实时测量细胞反应的制作方法

专利名称：实时测量细胞反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及实时观察细胞增殖(proliferation)，药物敏感性，细胞周期位置和其它体外细胞反应。本发明涉及用荧光蛋白作为标记物直接观察细胞，特别是活细胞。细胞在细胞周期中的状态可通过分别标记胞核和胞浆来监测。
背景技术：
来自维多利亚多管水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)被发现于1962年。在1992年克隆了GFP基因后，GFP的结构，机制和应用发展得非常迅速。在发现GFP基因在其它生物体的异源表达后，GFP成为应用最广泛的报道基因之一。在1999年，另一个家族的荧光蛋白，包括盘体虫(Discosoma)Red(DsRed)从珊瑚被克隆出来，之后在2000年是海葵(Anemonia)asRed，在2001年是HcRed被克隆出来。这些蛋白的生物作用从如GFP的纯信号功能扩展到从珊瑚分离的新的蛋白对光合共生动物的光保护。对于这些有颜色的水溶蛋白中的两种，GFP和DsRed，其分子量为25-27kD，X射线结构分析显示了同源的β-折叠结构。这些蛋白的初级结构的共同特征是占据了GFP位置的66和67的氨基酸酪氨酸和甘氨酸是保守的，并且在翻译后自动催化的修饰中参与了发色团的形成。
这些蛋白(野生型和突变体)可用作多颜色报道分子。它们的荧光的光谱范围为大约180nm，从光谱的“蓝色”峰值位置460nm到红色区的640nm。GFP是细胞生物学(Gerdes，H.-H.，和Kaether，C，FEBS Letters(1996)38944-47)，免疫学(Kawakami，N，等Immunology Lett(1999)70165-171)以及传染病研究，例如模型动物上的宿主-病原体相互作用研究(Zhao，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.(2001)989814-9818)中最广泛应用的遗传标记之一。GFP已经被用作肿瘤生长，转移，和血管生成(Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.(2002)993824-3829；Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211；和Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)982616-2621)，基因表达(Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)9712278-12282)，和细菌感染(Zhao，M，等同上)的全身造影(whole-body imaging)。
在所有这些应用中，发射红色对于最小化背景发射和体内散射，以及对于FRET(荧光共振能量转移)分析特别重要。荧光蛋白的高消光系数，量子产额，和单体状态对于它们作为报道分子的用途，包括体内应用，是很重要的参数。与仅有很小的二聚体化趋势的GFP相比，相关的蛋白有明显的趋势来形成寡聚体，例如在DsRed观察到的四聚体，或甚至更高的聚集体。消光系数和量子产额对于红色蛋白质以及对于新开发的单体DsRed也是相对低的。
人组蛋白H2B基因已经与编码维多利亚多管水母的GFP的基因融合，并转染到人细胞来生产稳定的细胞系，该细胞系构成性表达H2B-GFP。将所述H2B-GFP融合蛋白掺入核小体而不影响细胞周期进展。H2B-GFP可使胞核以高分辨率成像，其包括有丝分裂的染色体和间期的染色质，并且后者显示了活细胞的多种染色质浓缩状态(Kanda，T，等Curr.Biol.(1998)8377-385)。
所引用的文章其公开在此引入本文作为参考。
这些蛋白质已经用来监测肿瘤转移，并作为报道基因来监测表达。见例如Kanda，T，等Curr.Biol.(1998)8377-385；Yang，M，等Clin.Exp.Metastasis(1999)17417-422；Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)982616-2621；和Yang，M，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829。然而，就申请人所知，这些蛋白质至今未用于监测细胞增殖(cellularproliferation)，细胞周期状态，或体外的细胞药物敏感性，并且至今为止双标记的细胞也没有在体外或体内使用过。
