专利名称：通过dna自组装得到的dna纳米笼及其制备方法,和利用该纳米笼的dna纳米管以及分子载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由设定序列的、三向分叉的双链DNA自组装成的新分子装配体-DNA纳米笼和其制备方法，以及一种DNA纳米管和利用纳米笼的分子载体。
背景技术：
近年来，在纳米技术领域，利用DNA的自组装的分子装置有了积极的发展。
DNA的信息通过其碱基单位腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)被编码至核苷酸的一级序列中。DNA单链具有识别互补链和通过杂交与其结合形成双链核酸的特性。这可通过在核酸内部形成碱基对如A识别T和G识别C来实现。一特定序列只与一适当的互补性序列杂交。从而，在原子和分子水平提供了高的碱基序列特异性。因此，DNA在其功能和结构形态方面令人十分感兴趣，且在生物信息学中已进行了研究，如“人类基因组计划”或其类似的。
N.C.Seeman等通过一个包括装配、连接、纯化、重建和连接的五步反应，采用10种寡核苷酸合成了一个由DNA制成的管(DNA管)(J.Chen，N.C.Seeman，Nature，350，631-633(1991)，N.C.Seeman，Acc.Chem.Res.，30，357-363(1997))。
但是，根据Seeman等的DNA管合成的方法存在问题其需要复杂和耗时的操作，并需要高的花费。其存在进一步的问题由于DNA管为一种具有约10nm大小的管，其难以在内部包括纳米级粒子如蛋白或其类似物和用作纳米粒子的转运载体。
同时，考虑到用作转运载体的分子载体，特别是具有靶向性和根据温度或DNA分子识别来释放药物的、用于药物传送系统中的药物载体，主要地由脂质分子构成的脂质体已被广泛地应用。
然而，存在一个问题，即制备脂质体需要能量作用如超声波辐射。
本发明人已建立了一种技术，通过双链形成的自组装沿着一维DNA构建糖簇，其中所述双链通过包含寡核苷酸和半乳糖的结合物与半滑动的互补链的结合形成(JP-A-2001-247596，K.Matsuura，M.Hibino，Y.Yamada和K.Kobayashi，J.Am.Chem.Soc.，123，357-358(2001))。
因此，具有DNA分子固有特征(即基于碱基对的分子识别和基于杂交的自组装)的、可通过无需能量的自组装的一个步骤而构建的、且在内部可包括纳米粒子的DNA纳米笼的发展，已被高度地需求。
因此，本发明的目的是提供一种由DNA制成的并可通过仅混合三种寡核苷酸且无需能量而形成的纳米笼，提供一种制备DNA纳米笼的方法，其中DNA纳米笼可通过一个步骤简单而经济地构建，以及提供一种DNA纳米管，其中DNA纳米笼在一维方向上连接，和一种分子载体，其能在内部可逆地包含许多纳米粒子如金属纳米粒子或蛋白质。
发明的公开本发明人为了解决上述问题刻苦地进行了研究，并因此发现了通过自组装形成的一维DNA装配的概念延伸至二维和三维的概念从而获得了球形的DNA纳米笼，其中能可逆地包含金属纳米粒子、蛋白质或其类似物。该发现导致了本发明的完成。
也就是说，本发明通过如下[1]至[6]所述的内容来详细说明。
DNA纳米笼，其特征在于该纳米笼是通过由三种设定序列的寡核苷酸构成的三向分叉的双链DNA自组装形成的。
如[1]中所述的DNA纳米笼，其特征在于该纳米笼成球状。
一种生产DNA纳米笼的方法，其特征在于包括通过杂交二维装配三种寡核苷酸，从而形成末端具有自身互补链的三向分叉的双链DNA的步骤，和三维自组装获得的三向分叉的双链DNA以消耗所有的自身互补末端的步骤。
如[3]所述的生产DNA纳米笼的方法，其特征在于将该三种寡核苷酸在0至10℃下混合用于杂交。
DNA纳米管，其特征在于如[1]或[2]所述的DNA纳米笼在一维方向上连接和融合。
一种分子载体，其特征在于金属纳米粒子或蛋白质包含在如[1]或[2]所述的DNA纳米笼中。
附图简述
