一特殊情况涉及编码异常tRNA分子的tRNA基因的等位基因，其可识别终止密码子以便在翻译期间发生氨基酸掺入而不是链终止。关于抑制作用的充分阐述可见于遗传学教科书，例如RolfKnippers，《Molekulare Genetik》(第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)，或者Ernst-L.Winnacker，《Gene undKlone，Eine Einführung in die Gentechnologie》(Dritter，amendedreprint，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)，或者F.C.Neidhard(Ed.)，《Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology》(2ndEdition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)。
表1、2和3列出的抑制基因是现有技术已知的tRNA基因或等位基因或tRNA抑制基因，其可抑制琥珀、赭石或乳白型终止密码子并因此称为琥珀抑制基因、赭石抑制基因或乳白抑制基因。具体基因或等位基因及抑制基因的名称取自参考文献。
表1琥珀抑制基因列表
表1的参考文献1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Martin et al，RNA 2(9)919-927，19963)Normanly et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，83(17)6548-6552，19864)Accession number K011975)Yarus et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，77(9)5092-5096，19906)McClain et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，87(23)9260-9264，19907)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19848)Raftery et al，Journal of Molecular Biology 190(3)513-517，19869)Komatsoulis und Abelson，Biochemistry 32(29)743 5-7444，199310)Martin et al，Nucleic Acids Research 23(5)779-784，199511)Normanly et al，Journal of Molecular Biology 213(4)719-726，199012)McClain und Foss，Journal of Molecular Biology，202(4)697-709，1988
表2赭石抑制基因列表
表2的参考文献1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Raftery und Yarus，EMBO Journal 6(5)1499-1506，19873)Accession number K011974)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19845)Raftery et al，Journal of Molecular Biology 190(3)513-517，1986
表3乳白抑制基因列表
表3的参考文献1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Schn et al，Nucleic Acids Research 17(18)7159-7165，19893)Weygand-Durasevic et al，Journal of Molecular Biology 240(2)111-118，19944)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19845)McClain et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，87(23)9260-9264，1990在本发明的第一个方面中，发现当大肠杆菌物种的生产氨基酸尤其是生产L-苏氨酸的细菌中掺入选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA时，其生产氨基酸的能力得以进一步改良，所述细菌在rpoS基因的编码区内，尤其在分别相应于SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列第2到314位的区域内含有选自琥珀、赭石和乳白的一个终止密码子。
本发明的测定结果显示RpoS蛋白或σ38因子的活性或浓度与野生型蛋白质或者初始微生物中蛋白质的活性或浓度相比通常降低＞0到75％，例如1到75％，到＞0到50％，例如0.5到50％，到＞0到25％，例如0.25到25％，到＞0到10％，例如0.1到10％，或者到＞0到5％，例如0.05到5％。所述抑制基因的存在防止RpoS蛋白或σ38因子的活性一直降低至0。
因此，本发明提供了一种降低肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌中RpoS蛋白或σ38因子的胞内活性或浓度的方法，其中在这些细菌中1)在rpoS基因的编码区内尤其在相应于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的区域内掺入选自琥珀、赭石和的至少一个终止密码子，及2)在这些细菌中掺入相应的抑制基因tRNA基因或等位基因，其编码选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA。
本发明还提供了一种制备肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌的方法，其中在这些细菌中1)将选自琥珀、赭石和乳白的终止密码子掺入rpoS基因的编码区中，尤其是掺入相应于SEQ IDNO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的区域中，及2)在这些细菌中掺入一抑制基因tRNA基因或等位基因，其编码选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA。
最后，本发明提供了肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌，其在rpoS基因的编码区内尤其在相应于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的区域内含有选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子，并含有相应的抑制基因tRNA基因或等位基因，其编码选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相关的抑制基因tRNA。
就rpoS基因的编码区而言，已证实如下片段对掺入选自琥珀、赭石和乳白、优选琥珀的一个终止密码子是特别有益的●相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2和95位之间，例如第33位的编码区的片段，●相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第99和168位之间，例如第148位的编码区的片段，●相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第190和245位之间的编码区的片段，●相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第266和281位之间，例如第270位的编码区的片段，及●相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第287和314位之间，例如第304位的编码区的片段。
在rpoS基因的编码区具有一个琥珀型终止密码子的情况中，优选使用选自表1所示的琥珀抑制基因。
在rpoS基因的编码区具有一个赭石型的终止密码子的情况中，优选使用选自表2所示的赭石抑制基因。
在rpoS基因的编码区具有一个乳白类型的终止密码子的情况中，优选使用选自表3所示的乳白抑制基因。
特别优选的大肠杆菌物种的那些生产氨基酸的细菌，其在相应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS基因产物的氨基酸序列中第33位的核苷酸序列的位置含有一个琥珀型终止密码子，并优选含有选自表1的一个琥珀抑制基因，特别是抑制基因supE或抑制基因supD，并生产如上述与所需的L-氨基酸量相应量的L-赖氨酸。
根据所使用的抑制基因，所述细菌形成一种RpoS基因产物或者σ38因子，其在SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第33位含有的不是L-谷氨酰胺，而是选自L-丝氨酸，L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-赖氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸，L-脯氨酸，L-组氨酸，L-苏氨酸和L-缬氨酸中的一种氨基酸。因此，例如当使用抑制基因supD时，掺入L-丝氨酸而不是掺入L-谷氨酰胺。当使用在RpoS基因产物或σ38因子的第33位掺入L-谷氨酰胺氨基酸的抑制基因如supE时，所述氨基酸序列不变。
特别优选的是大肠杆菌物种的生产L-苏氨酸的细菌，其含有SEQID NO3所示rpoS等位基因及SEQ ID NO4所示抑制基因supE。
本发明还提供了相应于与本发明第一方面的一种制备氨基酸或含有氨基酸的饲料添加剂的方法，其中进行如下步骤a)在合适的培养基中发酵肠杆菌科的细菌，所述细菌含有1)在rpoS基因的编码区内尤其在相应于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的区域内含有选自琥珀、赭石和乳白优选琥珀的至少一个终止密码子，及2)含有选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应抑制基因tRNA基因，b)富集发酵肉汤中的氨基酸，c)从发酵肉汤中分离所述氨基酸或者含有氨基酸的饲料添加剂，任选d)分离发酵肉汤的成分和/或生物量(≥0到100％)。
一种制备氨基酸或含有氨基酸的饲料添加剂的方法，优选其中肠杆菌科在合适的培养基中发酵，所述肠杆菌科在相应于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列第33位的rpoS基因的编码区中含有一个琥珀型终止密码子。
本发明的饲料添加剂可以在液体及也可以在固体形式中进一步加工。
使用致突变物质例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍通过传统的诱变方法或者通过紫外光在相关宿主中可以直接产生将一个终止密码子导入rpoS基因读框的突变。