大多数体外监测增殖的技术都导致细胞的死亡。例如，附着在塑料表面增殖的细胞可以通过酶，如胰蛋白酶，从塑料释放，然后用粒子计数器计数。通常使用的还有染料如四氮唑盐染料，它被来自线粒体酶活性的电子还原，并对细胞的生存力不利。另外，lacZ基因可能被引入所述细胞并用作标记物，但为了能观察到活性，必须染色所述细胞。
因此，监测增殖的传统方法包括破坏正常细胞的代谢，甚至导致细胞死亡。
本发明提供机会来体外或体内实时观察增殖和其它细胞活性。这些观察也可扩展到在不同阶段利用胞核/胞浆比率的变化来观察细胞周期。
就申请人所知，尽管融合到GFP的H2B基因已被用来标记胞核，还没有用两种不同颜色的蛋白质来分别标记活细胞的胞核和胞浆的提议。本发明提供了观察这种活细胞的可能性。

发明内容
本发明涉及体外和体内观察细胞增殖和对其多种化合物的敏感性的方法。另外，本发明针对双标记细胞，其中一种颜色被用来标记胞核而不同的颜色被用来标记胞浆。
因此，本发明一方面涉及体外测量细胞增殖的方法，该方法包括以时间为函数观察用荧光蛋白标记的培养物中的细胞的荧光强度变化的步骤。
本发明另一方面涉及体外监测细胞对化合物如药物的反应的方法，它是通过以时间为函数，在存在和缺如被测化合物时，测量细胞培养物发射的荧光，其中所述培养物中的细胞已经被修饰来表达荧光蛋白。
本发明另一方面还涉及标记活细胞的方法，该方法通过提供给细胞具有保留在胞浆内的带第一种颜色的第一种荧光蛋白的表达系统，和偶联到靶向胞核蛋白的第二种荧光蛋白的表达系统，其中在所述第一种蛋白和所述第二种融合蛋白表达时，所述细胞的胞核被一种颜色标记并且胞浆被不同的颜色标记。
本发明另一方面涉及如此制备的细胞，它在胞浆用第一种荧光蛋白稳定标记并且在胞核中用颜色不同于第一种荧光蛋白的第二种荧光蛋白稳定标记。
本发明另一方面涉及使用双标记的活细胞的方法，该细胞用本发明方法在培养物或在活体植物或动物中得到。多种物质对细胞周期的作用也可用这些细胞来确定。
附图简述

图1显示体外稳定地高表达GFP和RFP的人纤维肉瘤细胞(HT-1080-双-1)。在逆转录病毒载体中用RFP和新霉素抗性基因，组蛋白H2B-GFP和潮霉素抗性基因转染人纤维肉瘤细胞(HT-1080)。用G418和潮霉素选择双转化体并建立稳定克隆。条形标识(bar)为50μm。
图2是亲代和表达荧光蛋白的克隆的细胞的增殖率比较。在每个时间点计数每个克隆三个培养皿(亲代HT-1080，HT-1080-RFP，HT-1080-双-1和HT-1080-双-6)的细胞数一周。胰蛋白酶化细胞，用台盼蓝染色，并在血细胞计数器上计数。实心圆表示每组的平均细胞数。
图3A-3B显示用荧光标记的细胞体外时程观察细胞增殖的过程。在补充了10％FBS的PRMI 1640中培养HT-1080-双-1细胞，并在多个时间点在荧光显微镜下捕捉相同活细胞的时程图像。图3A以五分钟间隔拍摄。a0分钟。b5分钟。c10分钟。d15分钟。e20分钟。f25分钟。g30分钟。条形标识20μm。图3B以三十分钟间隔拍摄。a0分钟。b30分钟。c60分钟。d90分钟。e120分钟。条形标识75μm。绿圈和白圈表示观察到正在增殖的细胞的代表性区域。即使有丝分裂细胞改变了它们的相对位置，也可以容易地观察到它们。
图4A-4B显示了被星形孢菌素(staurosporine)诱导的HT-1080-双-6凋亡的图像。将HT-1080-双-6细胞与2μM星形孢菌素温育来诱导凋亡。在蓝光下观察所述细胞，并且用CCD照相机和荧光显微镜捕捉图像。图4A显示了2μM星形孢菌素处理后十二小时的图像。HT-1080-双细胞被高比例地诱导了凋亡。条形标识，50μm。图4B显示了如下用2μM星形孢菌素诱导的HT-1080-双-6细胞凋亡过程的实时高放大倍数图像a未处理。b星形孢菌素处理后2小时。c4小时。d6小时。e8小时。f10小时。g12小时。可很好观察到胞浆和胞核的浓缩和核碎片。条形标识，10μm。
图5A-5B显示的是将HT-1080-双-1细胞注射到颈总动脉后立即出现的脑实验转移。通过带有皮肤瓣窗的颅骨以单个细胞水平观察微动脉中的双标记细胞栓子(emboli of dual-coded cells)。观察所述细胞形态以及每个细胞核的形态。图5A是低放大倍数的视图。条形标识，400μM，其中白色正方形表示图5B显示的放大倍数高的视图的区域。图5B为放大倍数高的视图。条形标识，100μM。
图6A-6B显示了活小鼠中肿瘤细胞增殖的实时图像。在注射细胞12小时后捕捉活体小鼠中有丝分裂的肿瘤细胞的实时图像。图6A显示了放大倍数高的图像。条形标识，50μM。图6B为图6A的略图。