图1为本发明中生产DNA纳米笼的一流程图，图2为本发明中三种寡核苷酸的一个实施例，图3为本发明中三向分叉的双链DNA的一个实施例，图4为本发明中DNA纳米笼的一个模型，图5为本发明中DNA纳米管的一个模型，图6为本发明实施例1中DNA纳米笼的透射电子显微镜图象，图7为一个通过本发明实施例1中DNA纳米笼的动态光散射而显示粒子大小分布的图表，图8为一个显示采用外切核酸酶III对DNA纳米笼进行剪切反应的时间进程图表，图9为本发明实施例2中DNA纳米笼网状结构的透射电子显微镜图象，图10为本发明实施例3中DNA纳米笼的透射电子显微镜图象，图11为本发明实施例4中DNA纳米管的透射电子显微镜图象，图12为包含在本发明实施例5的DNA纳米笼中的阳离子金纳米粒子的透射电子显微镜图象，图13为包含在本发明实施例6的DNA纳米笼中的阴离子金纳米粒子的透射电子显微镜图象，图14为包含在本发明实施例7的DNA纳米笼中的金属蛋白、铁蛋白的透射电子显微镜图象。
实施本发明的最佳方式本发明如下将详细描述。
按图1所示可生产本发明的DNA纳米笼，通过杂交以二维装配三种寡核苷酸，从而形成三向分叉的末端具有自身互补链的双链DNA，并且三维自组装所述的三向分叉的双链DNA以消耗全部的自身互补末端。
也就是说，通过本发明所述方法获得的DNA内米笼被这样设计，从而寡核苷酸通过杂交装配以获得三向分叉的末端具有自身互补链的双链DNA，同时获得的双链DNA被进一步装配，从而消耗所有的末端以形成纳米笼。
因此，该DNA序列是可选择的，只要其符合序列设计的这种条件。例如，用于生产DNA纳米笼的寡核苷酸序列示于图2中。合成三种寡核苷酸链，其被设计用于形成在每一3’-末端具有自身互补的单链DNA的三向分叉的双链DNA。也就是说，例如，设计一碱基序列，使其可能形成一个三角形的轮辐状的复合体，一个来源于鸟嘌呤和胞嘧啶为主要互补碱基对的三向分叉的双链DNA，并利用由腺嘌呤和胸腺嘧啶组成的粘贴位点进一步形成更高级别的DNA结构。
在本发明中，自身互补的末端是指一个具有从5’-末端读取的序列和从3’-末端读取的序列互补(这就是说T与A互补，C和G互补)的DNA序列的单链DNA末端。这样的序列可自身形成一双链DNA。例如，5’-GCTTCGATCGAAGC-3’是一自身互补序列。
在本说明书中，寡核苷酸是指一种化合物，其中包括一脱氧核糖和核酸碱基的每一核苷通过磷酸二酯键连接形成寡聚体(从几个核苷到几十个核苷)。双链DNA是指一复合体，其中寡核苷酸通过杂交形成一双螺旋。
合成本发明中的3种寡核苷酸链的方法不受限制。一般地，其通过一自动合成仪或类似的采用氨基磷酸盐方法来合成。
优选的，生产本发明中的DNA纳米笼的过程在低于双链DNA解离温度(解链温度)的温度下进行。解链温度取决于寡核苷酸的序列。例如，当寡核苷酸具有如图2所示的长度和序列时，双链在约35℃下解离成为单链。
优选的，将本发明中的三种寡核苷酸在0至10℃的温度下混合杂交。在这里，当该温度超出该范围时，虽然形成了三向分叉的双链DNA，但倾向于自身互补末端没有装配入笼内。
本发明中的三种寡核苷酸的长度优选地约为10链节至100链节。在这里，当长度小于10链节时，解链温度下降。由于这个原因，倾向于DNA链的杂交难以发生并且无法形成笼。当长度大于100链节时，倾向于几乎观察不到任何清晰的结构。该三种寡核苷酸的长度可以互相相同或不同。当长度相同时，则获得高度对称的装配，其优选形成球状笼。也可能采用不同长度，构建一不对称的，例如，鸡蛋形状的结构。
本发明中的三种寡核苷酸的总浓度优选为1μM或更多。在这里，当其低于1μM时，倾向于不发生杂交，观察不到装配的形成，并且观察不到DNA纳米笼，因为没有足够引起DNA氢键结合的机会。
在生产本发明所述的DNA纳米笼的过程中，三种寡核苷酸水溶液的盐浓度优选为0.25M至1.0M。在这里，当其低于0.25M时，倾向于由于静电排斥几乎不形成双链，并且几乎观察不到DNA纳米笼。当其高于1.0M时，倾向于DNA纳米笼被键合。因此，为了观察到独立的纳米笼，优选的盐浓度约为0.5M。
在生产本发明所述的DNA纳米笼的过程中，所使用的盐没有特别限定。可采用一价金属盐，并且可不考虑盐的特定类型来生产纳米笼。其中，优选采用NaCl。
该DNA纳米笼可通过本发明中的三向分叉的双链DNA进一步三维自组装(参考图3)从而消耗所有的自身互补末端来获得。DNA纳米笼模型示于图4中。根据DNA序列、DNA的长度和浓度、盐浓度及类似的可适当调整其大小和形状在本发明中，优选的在水溶液中进行DNA分子装配的自组装。也可以在气一液界面上进行自组装。
本发明所述的DNA纳米笼为仅由DNA构成的且内部中空的笼形装配体。形状的例子包括多边形结构，球形和鸡蛋形及其类似的。该形状不局限于这些形状，并通过变化条件改变成各种类型。特别是有助于将纳米粒子包含入笼的内部，优选为球形形状。此外，通过改变寡核苷酸的浓度，也可以形成管状装配体，即DNA纳米管。例如，当寡核苷酸浓度为2μM且盐浓度为1M时，约50nm的球形装配体进一步组装成网状结构。当寡核苷酸浓度为5μM且盐浓度为0.5M时，则形成大约50至200nm的大的球形装配体。当寡核苷酸浓度为50μM或更高且盐浓度为0.5M时，则形成直径约为20nm且长度为1μm的DNA纳米管。