另外，使用分离的rpoS DNA的体外方法例如用羟胺处理可以用于诱变(J.H.MillerA Short Course in Bacterial Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)。最后，可以利用使用诱变寡核苷酸的定点诱变方法(T.A.BrownGentechnologie fürEinsteiger，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993)或者聚合酶链反应(PCR)，如Newton和Graham所述(PCR，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1994)。产生的突变可以通过DNA测序加以确定并测试，例如使用Sanger等所述方法(Proceedings of theNational Academy of Science USA 74(12)5463-5467(1977))进行。
使用通过基因或等位基因置换而进行的重组方法可以在所需的菌株中掺入合适的突变。通常使用的方法是使用条件复制(conditionalreplicating)pSC101衍生物pMAK705的基因置换方法，如Hamilton等所述(Journal of Bacteriology 171(9)4617-4622(1989))。也可以使用现有技术领域中所述的其它方法，例如，Martinez-Morales等的方法(Journal of Bacteriology 181(22)7143-7148(1999))或者Boyd等的方法(Journal of Bacteriology 182(3)842-847(2000))。
通过缀合或转导将突变移至所需的菌株中也是可能的。
最后，可以使用现有技术领域已知的在读框中含有一个终止密码子的rpoS基因的等位基因，及使用上述方法将这些基因导入所需的菌株中。
以上述方式获得的菌株优选是突变体、转化体、重组体、转导体或转接合子。
为在tRNA基因中产生抑制基因突变，可以使用针对rpoS基因所述基本相同的方法。也可以使用寡核苷酸工程化方法，如Khorana所述方法(Science 203(4381)614-625(1979))。另外，可特别使用现有技术领域中使用的tRNA抑制基因。
查询、鉴定并确定tRNA抑制基因的效力的方法见现有技术领域中所述，例如Miller和Albertini(Journal of Molecular Biology 164(1)59-71(1983))，McClain和Foss(Journal of Molecular Biology 202(4)697-709(1988))，Normanly等(Journal of Molecular Biology 213(4)719-726(1990))，Kleina等(Journal of Molecular Biology 213705-717(1990))，Lesley等(Promega Notes Magazine 46，p.02.(1994))及Martin等(Nucleic Acids Research 23(5)779-784(1995))所述。
本发明的第二个方面涉及SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的变体。本发明鉴别了RpoS蛋白的这种变体的编码区。该编码区如SEQ IDNO5所示。
因此，本发明提供了肠杆菌科尤其是生产氨基酸的那些菌株，其含有或形成SEQ ID NO6所示的RpoS蛋白。还已知形成的蛋白质的N末端甲硫氨酸可以通过宿主中存在的酶断裂。
另外，本发明提供了相应于第二方面的一种制备氨基酸或含有氨基酸的饲料添加剂的方法，其中进行如下步骤a)发酵肠杆菌科，其含有或形成具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的RpoS蛋白质，b)富集发酵肉汤中的氨基酸，c)从发酵肉汤中分离氨基酸或含有氨基酸的饲料添加剂，任选d)分离发酵肉汤的成分和/或生物量(≥0到100％)。
另外，为使用肠杆菌科的细菌生产L-苏氨酸，除了在rpoS基因的编码区中掺入一个终止密码子及终止密码子的一个相应的抑制基因之外，或者除了表达SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的变体之外，增强已知的苏氨酸生物合成途径种的一或多种酶或者回补代谢(anaplerotic metabolism)的酶或者产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代谢的酶是有益的。
文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的提高，例如通过提高基因的拷贝数，使用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因，及任选地组合使用这些方法。
优选使用内源基因。“内源基因”或“内源核苷酸序列”是指在一个物种群体中存在的基因或核苷酸序列。
通过增强方法，尤其是过表达，所述相应蛋白的活性或浓度相对于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
因此，例如选自如下一组的一或多个基因可以增强，尤其是过表达●编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4，278，765)，●编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)，●编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，●编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene 31279-283(1984))，●编码转氢酶的pntA和pntB基因(European Journal of Biochemistry158647-653(1986))，●赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，●编码苹果酸∶醌氧化还原酶的mqo基因(DE 100 348 33.5)，●赋予苏氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，●来自谷氨酸棒杆菌的编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因(DE 100 26494.8)，●编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，●编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因(Molecular and GeneralGenetics 212199-202(1988))，●编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(Journal of Bacteriology 1765847-5851(1994))，
●编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(Biochemical Journal 257529-534(1989))，●来自ptsHIcrr操纵子、编码磷酸转移酶系统(PTS)中酶I的ptsI基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●来自ptsHIcrr操纵子、编码磷酸转移酶系统(PTS)中磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsH基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●来自ptsHIcrr操纵子、编码磷酸转移酶系统(PTS)中葡萄糖特异性IIA成分的crr基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●编码磷酸转移酶系统(PTS)中葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因(Journal of Biological Chemistry 26116398-16403(1986))，●编码亮氨酸调节子的调节蛋白的lrp基因(Journal of BiologicalChemistry 26610768-10774(1991))，●编码全局调节蛋白的csrA基因(Journal of Bacteriology 1754744-4755(1993))，●编码fad调节子的调节蛋白的fadR基因(Nucleic Acids Research 167995-8009(1988))，●编码重要中间代谢(central intermediary metabolism)的调节蛋白的iclR基因(Journal of Bacteriology 1722642-2649(1990))，●编码10Kd陪伴分子的mopB基因(Journal of Biological Chemistry26112414-12419(1986))，其也称为groES，●来自ahpCF操纵子、编码烷基氢过氧化物还原酶中小亚基的ahpC基因(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 927617-7621(1995))，●来自ahpCF操纵子、编码烷基氢过氧化物还原酶中大亚基的ahpF基因(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 927617-7621(1995))，
●编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(Journal of Bacteriology 1703150-3157(1988))，●编码cys调节子的调节蛋白的cysB基因(Journal of BiologicalChemistry 2625999-6005(1987))，●来自cysJIH操纵子、编码NADPH亚硫酸盐还原酶中黄素蛋白的cysJ基因(Journal of Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal of Biological Chemistry 26415726-15737(1989))，●来自cysJIH操纵子、编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因(Journalof Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal ofBiological Chemistry 26415726-15737(1989))，及●来自cysJIH操纵子、编码NADPH亚硫酸盐还原酶中血蛋白的cysI基因(Journal of Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal of_Biological Chemistry 26415726-15737(1989))。