图7A-7D显示了双标记的PC-3人前列腺癌细胞的细胞周期图像，其包括G1期，S期，G2期和M期。图7E显示了正在凋亡的PC-3双标记细胞。
图8显示了TaxolTM对PC-3双标记细胞的作用时程。
图9显示了TaxolTM作用的其它图像，其包括凝胶电泳显示的结果。
图10显示了用长春花碱(vinblastin)处理双标记PC-3细胞的结果。
图11显示了凋亡的PC-3双标记细胞的体内图像。
发明内容可通过分别标记胞核和胞浆来增强从细胞标记获得的信息。此双标记方法不仅监测细胞增殖而且监测细胞生存中的事件。特别方便的是本发明的标记，其中胞核被标记为荧光发射的一种颜色，而胞浆被标记为另一种颜色。
本发明的一个特征是简单通过监测荧光，在体外或体内实时监测细胞增殖的方法。虽然所述双标记的细胞可用在本方法，但严格地说，双标记法并不是必需的。可以使用只标记了单一荧光标记、其强度可测、但细胞仍存活的细胞。也可用这种方法通过确定药物或物质对细胞增殖的作用来监测对多种处理或药物的反应。
适用于本发明的细胞是任何真核生物的细胞，所述真核生物如酵母，真菌，植物，脊椎动物和无脊椎动物，其包括人的细胞。为观察单细胞生物，如酵母，和例如，霉菌或真菌，优选直接观察培养物。对于较高等的植物和动物细胞，也可观察细胞培养物。合适的动物包括，通常为实验动物如大鼠、小鼠和其它啮齿类动物，家畜(domestic animal)如牲畜、鱼和人的细胞。
对于不需要双标记胞浆和胞核的本发明方法，除了上面讨论的真核细胞，可以使用原核细胞。
根据本发明方法，用荧光蛋白标记所述细胞。如上所用“荧光蛋白”指应合适的刺激会发射光的蛋白。通常，在用激发波长照射时，荧光蛋白发射在可见范围，即在约400nm-800nm的范围的光。使用仪器时，可用较宽的范围。也可使用其它诱发荧光的机制；方便的例子是萤光素酶的例子，其中使用了代谢能来影响信号产生。因此，“荧光蛋白”指在提供了合适能量时会发射“可见”范围光的蛋白，该能量可以通过激发照射(excitation radiation)，化学发光，或其它提供了必要能量来影响光发射的机制来提供。
很多本发明的实施方案中使用了荧光蛋白，如上述背景部分的那些。显然，这些荧光蛋白可产生多种颜色；在一些符号(notation)中，所述颜色被包括在蛋白质的缩写中，如GFP为绿色荧光蛋白和RFP为红色荧光蛋白。然而，因为原始分离的荧光蛋白是绿色的，有时用缩写GFP来通称这些荧光蛋白而不考虑所发射的波长。这样，一方面，GFP可发射例如黄色，红色或蓝色波长范围的光。由上下文可以清楚知道是否使用了GFP的通用含义还是指的绿色波长内发射的光。例如，在举例的实施方案中，用红色荧光蛋白标记胞浆并用绿色荧光蛋白标记胞核。用符号表示这些细胞时，GFP实际指绿色波长的发射并且RFP指红色波长的发射。
本发明提供体外或体内观察细胞增殖，并确定细胞增殖率的方法，该方法通过以时间为函数观察发射的荧光强度。用此技术也可确定克隆的异质性。
获得产生荧光蛋白的转化细胞的方法在本领域已知。可使用很多种颜色的荧光并且已经产生了，例如，美国专利6,232,523所述稳定的细胞系，该文献引入本文作为参考。本发明一项实施方案中，不在体内观察这些细胞，而是将这些细胞应用于体外的实时检测中。
一项实施方案中，将稳定表达荧光蛋白，如GFP的癌细胞系稳定接种到96-孔的培养皿。在周期性时间点，在荧光读板机，如Molecular DevicesGemini测量板中每个孔的荧光。在每个特定的孔，在所述细胞增殖时，荧光的强度增强。因此，通过绘图或另外处理荧光强度对时间的数据可以直接读出增殖率。
为检测各种物质对细胞增殖的作用，标记板中的孔，以使一组(set)孔作为对照，而其它组的孔与目的药物温育。在合适的时间段，通常每天或每两天，读出板上每孔的荧光强度来获得对照和药物处理的孔的生长曲线。用于这些测定时培养物不需要处理或添加物。因为GFP在将死的凋亡或坏死细胞中被水解后不发射荧光，所以所述GFP是细胞生存力的瞬时标记物。每孔的总荧光与可定量的存在的活细胞数相关。因此，容易确定被测化合物抑制或提高增殖的能力。
在前面方法的一个应用中，可给每个孔提供衍生自肿瘤的最少量的细胞，或甚至单个细胞。以这种方式，通过使用本发明方法可确定肿瘤异质性。通过孔之间获得的差异可观察到异质性，每个表示得自所述肿瘤的一个或少量细胞的增殖。
本发明也提供了稳定转化的细胞，它表达胞浆和胞核的标记物。通过向活细胞提供无胞核靶向信号的荧光蛋白的表达系统和包含编码颜色不同的第二种荧光蛋白与胞核靶向序列偶联的融合蛋白的核苷酸序列的表达载体，在显微镜下观察会分别见到胞核和胞浆。因此通过双标记所述细胞，可方便监测细胞周期中的事件，并且也可评估多种物质对细胞周期的作用。可在显微镜下直接观察培养物中的所述细胞，或可在完整的动物，甚至是活体动物中观察所述细胞。