本发明中形成的球形DNA纳米笼的直径优选为20至200nm。根据使用DNA纳米笼的目的，可适当改变该直径。例如，当纳米笼包括2个或3个蛋白质时，优选为小直径的笼。当其包括大的物质如病毒时，优选为大直径的笼。
本发明所述的DNA纳米管具有DNA纳米笼在一维方向上连接和融合的一种结构。也就是说，可以认为DNA纳米笼熔解且变成为一个更大的分子装配体，即DNA纳米管。对于连接的DNA纳米笼的数目没有特别限定。
一个DNA纳米管的模型示于图5中。
本发明所述的DNA纳米管的大小没有特别限定。优选的，直径约为1至50nm且长度为100nm至10μm。当直径和长度超出这些范围时，则DNA纳米管将偏离纳米级区域，且难以说成是管状的。
本发明所述的DNA纳米笼或DNA纳米管可在其内部空间包括多个纳米粒子，纳米粒子的例子包括金、银、铂、钯及其类似物的金属纳米粒子，硫化镉、硒化镉、硫化锌及其类似物的半导体纳米粒子，氧化钛及其类似物的光催化纳米粒子，氧化铁及其类似物的磁性纳米粒子，二氧化硅粒子，和杂多酸纳米粒子，塑料纤细粒子，病毒，蛋白质，肽，多糖，另一DNA及其类似物。其可作为分子载体来使用，并可相应于环境变化如温度或类似的释放其包含物。
特别地，多个阳离子和阴离子的金纳米粒子或多个铁蛋白可被包含在DNA纳米笼，即由DNA构成的笼中。在这些DNA装配体中，可根据温度或离子强度米控制解离和重建。因此，可以认为采用包括了蛋白质药物在其中的DNA装配体，可构建一个热应答的药物释放系统。由于通过提供与构建DNA装配体的DNA链完全互补的链也可使DNA构建体解离，因此可构建一个对特定基因序列应答的药物释放系统。此外，通过将糖链或其类似物结合至寡核苷酸以赋予其细胞特异性，其可用作一种新的药物传送系统。
同时，由于量子尺寸效应，已知金属纳米粒子显示出不同于那些大体积金属的光学、电学和磁学的特性。
本发明所述的DNA纳米笼或DNA纳米管可包含多个金属纳米粒子，且可控制该金属纳米粒子的聚集状态。纳米粒子发生聚集以产生与那些单个纳米粒子不同的特性。例如，很清楚，在聚集形成中，金纳米粒子的胞质团吸收转移到较长的波长。在其中包括了金纳米粒子的DNA装配体中，以及其中包括了蛋白质的DNA装配体中，可通过温度或特殊分子识别来控制解离和重建。因此，可构建一个通过温度或特殊分子识别来改变光学特性的装置。此外，当在存在这些DNA装配体的情况下来制备纳米粒子时，可形成具有特定尺寸和形状的纳米粒子。这些方法也可适用于半导体和磁性粒子。
在本发明中，可被包含于DNA纳米笼或DNA纳米管中的纳米粒子的尺寸优选为2nm至200nm。在这里，当尺寸小于2nm时，纳米粒子有可能从DNA纳米笼的格子间漏出。当尺寸大于200nm时，则纳米粒子太大以至于不被包含至DNA纳米笼中。
在本发明中，可被包含至DNA纳米笼或DNA纳米管中的纳米粒子的数目可根据纳米粒子的大小适当地变化。
为了有助于将纳米粒子结合至本发明的DNA纳米笼中，可通过采用阳离子或阴离子保护分子来制备纳米粒子。
根据表面电荷，本发明中的纳米粒子以不同的位点粘着于DNA纳米笼或DNA纳米管。例如，在正电荷的情况下，可以认为纳米粒子粘着于DNA纳米笼的表面(内表面和外表面)。在中性和负电荷的情况下，可以认为纳米粒子存在于DNA纳米笼的内部水相中，且不直接与DNA相互作用。
将纳米粒子包含入DNA纳米笼或DNA纳米管的方法没有特别限定。在存在纳米粒子的条件下，一旦将DNA纳米笼的水溶液加热至约70℃以解离纳米笼，然后将温度降至10℃，由此纳米笼发生重建，然后纳米粒子被包含于其中。
实施例通过参考实施例，如下将更详细地阐明本发明。然而，这些实施例仅仅是可实行的实施例，并不意味着限定本发明。此外，在不超出本发明范围的情况下可以对其进行改变。
实施例1将3种具有如图2所示序列的30一链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5MNaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝1μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。结果示于图6中。