另外，为使用肠杆菌科的细菌生产L-苏氨酸，除了在rpoS基因的编码区中掺入一个终止密码子及所述终止密码子的相应的抑制基因之外，或者除了表达SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的变体之外，弱化尤其是切断或降低选自如下一组的一或多个基因的表达是有益的●编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Ravnikar und Somerville；Journal ofBacteriology 1694716-4721(1987))，●编码苹果酸脱氢酶的mdh基因(E.C.1.1.1.37)(Vogel et al.；Archivesin Microbiology 14936-42(1987))，●开放读框(orf)yjfA的基因产物(Accession Number AAC77 180 for theNational Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA))，●开放读框(orf)ytfP的基因产物(Accession Number AAC77179 for theNational Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA))，
●编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的pckA基因(Medina et al.；Journal ofBacteriology 1727151-7156(1990))，●编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(Grabau und Cronan；Nucleic AcidsResearch 14(13)5449-5460(1986))，●编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因(Matsuoko und McFadden；Journalof Bacteriology 1704528-4536(1988))，●编码磷酸转移酶系统中DgsA调节蛋白的dgsA基因(Hosono et al.；Bioscience，Biotechnology and Biochemistry 59256-261(1995))，其也称为mlc基因，及●编码果糖阻抑蛋白的fruR基因(Jahreis et al.；Molecular and GeneralGenetics 226332-336(1991))，其也称为cra基因。
文中术语“弱化”是指降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度，通过例如使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或失活相应酶、蛋白质或基因，及任选地组合使用这些方法。
通过弱化措施，包括降低相应蛋白质的表达、活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质活性或浓度的0到75％，0到50％，0到25％，0到10％或0到5％。
还已经证明在上述tdh，mdh，pckA，poxB，aceA，dgsA和fruR基因及开放读框(ORF)yjfA和ytfP及ugpB基因(编码sn-甘氨酸-3-磷酸运输系统中周质结合蛋白(periplastic linkage protein)的基因)，aspA(天冬氨酸铵裂合酶基因(＝天冬氨酸酶基因))，aceB(编码苹果酸合酶A的基因)及aceK(编码异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因)的情况中，弱化可以通过1)在这些基因的编码区中掺入选自琥珀、赭石和乳白的一个终止密码子，及2)同时使用选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应终止密码子的抑制基因而实现。已经证实使用琥珀型终止密码子及琥珀抑制基因supE是特别有益的。所述方法可以适于试图产生弱化或消除的任何基因。
根据本发明产生的微生物可通过分批法(batch process)、补料分批法(fed batch process)或重复补料分批法(repeated fed batchprocess)培养。已知培养法见于由Chmiel(Bioprozesstechnik 1，Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))所著教材或由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于不同微生物培养基的阐述见于美国细菌学会(American Society for Bacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(美国华盛顿D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉及任选纤维素、油和脂肪如豆油、葵花油、花生油和椰子油、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇如甘油和乙醇及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含有机氮的化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素或无机化物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，必须使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
为控制培养物的pH值，可以适当方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸。为控制泡沫的产生，可使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇。为保持质粒的稳定性，适当的选择性作用物质例如抗生素可加入培养基中。为保持有氧条件，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中。培养温度通常在25℃到45℃，优选30℃到40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10到160小时范围内达到。
氨基酸的分析可如Spackman等所述通过使用阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化作用(Analytical Chemistry 301190-1206(1958)，1190)进行，或者如Lindroth等所述通过使用反相HPLC(Analytical Chemistry(1979)511167-1174)进行。
以下微生物根据布达佩斯条约作为纯培养物于2002年9月9日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)●大肠杆菌菌株DM1690，保藏号DSM 15189。
菌株DSM 15189在相应于RpoS蛋白的氨基酸序列的第33位的位置含有一个琥珀型终止密码子及一个琥珀抑制基因并产生苏氨酸。
本发明的方法用于发酵制备L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸，尤其是L-苏氨酸。
本发明通过如下实施例得以进一步详细阐述。
大肠杆菌的基本培养基(M9)和通用培养基(LB)如J.H.Miller所述(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring HarborLaboratory Press)。从大肠杆菌中分离质粒DNA及关于限制及Klenow及碱性磷酸酶处理的所有技术如Sambrook等所述(Molecular Cloning.A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)进行。大肠杆菌的转化，除非另加说明，均如Chung等所述(Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 862172-2175(1989))进行。P1转导如Lengeler等(Journal of Bacteriology12426-38(1975))所述进行。
实施例1将scr基因座转导入大肠杆菌K12菌株MG1655中天然发生的质粒pUR400中的scr调节子(Schmid et al.，MolecularMicrobiology 21-8(1988))促进利用蔗糖作为碳源的能力。借助于在转座子Tn1721(Ubben and Schmitt，Gene 41154-152(1986))的两个相反序列重复之间含有scr调节子的质粒pKJL710(Ulmke et al.，Journal ofBacteriology 1811920-1923(1999))，随后通过转化、转座、缀合及转导，所述scr调节子可以移至大肠杆菌K12的染色体中。一个称为LJ210的菌株含有scr调节子，所述调节子根据Berlyn-Karte所述整合在染色体第6位小片中。将噬菌体P1在这个菌株中增殖并将大肠杆菌K12菌株MG1655(Guyer et al.，Cold Spring Harbor Symp.，Quant.Biology 45135-140(1981))用所述分离的噬菌体溶菌产物感染。通过铺板于含有蔗糖(2g/l)的基本培养基上，获得MG1655转导体，其可使用蔗糖作为碳源。将一选择的克隆命名为MG1655scr。
实施例2菌株MG1655scr的体内诱变从MG1655scr开始，在加入2g/l蔗糖和4g/l DL-β-羟基正缬氨酸(Sigma，Deisenhofen，德国)的基本琼脂中在37℃孵育后，分离自发突变体，其对苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性。将一选择的突变体命名为MG1655scrAHVR1。
实施例3通过位点特异crAHVR1中的moS基因中掺入一个终止密码子突变3.1来自MG1655的rpoS基因的克隆大肠杆菌菌株MG1655用作染色体DNA的供体。将含有在中间区域突变的rpoS基因的区域的DNA片段使用聚合酶链反应(PCR)及合成的寡核苷酸进行扩增。从大肠杆菌K12的已知rpoS基因的序列(登录号AE000358，SEQ ID No1)开始，选择以下寡核苷酸引物(MWG Biotech，Ebersberg，德国)进行PCRrpoS9(SEQ ID No.7)5’CAGTTATAGCGGCAGTACC 3’rpoS4(SEQ ID No.8)
5’GGACAGTGTTAACGACCATTCTC3’根据厂商数据使用Qiagen Genomic-tips 100/G(Qiagen，Hilden，德国)分离大肠杆菌K12染色体DNA。在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress)，使用vent聚合酶(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)可以分离长度为大约2kbp的DNA片段。
扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶(0.8％)中使用凝胶电泳鉴别，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化。将纯化的PCR产物根据厂商数据使用载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Holland)连接，并在大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Groningen，Holland)中转化。在加入50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择含有所述质粒的细胞。在分离质粒DNA之后，使用限制裂解及在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离测试所述载体。扩增的DNA片段通过序列分析测试。PCR产物中的序列与SEQ ID NO9所示序列一致。将获得的质粒命名为pCRBluntrpoS9-4。