发射的光的“颜色”指发射的光所在的波长。胞核和胞浆必须发射波长不同且可被分别测定的光，因此这些光被称为“不同颜色”。颜色的差异不是必须要通过肉眼分辨；尽管优选存在这种水平的波长差异，但也可以通过使用有不同波长敏感性的滤波器(filter)和/或检波器(detector)，辅助以合适的软件，来观察甚至是微小的波长差异。因此，例如，通过使用宽视野显微镜(widefield microscope)，如美国专利6,444,992所述的那些(其引入本文作为参考)，也可使用紧邻的不同波长。
然而，优选通过使用颜色差异可用肉眼分辨的荧光蛋白来使观察简单化。如果通过视觉足够分辨波长差异也会使机器操作简单化。
因为所述细胞被稳定转化来产生两种荧光蛋白，所以可在细胞活着并经过细胞周期的多个阶段时观察所述蛋白。可观察在培养物中的或存在于活生物体的所述细胞。例如，美国专利6,251,384，6,235,968和6,235,967描述了使用被绿色荧光蛋白稳定转化的细胞来对活体动物作全身实时观察，其引入本文作为参考。为在整个生物体使用，优选高荧光的蛋白；因此进行全身观察时，仅仅是荧光微弱的蛋白如萤光素酶是不实用的。
当然，如果将外源细胞植入实验动物，这些动物必须完全无免疫应答(sufficiently immunocompromised)从而不会排斥所述细胞。使多种动物无免疫应答的技术本领域公知；已经无免疫应答的方便的受试者包括裸鼠或SCID小鼠，以及类似修饰的其它啮齿类动物如大鼠。
所述荧光蛋白可以是任何那些本领域通常可得的荧光蛋白，如背景部分上述的荧光蛋白。对原始分离的A.victoria绿色荧光蛋白所作的多重修饰已经使得蛋白带有多种颜色，并且使蛋白在很宽范围的细胞种类中容易地表达。发射多种波长的荧光蛋白的选择很多并且是已知的。
任何修饰被研究的细胞以包含表达系统的方法都是合适的。转化方法依赖于细胞性质并包括但不限于，例如，脂质转染，电穿孔，和病毒感染。对于植物细胞，也可使用土壤杆菌介导的转化，以及原生质体的修饰。包含编码所述蛋白质的核苷酸序列的表达系统的控制序列的选择也可有所变化，并且选择合适的对照和载体也依赖于细胞的性质和修饰细胞的方式。
可以使用任何合适的胞核靶向信号；如下举例的是组蛋白H2B；然而，已知其它的靶向胞核的序列并且能用其来取而代之。
因此，要修饰的细胞被合适的载体转染，该载体包含用于每个所述荧光蛋白的表达系统，一个表达系统和唯一的一个荧光蛋白偶联到使那个蛋白靶向胞核的另外的氨基酸序列上。用于转化的载体对于最终到达胞浆的荧光蛋白和颜色不同的最终到达胞核的荧光蛋白可以是分别的载体，或者两套表达系统可以被包含在相同的表达载体中。可以先使用所述胞核靶向序列，然后通过转染来使所述细胞包含要标记胞浆的荧光蛋白的表达系统，优选在转染事件之间确保所述细胞系的稳定性从而保证稳定性。也可通过先使用胞浆的蛋白质的表达系统来颠倒转染的顺序。或者，两个表达载体可同时接触细胞，优选使用不同的选择性标记物来确保共转染。对两种蛋白质也可使用双顺反子表达系统。
为确保稳定修饰，包括将相关的表达系统整合到基因组的例子，使所述细胞经过选择压力。合适的选择性标记物会依赖细胞的性质；G418或潮霉素抗性对很多细胞是方便的标记物；其它可选的选择方法包括对于基于DHFR的系统的毒素的使用，如氨甲喋呤。那些本领域一般技术人员会理解要使用的选择种类。
因此，一方面，用逆转录病毒载体感染合适的细胞，该载体包括表达系统，其中编码发射蓝光的荧光蛋白的核苷酸序列与编码胞核靶向信号的氨基酸序列融合。所述病毒载体还包括作为选择性标记物的潮霉素抗性。然后使所处理的细胞在潮霉素存在时接受选择压力，在几轮选择后获得稳定的转化子。然后用电穿孔用DNA处理所述稳定转化的细胞，其中所述载体包含与DHFR偶联的发射绿色荧光的蛋白质。然后用潮霉素和氨甲喋呤使所述细胞接受几轮选择来获得细胞系，其中其胞核被染为蓝色并且胞浆为绿色。
用本发明方法获得的不同染色是可用的，因为细胞周期的各个部分使得胞核和胞浆发射的射线分布和/或强度不同。因此，例如，强度的比率可确定细胞周期的位置。另外，出现凋亡时胞核的形态被改变，这容易被检测到。通过观察这些物质对细胞周期或形态的作用可检测多种物质的作用，包括多种小分子药物，蛋白质，反义(antisense)或形成三倍体(triplex)的核酸或抑制物RNA。多种物质对胞浆或胞核的不同靶向也可用本发明方法的观察。所述细胞能被评估的性质包括休眠，凋亡，细胞周期阶段，物质靶向的位置，和技术人员熟悉的多种其它性质。理想的话，用于处理细胞的物质自身可被标记。
因此，如果要通过显微镜观察培养物中的所述细胞，可将所述物质直接加到培养物中。如果要在活的动物或植物中观察所述细胞，通常将所述药物直接给予该动物或植物。