在图6中，可观察到具有直径约为20至70nm的球形装配体。
通过动态光散射(DLS)测量，也可证实构建了具有直径约为20至70nm的球形装配体，如图7中所示。在该图中，除了20至70nm外，在700纳米附近也观察到一峰值，表明笼形结构发生聚集并且出现了明显的峰值。
从这些实验结果中，可以认为图6中观察到的球形DNA装配体是通过杂交三种寡核苷酸以形成具有末端自身互补链的三向分叉的双链DNA，然后装配双链DNA以消耗全部的自身互补末端来构建的。
随后，测量从末端消化DNA的核酸酶的消化活性来证实球形DNA装配体的结构。
也就是说，采用连接酶将上述获得的球形DNA装配体连接，并采用绿豆核酸酶除去多余的单链DNA。随后，采用从3’-末端特异消化双链的外切核酸酶III来测量消化活性。结果示于图8中。
从图8中可以清楚地看到，在消化具有末端的双链DNA的情况下(660mMTris-HCl缓冲液，6.6mM MgCl2，pH8，70单位的酶，37℃)，连接的DNA装配体没有发生任何消化。从而，本实施例中获得的球形DNA装配体被证实为纳米笼形状。
实施例2将3种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于1MNaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝2μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。结果示于图9中。
图9显示了具有直径约为30至50nm的球形装配体进一步组装成网状结构。
实施例3将3种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5M NaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝5μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。结果示于图10中。
在图10中，可观察到具有直径约为50至200nm的球形装配体。
实施例4将3种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5M NaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝50μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。结果示于图11中。
在图11中，可发现形成了一个具有直径约为20nm且长度为1μm的DNA纳米管。
对比例1将3种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在30℃下混合于0.5M NaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝1μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在30℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。
结果表明，由于3种寡核苷酸的混合温度为30℃，自身互补末端部分的DNA双链发生解离，并且没有观察到球形装配体。
对比例2将2种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5M NaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝1μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。
结果表明，没有观察到如实施例1中所获得的这种球形装配体。
对比例3
将3种缺失自身互补末端的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5M NaCl水溶液中，以使总寡核苷酸浓度＝1μM，并将溶液放置12小时。
将该溶液在10℃下滴至一个TEM网格上，并采用醋酸双氧铀对样品染色，在透射电子显微镜下观察。
结果表明，没有观察到如实施例1中所获得的这种球形装配体。
实施例5将1μM的将3种与实施例1所述序列相同的30-链节的寡核苷酸在10℃下混合于0.5mM NaCl水溶液中，在1.4mM的受季铵盐保护的阳离子金纳米粒子(平均粒子直径为2.2nm)存在下，形成一分子载体。