3.2通过位点特异性诱变用琥珀终止密码子置换谷氨酰胺密码子定点诱变使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，USA)进行。选择以下寡核苷酸引物进行线性扩增rpoSamber1(SEQ ID No.10)5′GGCCTTAGTAGAA(TAG)GAACCCAGTGATAACG 3′rpoSamber2(SEQ ID No.11)5′CGTTATCACTGGGTTC(CTA)TTCTACTAAGGCC 3′这些引物是由MWG Biotech公司合成的。用于置换所述氨基酸序列第33位谷氨酰胺的琥珀终止密码子在以上所示核苷酸序列中用括号标示。使用实施例3.1中所述质粒pCRBluntrpoS9-4及与所述质粒中的一个链互补的所述两个引物之一，通过PfuTurbo DNA聚合酶进行线性扩增。在所述引物的延伸期间产生断裂环形链的突变质粒。将所述线性扩增的产物用DpnI处理。这个内切核酸酶特异性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。将新合成的、断裂的突变载体DNA在大肠杆菌菌株XL1 Blue(Bullock，Fernandez and Short，BioTechniques5(4)376-379(1987))中转化。在转化之后，所述XL1 Blue细胞修复突变质粒中的断裂。在具有50mg/l卡那霉素的LB培养基上选择转化体。获得的质粒通过限制切割及在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离DNA进行测试。突变的DNA片段的DNA序列通过序列分析测试。在rpoS基因的区域中，该序列与SEQ ID NO3所示序列一致。将获得的质粒命名为pCRBluntrpoSamber。
3.3置换载体pMAK705rpoSamber的构建将实施例3.2中所述的质粒pCRBluntrpoSamber用限制酶BamHI和XbaI(Gibco Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)切割。在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离含有所述突变的长度为大约2.1kbp的rpoS片段。将Hamilton等所述质粒pMAK705(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))用限制酶BamHI和XbaI切割并与分离的rpoS片段连接(T4-DNA-Ligase，Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 874645-4649(1990))用该连接混合物(ligation batch)转化(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Habor，New York，1989)。通过将该批转化物铺板于补加了20mg/l氯霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Habor，New York，1989)上选择含有所述质粒的细胞。
使用Qiagen公司的QIAquick Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用酶BamHI、EcoRI、EcoRV、StuI和XbaI限制切割及随后通过琼脂糖凝胶电泳进行测试。将该质粒命名为pMAK705rpoSamber。该质粒图示于
图1。
3.4大肠杆菌菌株MG1655scrAHVR1的rpoS基因的位点特异性诱变为进行rpoS基因的位点特异性诱变，将实施例2所述菌株MG1655scrAHVR1用质粒pMAK705rpoSamber转化。使用Hamilton等所述选择方法(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))进行基因置换。使用Roche Diagnostics公司的LightCycler(Mannheim，Germany)验证染色体中已经发生rpoSamber等位基因突变。所述LightCycler是由热循环仪和荧光计组成的一种组合仪器。
在第一阶段，将含有所述突变位点的长度为大约0.3kbp的DNA片段使用如下寡核苷酸引物通过PCR扩增(Innis et al.，PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)rpoSLC1(SEQ ID No.12)5′CGGAACCAGGCTTTTGCTTG 3′rpoSLC2(SEQ ID No.13)5′GCGCGACGCGCAAAATAAAC 3′在第二阶段，使用荧光共振能量转移(Fluorescence ResonanceEnergy Transfer)方法(FRET)，通过解链曲线分析(melting curveanalysis)(Lay et al.；Clinical Chemistry 432262-2267(1997))证实所述突变的存在，所述分析使用不同长度的及用不同的荧光染料(LightCycler(LC)-Red640及荧光素)标记的两个额外的寡核苷酸并使其在所述突变位点的区域中杂交。
rpoSamberC(SEQ ID No.14)5′LC-Red640-CTTAGTAGAACAGGAACCCAGTG-(P)3′rpoSamberA(SEQ ID No.15)5′GATGAGAACGGAGTTGAGGTTTTTGACGAAAAGG-荧光素3′PCR的引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，进行杂交的寡核苷酸由TIB MOLBIOL(Berlin，德国)合成。
在这种方式中鉴别了一个克隆，其在rpoS PCR产物的DNA序列(SEQ ID No9)第952位含有一个胸苷而不是胞嘧啶。碱基三联体胸腺嘧啶—腺嘌呤—鸟嘌呤存在于rpoS等位基因编码序列(SEQ ID No3)的第97-99位，并编码导致翻译终止的一个琥珀终止密码子。将这个克隆命名为MG1655scrAHVR1rpoS。
实施例4菌株MG1655scrAHVR1rpoS中琥珀抑制基因突变的体内选择4.1在Cat基因中具有琥珀终止密码子的载体的构建为选择一个抑制基因突变，将一个琥珀终止密码子掺入编码氯霉素乙酰转移酶并赋予氯霉素抗性的的cat基因中。
为此，将Cat基因模块(block)在HindIII线性化的载体pTrc99A中连接(均得自Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)。将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 874645-4649(1990))用该连接混合物转化(Hanahan，In.DNACloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Habor，New York，1989)。通过将该批转化体铺板于补加了50mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Habor，New York，1989)上选择含有所述质粒的细胞。使用Qiagen公司的QIAquick Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳进行测试。将该质粒命名为pTrc99Acat。
为在cat基因的编码区中掺入一个琥珀终止密码子，从所述cat基因的序列开始，由德国Ebersberg的MWG Biotech公司合成含有限制酶AccIII和MscI的切割位点的引物。所述限制酶的识别位点在如下所示的核苷酸序列中用下划线标示。在catAccIII引物中，在AccIII切割位点之后，编码cat蛋白质中第75和77位的甲硫氨酸的两个ATG密码子改变为TAG密码子。琥珀密码子在如下核苷酸序列中在括号内标示。
catAccIII5’GCTCATCCGGAATTCCGT(TAG)GCA(TAG)AAAG 3’
(SEQ ID No16)catMscI5’GTCCATATTGGCCACGTTTAAATC 3’(SEQ ID No17)来自载体pTrc99Acat的质粒DNA用于PCR。在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press)，使用Pfu DNA聚合酶(Promega Corporation，Madison，USA)及特异性引物扩增一个长度为大约300bp的DNA片段。将该PCR产物用限制酶AccIII和MscI切割。载体pTrc99Acat也用酶AccIII和MscI消化，在凝胶中分离并使用QIAquick凝胶提取试剂盒分离一个长度为4.7kbp的片段。将这两个片段用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)连接。将大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF‘(Stratagene，La Jolla，USA)用该连接混合物转化，并在加入了50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。在分离质粒DNA之后，通过使用酶EcoRI、PvuII、SspI和StyI控制切割可以证实成功克隆。将该质粒命名为pTrc99Acatamber。该质粒图示于图2。
4.2具有琥珀抑制基因克隆的选择将实施例3中所述的菌株MG1655scrAHVR1rpoS用载体pTrc99Acat和pTrc99Acatamber转化。在补加了20或50μg/ml氯霉素的LB琼脂上进行选择。用牙签将已经用载体pTrc99Acatamber转化的氯霉素抗性克隆移至已经加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂中。从氯霉素和氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。所述载体pTrc99Acatamber通过限制切割鉴别。
一氯霉素抗性转化体MG1655scrAHVRrpoS/pTrc99Acatamber通过质粒pTrc99Acatamber在LB培养基中过度接种(over-inoculating)几次而处理，并将其命名为DM1690。
4.3DM1690中琥珀抑制基因突变的鉴别4.3.1测试supD突变编码丝氨酸tRNA-2的serU基因中存在导致琥珀密码子抑制的一已知突变。该等位基因称为supD，所述tRNA识别琥珀密码子并掺入丝氨酸。在supD60基因的序列中(登录号M10746)，野生型serU基因中的胞嘧啶—腺嘌呤—腺嘌呤反密码子通过碱基置换修饰为胞嘧啶—胸腺嘧啶—腺嘌呤，由此识别尿嘧啶—腺嘌呤—鸟嘌呤密码子。
染色体serU基因中的一可能突变可使用Roche Diagnostics公司的LightCycler(Mannheim，德国)检测。所述LightCycler是由热循环仪和荧光计组成的一种组合仪器。