一项实施方案中，用只在胞核表达的组蛋白H2B-GFP和DsRed-2双标记癌细胞，其中DsRed-2被只在胞浆表达的逆转录病毒载体引入。这样，通过绿色荧光与红色荧光的比率可确定胞核-胞浆的比率。此测量能确定处于细胞周期的增殖状态的细胞的相对数量。通过较高的胞核/胞浆比率或较高的绿色与红色荧光的比率来确定S和G2期，因为在细胞倍增过程中核中的DNA合成比非增殖细胞高。将所述双色细胞接种到96-孔培养皿中，并且在不同时间确定红色和绿色荧光的强度和比率。通过此比率，可确定在细胞周期中的状态。
就增殖观察自身而言，所述测定可适合检测用多种化合物处理这些细胞的结果。此应用中，将对照细胞接种在一组孔中，将检测物质接种在其它组的孔中。之后将板置入能测量双波长的荧光读板机中，来测量绿色和红色荧光的相对增长及其比率。这能确定相对增殖率和在细胞周期的位置以及药物在这些过程中的作用。
本方法也可通过使用每孔最少数量的细胞来确定所述细胞所来自的任何组织的异质性。
如下实施例是为了阐述但不是为了限制本发明。所有情况下的图像均用Hamamatsu C5810 3CCD相机(Hamamatsu Photonics，Bridgewater，NJ)直接拍摄。为宏观成像(macro-imaging)，使用了荧光灯箱(fluorescence light box)(Lightools Research，Encinitas，CA)。为显微成像(micro-imaging)，与CCD相机一起使用了Leica荧光立体显微镜(fluorescence stereo microscope)(型号LZ12)。此显微镜装配有GFP滤波器组(set)和电源功率50W的汞灯。用对比和亮度处理图像并用软件Image ProPlus 3.1分析。在IBM PC 40)上直接捕捉到1024×724像素高分辨率的图像。
制备方案一制备RFP逆转录病毒为生产RFP逆转录病毒22)，将pDsRed2的HindIII/NotI片段(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)，其含有全长的红色荧光蛋白cDNA，插入带有新霉素抗性基因的pLNCX2的HindIII/NotI位点(Clontech)来建立pLNCX2-DsRed2质粒。源自NIH3T3的表达10 A1病毒包膜的包装(packaging)细胞系PT67，购自CLONTECH Laboratories，Inc。在补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-products，Calabasas，CA)的DME培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)中培养PT67细胞。为生产载体，使70％汇合度(confluence)的PT67细胞与LipofectAMINETM试剂(Life Technologies，Grand Island，NY)与饱和量的pLNCX2-DsRed2质粒的沉淀混合物温育18小时。在这个时间补充新鲜的培养基。在转染后48小时用荧光显微镜检查所述细胞。为选择产生大量RFP逆转录病毒载体(PT67-DsRed2)的克隆，在存在200-1,000μg/ml的G418(Life Technologies)时培养所述细胞7天。有时，药物选择15天后在荧光显微镜下检查存活的克隆并且分离出GFP或RFP阳性的集落。选择数个克隆，并在用3T3细胞作病毒滴定实验后扩增为细胞系。
制备方案二生产组蛋白H2B-GFP载体为生产组蛋白H2B-GFP逆转录病毒，Geoff Wahl教授(Salk Institute)友情提供了组蛋白H2B基因。此基因无终止密码子，从而使所述H2B基因连接到维多利亚多管水母EGFP基因的5′编码区(Clontech)24)。然后将此组蛋白H2B-GFP融合基因插入到有潮霉素抗性基因的pLHCX(Clontech)的HindIII/CalI位点。为建立产生大量组蛋白H2B-GFP逆转录病毒载体的克隆，用对PT67-DsRed2相同的方法，用所述pLHCX组蛋白H2B-GFP质粒转染PT67细胞。在存在200-400μg/ml的潮霉素(Life Technologies)时培养所述转染的细胞15天，最终建立PT67-组蛋白H2B-GFP细胞。有时，药物选择15天后，在荧光显微镜下检查存活的集落，并且选择GFP或RFP阳性的集落。选择数个克隆，并在用3T3细胞作病毒滴定实验后扩增为细胞系。