随后，在不染色的情况下进行TEM观察。结果示于图12中。
在图12中，可发现金纳米粒子形成约20至70nm的聚集体。当采用醋酸双氧铀染色DNA时，可发现染色部位与金纳米粒子聚集的部分相一致。
在组装过程中，金纳米粒子的胞质团吸收带红移了约26nm。这被认为是由于金纳米粒子包含在DNA纳米笼中而引起的。
实施例6除了将阴离子金纳米粒子用作客体分子，包含于DNA纳米笼的内部之外，采用与实施例5相同的方法来制备分子载体。
如实施例5中进行TEM观察。结果示于图13中。
在图13中，可发现金纳米粒子形成约2.5至30nm的聚集体。当采用醋酸双氧铀染色DNA时，可发现染色部位与金纳米粒子聚集的部分相一致。
实施例7除了将铁蛋白、金属蛋白用作客体分子，包含于DNA纳米笼的内部之外，采用与实施例5相同的方法来制备分子载体。
如实施例5中进行TEM观察。结果示于图14中。
在图14中，可发现铁蛋白形成约8至25nm的聚集体。当采用醋酸双氧铀染色DNA时，可发现染色部位与铁蛋白聚集的部分相一致。
工业实用性由于本发明所述的DNA纳米笼可容易地通过一步过程由DNA形成，并且包含纳米粒子至其内部，因此该DNA内米笼对于采用DNA的功能材料的发展是显著有效的。此外，DNA纳米笼可在从纳米领域到可视领域的广泛的技术领域中有发展的可能。因此，其也可作为下一代的多功能材料来使用。此外，通过包含蛋白质药物至其内部和结合细胞靶分子至其表面，其可作为一种用于药物传送系统的新型载体来使用，其具有靶向特性并且相应于温度或DNA分子识别缓慢释放蛋白质药物。
由于本发明的DNA纳米笼可以仅通过混合而几乎不需要任何能量形成，因此其作为分子载体具有高度的有用性。
序列表<110>Kyushu TLO Company，Limited<120>通过DNA自组装得到的DNA纳米笼、其制备方法及其作为DNA纳米管和分子载体的应用<130>F-SK001<140>PCT/JP03/02644<141>2003-03-06<150>JP 2002-061504<151>2002-03-07<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用DNA自动合成仪通过亚磷酰胺固体合成法合成的寡核苷酸<400>1ggcgtggtag accgcactcg aaaaattttt<210>2<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用DNA自动合成仪通过亚磷酰胺固体合成法合成的寡核苷酸<400>2cgagtgcggt gacgatgcct aaaaattttt<210>3
<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用DNA自动合成仪通过亚磷酰胺固体合成法合成的寡核苷酸<400>3aggcatcgtc ctaccacgcc aaaaattttt
权利要求
1.DNA纳米笼，其特征在于该纳米笼通过由三种设定序列的寡核苷酸各自构成的三向分叉的双链DNA自组装形成。
2.如权利要求1所述的DNA纳米笼，其特征在于该纳米笼成球状。
3.一种生产DNA纳米笼的方法，其特征在于包括通过杂交二维装配三种寡核苷酸，从而形成末端具有自身互补链的三向分叉的双链DNA的步骤，和三维自组装所获得的三向分叉的双链DNA以消耗所有的自身互补末端的步骤。
4.如权利要求3所述的生产DNA纳米笼的方法，其特征在于将该三种寡核苷酸在0至10℃下混合用于杂交。
5.DNA纳米管，其特征在于如权利要求1或2所述的DNA纳米笼在一维方向上连接和融合。
6.一种分子载体，其特征在于金属纳米粒子或蛋白质包含在如权利要求1或2所述的DNA纳米笼中。
全文摘要
本发明提供了一种生产DNA纳米笼的方法，其特征在于包括一个步骤是通过杂交二维装配三种寡核苷酸，从而形成末端具有自身互补链的三向分叉的双链DNA，和一个步骤是三维自组装获得的三向分叉的双链DNA以消耗所有的自身互补末端。由于本发明所述的DNA纳米笼可以通过一步过程容易地形成，并可包含纳米粒子至其内部，因此该DNA纳米笼对于应用DNA的功能性材料的发展是显著有效的。
文档编号C12N15/10GK1692157SQ0380540
公开日2005年11月2日 申请日期2003年3月6日 优先权日2002年3月7日
发明者松浦和则, 君塚信夫, 山下太郎 申请人:株式会社产学连携机构九州