在第一阶段，将含有所述突变位点的长度为大约0.3kbp的一DNA片段使用如下寡核苷酸引物通过PCR扩增(Innis et al.，PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，1990，AcademicPress)serULC1(SEQ ID No.18)5′CTTGTACTTTCCAGGGCCAC 3′serULC2(SEQ ID No.19)5′TTTAGGAAAAGCAAGGCGGG 3′在第二阶段，使用荧光共振能量转移方法(FRET)，使用解链曲线分析(Lay et al.；Clinical Chemistry 432262-2267(1997))证实所述突变的存在，所述分析使用不同长度的及用不同的荧光染料(LightCycler(LC)-Red640及荧光素)标记的两个额外的寡核苷酸并使其在所述突变位点的区域中杂交。
serUC(SEQ ID No.20)5’LC-Red640-TCCGGTTTTCGAGACCGGTC-(P)3’serUA(SEQ ID No.21)5’GAGGGGGATTTGAACCCCCGGTAGAGTTGCCCCTA-荧光素3’PCR的引物由MWG Biotech公司(Ebersberg，德国)合成，进行所示杂交的寡核苷酸由TIB MOLBIOL公司(Berlin，德国)合成。
可以示出野生型serU基因存在于DM1690中及因此无supD突变。
4.3.2DM1690中supE等位基因的序列分析编码谷氨酰胺tRNA-2的glnV基因中存在导致琥珀密码子抑制的另一个已知突变。该等位基因称为supE，所述tRNA识别琥珀密码子并掺入谷氨酰胺。在glnV基因的序列中(登录号AE000170)，野生型glnV基因中胞嘧啶—胸腺嘧啶—鸟嘌呤反密码子通过碱基置换修饰为胞嘧啶—胸腺嘧啶—腺嘌呤，其识别尿嘧啶—腺嘌呤—鸟嘌呤密码子。
从大肠杆菌K12(登录号AE000170)的glnV区域的已知序列开始，选择如下寡核苷酸引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)进行PCRglnX1(SEQ ID No.22)5‘CTGGCGTGTTGAAACGTCAG 3‘glnX2(SEQ ID No.23)5‘CACGCTGTTCGCAACCTAACC 3‘用于进行PCR的DM1690的染色体DNA根据厂商数据使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(Qiagen，Hilden，Germany)分离。一长度为大约1kpb的DNA片段可以在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress)，使用特异性引物及vent聚合酶(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)分离。将该PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化并通过Qiagen Sequencing Services(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)测序。获得的序列与glnV基因的区域中SEQ ID NO4所示序列一致。
所述菌株DM1690具有supE等位基因并通过掺入谷氨酰胺而抑制琥珀密码子。
实施例5使用菌株MG1655scrAHVR1，MG1655scrAHVR1rpoS和DM1690制备L-苏氨酸将菌株MG1655scrAHVR1，MG1655scrAHVR1rpoS和DM1690在具有如下成分的基本培养基上增殖3.5g/l Na2HPO4*2H2O，1.5g/lKH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l蔗糖，20g/l琼脂。将所述培养物在37℃孵育5天。在于100ml Erlenmeyer烧瓶中10ml的分批培养物中监测L-苏氨酸的形成。为此，接种具有如下成分的10ml预培养基(preculture)2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，并将该混合物在Kühner AG公司的ESR培养箱(Birsfelden，Switzerland)中在37℃及180rpm孵育16小时。将每种情况中该预培养物的250μl移至10ml的生产培养基(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/lMgSO4*7H2O，0.03g/l FeSO4*7H2O，0.018g/lMnSO4*1H2O，30g/lCaCO3，20g/l蔗糖)中，在37℃孵育48小时。孵育后，使用Dr.Lange公司(德国柏林)的LP2W光度计确定所述培养悬浮液在660nm测定波长的光密度(OD)。
然后使用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后反应而确定无菌过滤上清中形成的L-苏氨酸的浓度。
表4提供了试验结果。
表4
附图简述图1pMAK705rpoSamber图2pTrc99Acatamber长度数据是近似数据。缩写及名称如下限定cat氯霉素抗性基因rep-ts质粒pSC101的温度敏感性复制区rpoSrpoS基因的编码区Amp氨苄青霉素抗性基因LacItrc启动子中阻抑基因的基因Ptrctrc启动子区域，IPTG可诱导的5S5SrRNA区域rrnBTrRNA终止子区域限制性酶的缩写含义如下●AccIII来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的限制性内切核酸酶●BamHI来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的限制性内切核酸酶●EcoRI来自大肠杆菌的限制性内切核酸酶●EcoRV来自大肠杆菌的限制性内切核酸酶●MscI来自微球菌属(Microcossus)的限制性内切核酸酶●PvuII来自普通变形菌(Proteus vulgaris)的限制性内切核酸酶●SspI来自球衣菌属(Sphaerotilus)的限制性内切核酸酶●StuI来自杀结核链霉菌(Streptomyces tubercidius)的限制性内切核酸酶●StyI来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的限制性内切核酸酶●XbaI来自巴氏黄单胞菌(Xanthomonas badrii)的限制性内切核酸酶序列表序列表<110>德古萨股份公司<120>生产氨基酸的细菌及制备L-氨基酸的方法<130>010319 BT<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>993<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(990)<223>
<400>1atg agt cag aat acg ctg aaa gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa48Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu1 5 10 15ttt gat gag aac gga gtt gag gtt ttt gac gaa aag gcc tta gta gaa96Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu20 25 30cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag144Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln35 40 45gga gcc aca cag cgt gtg ttg gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag192Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu50 55 60att ggt tat tca cca ctg tta acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg240Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala65 70 75 80cgt cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag288Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu85 90 95agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat ggc aat cgt336Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg100 105 110ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg ggg ctg atc384
Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile115 120 125cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc ttc tca aca 432Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr130 135 140tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg att atg aac 480Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn145 150 155 160caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag gag ctg aac 528Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn165 170 175gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg gac cat gaa 576Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu180 185 190cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca gtt gat gac 624Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp195 200 205gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc tcg gta gac acc 672Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr210 215 220ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc ctg gcc gat 720Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp225 230 235 240gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac gat atg aag 768Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys245 250 255cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa cag cgt gaa 816Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu260 265 270gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg gca aca ctg 864Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu275 280 285gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt gtt cgc cag 912Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln290 295 300att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg caa acg cag 960Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln305 310 315 320ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 993Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu325 330<210>2<211>330<212>PRT