实施例1在胞核表达组蛋白H2B-GFP并在胞浆表达pLNC DsRed的人前列腺癌细胞分离双色PC-3细胞，该细胞因为GFP与组蛋白H2B(21)融合只在胞核表达GFP并且只在胞浆表达RFP。这些细胞表现出容易使活的前列腺癌细胞双色成像。
步骤一制备表达DsRed的细胞用由PT67包装细胞产生的pLNC DsRed-2转化PC-3细胞。在荧光显微镜下监测在PC-3细胞中的DsRed-s表达。通过增加G418量来进行选择。
步骤二制备双标记的H2B GFP和DsRed-2细胞使用LipofectAMINE PlusTM用pLHC H2B-GFP DNA转染DsRed-2 PC-3细胞。温育24小时后，通过增加潮霉素和G418的量来选择表达H2B GFP和DsRed-2的细胞。
用绿色胞核比红色胞浆的面积比率来分析活细胞的细胞周期位置。用活细胞中的核形态来确定凋亡。
实施例2纤维肉瘤细胞的RFP和组蛋白H2B-GFP基因转导对于RFP和组蛋白H2B-GFP基因转导，从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville，ML)购买源自人纤维肉瘤的HT-1080细胞，其汇合度为70％。为建立双色细胞，首先建立在胞浆中表达RFP(HT-1080-RFP)的HT-1080克隆。简言之，将HT-1080细胞与以1∶1沉淀的PT67-RFP细胞逆转录病毒上清和包含10％的胎牛血清的RPMI1640(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的混合物温育72小时。此时补充新鲜培养基。转导后72小时用胰蛋白酶/EDTA收获细胞，并以1∶15的比率亚培养到包含200μg/ml的G418的选择性培养基中。G418的水平逐渐增加到800μg/ml。用常规培养方法，用克隆圆筒(cloning cylinder)(Bel-Art Products，Pequannock，NJ)通过胰蛋白酶/EDTA分离HT-1080-RFP并扩增。
两个克隆的亚系(HT-1080-双-1和HT-1080-双-6)在胞核稳定表达GFP并在胞浆表达RFP。获得另外的只包含RFP或GFP的克隆作为对照(HT-1080-RFP，HT-1080-GFP)。
实施例3亲代HT-1080-RFP和HT-1080-双克隆的细胞增殖率将每个荧光标记的HT-1080克隆(HT-1080-RFP，HT-1080-双-1或HT-1080-双-6)和亲代克隆(HT-1080)以密度1×103细胞/培养皿接种在100mm培养皿中，其中有含有10％FBS培养基的RPMI(第一天)。将所述培养皿保持在37℃和5％CO2的培养箱。之后隔天(第2-7天)用每个克隆三个培养皿来做细胞计数。简言之，胰蛋白酶化后所收集的重悬细胞用台盼蓝(Sigma)染色。之后用血细胞计数器(Reichert Scientific InstrμMents，Buffalo，NY)仅计数活的细胞。
图1显示所选择的HT-1080-双色细胞有明亮的体外GFP和RFP荧光。绿色荧光正位于胞核中。表达GFP和RFP的群体中所有细胞表现出所述转基因的稳定性。图2显示在单层培养物确定的亲代HT-1080，HT-1080-RFP，HT-1080-双-1或HT-1080-双-6克隆的增殖率无区别。
在150mm培养皿中用含有10％FBS的RPMI 1640培养基培养所述HT-1080-双-1细胞。每5-30分钟，将所述培养皿置于荧光立体显微镜下，并从相同的活细胞捕捉时程图像。
图3A显示HT-1080双-1在有丝分裂时以5分钟间隔的时程系列图像。图3B显示以30分钟间隔的有丝分裂细胞，其中即使所述有丝分裂细胞在一个大集群中的位置改变，它们也容易被跟踪。
实施例4体外实时观察凋亡过程为捕捉凋亡过程的实时图像，使用HT-1080-双-6克隆。用溶解在DMSO中的贮存在-80℃的星形孢菌素(Alexis，San Diego，CA)来诱导凋亡。将3×105的细胞接种到25cm2的培养瓶，培养瓶中有含有10％FBS的RPMI 1640。在第二天以浓度2μM加入星形孢菌素。每2小时，将所述培养瓶置于荧光立体显微镜下并在每个时间点捕捉实时图像。
用2μM的星形孢菌素诱导HT-1080-双-6细胞的凋亡。(图4A和4B)。每两个小时可以观察到渐进性核碎片。
实施例5体内实时观察双-标记的细胞根据美国国立卫生院实验室动物照料与使用守则(National Institutes ofHealth Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)所列的原则和方法进行所有动物研究(保险号A3873-1)。将动物保持在HEPA滤过的屏障设备(barrier facility)中。用高压灭菌的啮齿类动物饮食(Tecldand LM-485，WesternResearch Products，Orange，CA)喂养小鼠。
为将细胞注射到颈总动脉，通过皮下注射氯胺酮(ketamine)混合物(盐酸氯胺酮10μl，甲苯噻嗪(xylazine)7.6μl，马来酸乙酰丙嗪(acepromazinemaleate)2.4μl，水10μl)麻醉裸鼠。首先，在颈上作皮肤纵向切口。检测到下颌下腺后在中部切开，然后处理各边。用钝器分开右胸骨舌骨肌和右胸锁乳突肌和结缔组织。在检测到右颈总动脉后，轻柔地将该动脉与周围的结缔组织分开。用平头的钩(Fine ScienceTools，Inc.，Foster City，CA)向动脉的近端轻微牵拉。将总共200μl的含有2×105个HT-1080-双-1细胞的培养基用33G的针(Fine Science Tools)注射到动脉中。注射后立即用拭子按住注射部位一段时间来避免流血或注射的肿瘤细胞渗漏。确认止血后，用6-0缝线密闭皮肤。所有上述手术步骤在7×解剖显微镜(MZ6，Leica，Deerfield，IL)下进行。
颈总动脉注射HT-1080-双-1后，在脑的微动脉中，甚至通过头皮瓣(scalpflap)经颅骨都能观察到栓子细胞(图5A和5B)。所述小鼠的颅骨相对透明。观察到所述肿瘤细胞象白细胞一样伸长来适应微血管。在血管中见到的肿瘤细胞中，肿瘤细胞的胞核会伸得很长。
实施例6体内观察肿瘤细胞的胞核-胞浆动力学为体内观察肿瘤细胞的胞核胞浆动力学，用氯胺酮混合物麻醉小鼠。在蓝光下用荧光立体显微镜直接观察耳表面。
为观察在肺转移中的胞核胞浆动力学，将1×106的HT-1080-双-1细胞以体积300μl注射到六只裸鼠的尾静脉。在多个时间点处死小鼠并取出肺。直接在蓝光下观察肺中转移的集落。为作组织学分析，将切除的肺包埋在组织冷冻培养基(Triangle Biomedical Sciences，Durham NC)中并贮存在-80℃。用冷冻切片机LEICA型号CM-1850以厚度4μm制备冰冻切片。在带有GFP滤光片组的荧光立体显微镜下直接观察所制备的切片。
观察在切出的肺上的微转移(micrometastases)，发现每个胞核都彼此紧靠(数据未显示)。看来是细胞呈变形状以使胞核相互接触。
此研究开发了体内和体外在细胞水平实时观察细胞胞核-胞浆动力学，包括凋亡过程的可能性。向活体小鼠的鼠耳朵注射后容易观察到有丝分裂细胞。在尾静脉注射后，在切除的肺观察到双色微转移。
实施例7全身荧光光学成像可在注射了HT-1080-双-1(图6A和6B)后12小时捕捉到在活体小鼠的有丝分裂细胞的实时图像。所显示的细胞似乎外渗(extravasated)并呈圆形，类似培养物中的正分裂的细胞。无需固定或染色，在活体动物可以观察到所述细胞每个胞核的状况和所述细胞边界。
实施例8制备双色的人前列腺癌细胞系在补充有10％FCS的RPMI1640培养基中生长PC-3细胞。在存在8μgml-1Polybrene时，将指数生长的细胞(在10cm培养皿中)与来自PT67/pLHCXH2B-EGFP的病毒上清温育。过夜温育后，换培养基，扩增所感染的细胞用于作逐步的潮霉素选择。药物选择15天后，在荧光显微镜下观察存活的集落并且分离GFP阳性集落。选择单一、高水平表达H2B-EGFP的克隆。
之后，在存在8μg/ml Polybrene时，将指数生长的表达H2B-EGFP的细胞与来自PT67/pLNCX DsRed-2的包含病毒的上清温育。过夜温育后，换培养基，48小时感染后，扩增所感染的细胞作逐步的G418选择。药物选择15天后，在荧光显微镜下观察存活的集落并且分离RFP阳性集落。选择单一、高水平表达H2B-EGFP和RFP(PC3-双)的克隆。
为确定生长率，在60mm培养培养皿(Petri dish)培养1×105个细胞，并每天计数共一星期。一式三份确定指定时间的每孔的活细胞数，不包括台盼蓝染色的死细胞。
在无潮霉素B和G418选择培养时，此细胞系中稳定高表达H2B-EGFP和胞浆RFP超过三个月。所述双色细胞的体外增殖速度与其亲代细胞PC-3相同。这些结果表明双色PC-3可以是体内和体外研究的有用模型。
实施例9观察细胞周期和凋亡通过在活细胞观察到的“胞核胞浆”比率可容易地发现所述双色细胞在它们的细胞周期中的位置。为用荧光显微镜观察这些细胞，使用装备了电源50W的汞灯的Leica荧光立体显微镜(型号LZ12)。为同时观察GFP和RFP荧光，通过D425/60带通滤波器(band pass filter)，470 DCXR分色镜(dichroicmirror)来进行激发，并通过长通滤波器(long pass filter)GG475(ChromaTechnology，Brattleboro，VT)收集发射的荧光。