<213>Escherichia coli<400>2Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu20 25 30Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln35 40 45Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu50 55 60Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala65 70 75 80Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu85 90 95Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg100 105 110Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile115 120 125Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr130 135 140Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn145 150 155 160Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn165 170 175Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu180 185 190Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp195 200 205Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr210 215 220Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp225 230 235 240Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys245 250 255Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu260 265 270Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu275 280 285Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln
290 295 300Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln305 310 315 320Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu325 330<210>3<211>993<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>Allele<222>(1)..(990)<223>rpoS-Allel<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(99)<223>amber-codon<400>3atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac60ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaatagg aacccagtga taacgatttg120gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt180taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg240cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt300ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc360gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc420cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac480caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga540accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag600caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc660tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat720gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc780
aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993<210>4<211>75<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>tRNA<222>(1)..(75)<223>supE-allele<400>4tggggtatcg ccaagcggta aggcaccgga ttctaattcc ggcattccga ggttcgaatc 60ctcgtacccc agcca 75<210>5<211>714<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(711)<223>
<400>5atg atc gag agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat48Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr1 5 10 15ggc aat cgt ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg96Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu20 25 30ggg ctg atc cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc144Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg35 40 45ttc tca aca tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg192
Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala50 55 60att atg aac caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag 240Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys65 70 75 80gag ctg aac gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg 288Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu85 90 95gac cat gaa cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca 336Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro100 105 110gtt gat gac gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc tcg 384Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser115 120 125gta gac acc ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc 432Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile130 135 140ctg gcc gat gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac 480Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp145 150 155 160gat atg aag cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa 528Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys165 170 175cag cgt gaa gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg 576Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala180 185 190gca aca ctg gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt 624Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205gtt cgc cag att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg 672Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu210 215 220caa acg cag ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 714Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu225 230 235<210>6<211>237<212>PRT<213>Escherichia coli<400>6Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr1 5 10 15Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu20 25 30
Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg35 40 45Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala50 55 60Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys65 70 75 80Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu85 90 95Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro100 105 110Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser115 120 125Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile130 135 140Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp145 150 155 160Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys165 170 175Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala180 185 190Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu210 215 220Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu225 230 235<210>7<211>19<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(19)<223>rpoS9<400>7cagttatagc ggcagtacc 19<210>8
<211>23<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(23)<223>rpoS4<400>8ggacagtgtt aacgaccatt ctc 23<210>9<211>2012<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>DNA<222>(1)..(2012)<223>rpoS9-4<400>9cagttatagc ggcagtacct ataccgtgaa aaaaggcgac acacttttct atatcgcctg60gattactggc aacgatttcc gtgaccttgc tcagcgcaac aatattcagg caccatacgc120gctgaacgtt ggtcagacct tgcaggtggg taatgcttcc ggtacgccaa tcactggcgg180aaatgccatt acccaggccg acgcagcaga gcaaggagtt gtgatcaagc ctgcacaaaa240ttccaccgtt gctgttgcgt cgcaaccgac aattacgtat tctgagtctt cgggtgaaca300gagtgctaac aaaatgttgc cgaacaacaa gccaactgcg accacggtca cagcgcctgt360aacggtacca acagcaagca caaccgagcc gactgtcagc agtacatcaa ccagtacgcc420tatctccacc tggcgctggc cgactgaggg caaagtgatc gaaacctttg gcgcttctga480ggggggcaac aaggggattg atatcgcagg cagcaaagga caggcaatta tcgcgaccgc540agatggccgc gttgtttatg ctggtaacgc gctgcgcggc tacggtaatc tgattatcat600caaacataat gatgattacc tgagtgccta cgcccataac gacacaatgc tggtccggga660acaacaagaa gttaaggcgg ggcaaaaaat agcgaccatg ggtagcaccg gaaccagttc720aacacgcttg cattttgaaa ttcgttacaa ggggaaatcc gtaaacccgc tgcgttattt780gccgcagcga taaatcggcg gaaccaggct tttgcttgaa tgttccgtca agggatcacg840
ggtaggagcc accttatgag tcagaatacg ctgaaagttc atgatttaaa tgaagatgcg 900gaatttgatg agaacggagt tgaggttttt gacgaaaagg ccttagtaga acaggaaccc 960agtgataacg atttggccga agaggaactg ttatcgcagg gagccacaca gcgtgtgttg 1020gacgcgactc agctttacct tggtgagatt ggttattcac cactgttaac ggccgaagaa 1080gaagtttatt ttgcgcgtcg cgcactgcgt ggagatgtcg cctctcgccg ccggatgatc 1140gagagtaact tgcgtctggt ggtaaaaatt gcccgccgtt atggcaatcg tggtctggcg 1200ttgctggacc ttatcgaaga gggcaacctg gggctgatcc gcgcggtaga gaagtttgac 1260ccggaacgtg gtttccgctt ctcaacatac gcaacctggt ggattcgcca gacgattgaa 1320cgggcgatta tgaaccaaac ccgtactatt cgtttgccga ttcacatcgt aaaggagctg 1380aacgtttacc tgcgaaccgc acgtgagttg tcccataagc tggaccatga accaagtgcg 1440gaagagatcg cagagcaact ggataagcca gttgatgacg tcagccgtat gcttcgtctt 1500aacgagcgca ttacctcggt agacaccccg ctgggtggtg attccgaaaa agcgttgctg 1560gacatcctgg ccgatgaaaa agagaacggt ccggaagata ccacgcaaga tgacgatatg 1620aagcagagca tcgtcaaatg gctgttcgag ctgaacgcca aacagcgtga agtgctggca 1680cgtcgattcg gtttgctggg gtacgaagcg gcaacactgg aagatgtagg tcgtgaaatt 1740ggcctcaccc gtgaacgtgt tcgccagatt caggttgaag gcctgcgccg tttgcgcgaa 1800atcctgcaaa cgcaggggct gaatatcgaa gcgctgttcc gcgagtaagt aagcatctgt 1860cagaaaggcc agtctcaagc gaggctggcc ttttctgtgc acaataaaag gtccgatgcc 1920catcggacct ttttattaag gtcaaattac cgcccatacg caccaggtaa ttaagaatcc 1980ggtaaaaccg agaatggtcg ttaacactgt cc 2012<210>10<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>rpoSamber1<400>10ggccttagta gaataggaac ccagtgataa c 31<210>11
<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>rpoSamber2<400>11gttatcactg ggttcctatt ctactaaggc c 31<210>12<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>rpoSLC1<400>12cggaaccagg cttttgcttg 20<210>13<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>rpoSLC2<400>13gcgcgacgcg caaaataaac 20<210>14<211>23<212>DNA<213>synthetic sequence
<220>
<221>Primer<222>(1)..(23)<223>rpoSamberC<400>14cttagtagaa caggaaccca gtg 23<210>15<211>34<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(34)<223>rpoSamberA<400>15gatgagaacg gagttgaggt ttttgacgaa aagg 34<210>16<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>catAccIII<400>16gctcatccgg aattccgtta ggcatagaaa g 31<210>17<211>24<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(24)
<223>catMscI<400>17gtccatattg gccacgttta aatc 24<210>18<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serULC1<400>18cttgtacttt ccagggccac 20<210>19<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serULC2<400>19tttaggaaaa gcaaggcggg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serUC<400>20tccggttttc gagaccggtc 20<210>21
<211>35<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(35)<223>serUA<400>21gagggggatt tgaacccccg gtagagttgc cccta 35<210>22<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>glnX1<400>22ctggcgtgtt gaaacgtcag 20<210>23<211>21<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(21)<223>glnX2<400>23cacgctgttc gcaacctaac c2权利要求
1.来自肠杆菌科尤其是来自大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌，其中这些细菌含有1)在rpoS基因的编码区内的至少一个选自琥珀、赭石和乳白的终止密码子及2)选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应抑制基因。
2.权利要求1的生产氨基酸的细菌，其中这些细菌在rpoS基因的编码区内含有至少一个琥珀型终止密码子及至少一个琥珀抑制基因。
3.权利要求2的生产氨基酸的细菌，其中所述琥珀型终止密码子位于相应于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白质的氨基酸序列的第2-314位的rpoS基因编码区内。
4.权利要求3的生产氨基酸的细菌，其中所述琥珀型终止密码子位于相应于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白质的氨基酸序列的第2-95位的rpoS基因编码区内。
5.权利要求4的生产氨基酸的细菌，其中所述琥珀型终止密码子位于相应于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白质的氨基酸序列的第33位的rpoS基因编码区内。
6.权利要求5的生产氨基酸的细菌，其中所述细菌含有选自supD和supE的至少一个琥珀抑制基因。
7.权利要求6的生产氨基酸的细菌，其中所述细菌至少含有琥珀抑制基因supE。
8.权利要求1的生产氨基酸的细菌，其中它们生产与所需L-氨基酸的量相比不超过40％的L-赖氨酸作为二级产物。
9.权利要求8的生产氨基酸的细菌，其中它们生产与所需L-氨基酸的量相比不超过10％的L-赖氨酸作为二级产物。
10.权利要求8的生产氨基酸的细菌，其中它们生产与所需L-氨基酸的量相比不超过5％的L-赖氨酸作为二级产物。
11.权利要求1的生产氨基酸的细菌，其中所述氨基酸是选自L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸和L-色氨酸的一种氨基酸。
12.权利要求1的生产氨基酸的细菌，其中所述氨基酸是L-苏氨酸。
13.来自肠杆菌科尤其大肠杆菌物种的生产L-苏氨酸的细菌，其中这些细菌在相应于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白质的氨基酸序列中第33位的rpoS基因的编码区内含有一个琥珀型终止密码子，及琥珀抑制基因supE。
14.权利要求13的生产L-苏氨酸的细菌，其中一或多个选自如下一组的基因被同时增强、尤其是过表达14.1编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子，14.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，14.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，14.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，14.5编码转氢酶的pntA和pntB基因，14.6授予高丝氨酸抗性的rhtB基因，14.7编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因，14.8授予苏氨酸抗性的rhtC基因，14.9来自谷氨酸棒杆菌的编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因，14.10编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，14.11编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因，14.12编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因，14.13编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因，14.14编码磷酸转移酶系统(PTS)中酶I的ptsHIcrr操纵子内的ptsI基因，14.15编码磷酸转移酶系统(PTS)中磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子中的ptsH基因，14.16编码磷酸转移酶系统(PTS)中葡萄糖特异性IIA成分的ptsHIcrr操纵子中的crr基因，14.17编码磷酸转移酶系统(PTS)中葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因，14.18编码亮氨酸调节子中调节蛋白的lrp基因，14.19编码全局调节蛋白的csrA基因，14.20编码fad调节子中调节蛋白的fadR基因，14.21编码重要中间代谢中调节蛋白的iclR基因，14.22编码10Kd陪伴分子的mopB基因，其还称为groES，14.23编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpCF操纵子内的ahpC基因，14.24编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpCF操纵子内的ahpF基因，14.25编码半胱氨酸合酶A的cysK基因，14.26编码cys调节子中调节蛋白的cysB基因，14.27编码NADPH亚硫酸盐还原酶中黄素蛋白的cysJIH操纵子中的cysJ基因，14.28编码腺苷酰硫酸还原酶的cysJIH操纵子中的cysH基因，及14.29编码NADPH亚硫酸盐还原酶中血蛋白的cysJIH操纵子中的cysI基因。
15.权利要求13的生产氨基酸的细菌，其中其它基因被弱化。
16.一种降低肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种中RpoS蛋白或σ38因子的胞内活性的方法，其中1)将选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子掺入rpoS基因的编码区中，及2)掺入编码选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA的相应抑制基因tRNA基因或等位基因。
17.权利要求16的方法，其中RpoS蛋白或σ38因子的活性或浓度降低到＞0至75％。
18.权利要求16的方法，其中RpoS蛋白或σ38因子的活性或浓度降低到＞0至5％。
19.来自肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌，其形成RpoS蛋白或σ38因子，所述蛋白或因子在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第33位含有选自如下的一种氨基酸L-丝氨酸，L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-赖氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸，L-脯氨酸，L-组氨酸，L-苏氨酸及L-缬氨酸，其中所述细菌生产选自如下的一或多种氨基酸L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-高丝氨酸，L-甲硫氨酸，L-谷氨酸，L-缬氨酸和L-色氨酸。
20.一种制备氨基酸或含有这些氨基酸的食品添加剂的方法，包括如下步骤a)发酵来自肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的细菌，所述细菌1)在rpoS基因的编码区内含有选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子及2)具有选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应抑制基因，b)富集培养基或微生物细胞中的氨基酸，及c)分离所述氨基酸，其中任选发酵肉汤的成分和/或全部或部分生物量(≥0至100)留在产物中。
21.权利要求20的方法，其中所述氨基酸是选自如下的一种氨基酸L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-高丝氨酸，L-甲硫氨酸，L-谷氨酸，L-缬氨酸和L-色氨酸。
22.权利要求21的方法，其中所述氨基酸是L-苏氨酸。
23.一种制备L-苏氨酸的方法，其包括如下步骤a)发酵来自肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的细菌，所述细菌1)在rpoS基因的编码区内相应于SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第33位含有至少一个琥珀型终止密码子及2)至少具有相应的琥珀抑制基因supE，b)富集培养基或微生物细胞中L-苏氨酸，及c)分离L-苏氨酸，其中任选地发酵肉汤中的成分和/或全部或部分生物量(≥0至100)留在产物中。
24.来自肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌，其含有或形成SEQ ID NO6所示的RpoS蛋白。
25.一种制备氨基酸或包含氨基酸的食品添加剂的方法，其中进行如下步骤a)发酵含有或形成具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的RpoS蛋白的肠杆菌科，b)富集发酵肉汤中的氨基酸，c)从发酵肉汤中分离氨基酸或含有氨基酸的食品添加剂，任选地d)分离发酵肉汤中的成分和/或生物量(≥0至100％)。
26.大肠杆菌菌株DM1690，其保藏在德国微生物及细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号DSM 15189。
27.权利要求23的方法，其中使用保藏号为DSM 15189的大肠杆菌菌株DM1690。
28.一种弱化或关闭肠杆菌科尤其是大肠杆菌物种中的一或多个基因或开放读框的方法，所属基因选自tdh，mdh，pckA，poxB，aceA，dgsA，fruR，ugpB，aspA，aceB，aceK，yjfA和ytfP，其中1)在所述基因的编码区中掺入选自琥珀、赭石和乳白的至少一个终止密码子，及2)同时掺入选自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相应抑制基因。
全文摘要
本发明涉及来自肠杆菌科尤其大肠杆菌物种的生产氨基酸的细菌，其在rpoS基因编码区核苷酸序列中含有选自琥珀、赭石或乳白的一种终止密码子及选自琥珀抑制基因，赭石抑制基因或乳白抑制基因的一种终止密码子抑制基因。本发明还涉及使用这些细菌制备氨基酸尤其L－苏氨酸的方法。
文档编号C12N1/21GK1639350SQ03805271
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年3月7日
发明者梅希特希尔德·里平, 妮科尔·西贝尔特 申请人:德古萨股份公司