图7A-7D表示细胞周期的期；图7E表示凋亡。
胞核相对胞浆大可容易地鉴定G2期细胞，与此相比，G1期细胞的胞核-胞浆比率小很多。S期细胞的胞核胞浆比率比G1大但比G2小。通过染色体浓缩鉴定出将进入有丝分裂的分裂前期细胞。容易观察到有赤道板(metaphase plate)条形标识状排列(line up)的细胞，并且可以观察到它们进入分裂后期。通过异常的胞核形态包括断裂可以鉴定凋亡细胞。
因此，可以实时跟踪个体细胞的连续的细胞周期进展，并以频繁的间隔拍摄显微照片。
实施例10实时观察药物诱导的凋亡用TaxolTM(0.8μg/ml)；胸腺嘧啶(2mM)，和长春花碱(60nM)处理PC-3双细胞。在0，12，24，36，和48小时实时成像。收集细胞来提取DNA并做琼脂糖凝胶电泳(1.8％)分析。Paclitaxel(TaxolTM)(0.8μg/ml)对胞核有很特异的作用，使它们明显形成环形结构，因为染色质附着到了核膜上。图8表明这种结构通过GFP标记的胞核对比RFP标记的胞浆背景是容易可见的。截止到24小时所述胞核的环形结构是存活的。截止到48小时，可见所述进入凋亡的细胞带有很异常的核结构和断裂。
图9显示在开始处理后24小时观察到的TaxolTM诱导的环结构是在DNA断裂出现之前，并且可通过凝胶电泳观察到。截止到48小时，当所述细胞进入凋亡时，可观察到DNA断裂。
其它的微管蛋白物质，长春花碱(60nM)与TaxolTM相比对细胞核的作用不同，其中如图10示所述胞核变得更浓缩并且胞浆呈现扩张。
实施例11体内观察根据美国国立卫生院实验室动物照料与使用守则所列的原则和方法进行所有的动物研究(保险号A3873-1)。将5-6周龄间的雄裸鼠(NCr-nu)保持在HEPA滤过的饲料架子(rack)上的屏蔽装置中。将所述双色PC-3人前列腺癌细胞(2×106)注射到裸鼠足垫。20天后对小鼠实施安乐死。肿瘤和淋巴结和肺都经过处理用于荧光显微镜检查。
图11显示荧光显微镜下在淋巴结中观察到的有丝分裂的双色PC-3细胞。
权利要求
1.制备活细胞的方法，其中所述细胞包含位于细胞核的第一种荧光蛋白和位于胞浆的第二种荧光蛋白，其中所述第一种和第二种荧光蛋白发射出不同波长的光，该方法包括修饰活细胞从而使其包含(a)表达所述第一种荧光蛋白的第一种表达系统，其中所述第一种荧光蛋白与氨基酸序列融合，该氨基酸序列使该融合蛋白靶向胞核，和表达所述第二种荧光蛋白的第二种表达系统，其缺少靶向胞核的序列；或(b)既表达所述第一种荧光蛋白又表达所述第二种荧光蛋白的表达系统；并且从所述被修饰的细胞中选择出已经被稳定修饰的细胞。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞首先用所述第一种表达系统来修饰然后用所述第二种表达系统来修饰，或反之。
3.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞用两种表达系统同时修饰。
4.权利要求1的方法，其中所述选择是通过在抗生素或毒素存在时培养。
5.被稳定修饰的活细胞，其产生与靶向胞核的氨基酸序列融合的第一种荧光蛋白和缺少靶向胞核的氨基酸序列的第二种荧光蛋白；其中所述第一种和第二种荧光蛋白发射出波长不同的可见光。
6.被修饰的活细胞，其包含位于胞核的第一种荧光蛋白和位于胞浆的第二种荧光蛋白，其中所述第一种荧光蛋白和第二种荧光蛋白颜色不同。
7.权利要求6的细胞，其中所述第一种荧光蛋白是绿色的并且所述第二种荧光蛋白是红色的。
8.权利要求5的细胞，其中所述靶向细胞核的氨基酸序列是组蛋白H2B。
9.确定活细胞的细胞周期位置的方法，该方法包括评估权利要求6的细胞的胞核面积与胞浆面积的比例。
10.权利要求9的方法，其中所述评估以时间为函数进行。
11.权利要求9的方法，其中所述细胞在活体动物内被观察。
12.确定物质对细胞的作用的方法，该方法包括用所述物质处理权利要求6的细胞的第一个样本，并观察所述处理对于从所述细胞发射的射线的分布和/或强度的作用。
13.权利要求12的方法，其还包括观察从未用所述物质处理的细胞所发射的射线的分布和/或强度，并且比较对第一种样本和第二种样本所作的观察。
14.权利要求12的方法，其中所述分布和/或强度是休眠的特征。
15.权利要求12的方法，其中所述分布和/或强度是细胞凋亡的特征。
16.权利要求12的方法，其中所述分布和/或强度是细胞周期的阶段的特征。
17.确定物质的靶向位置的方法，该方法包括用所述物质处理权利要求6的细胞，并且观察从所述细胞发射的射线的分布和/或强度。
18.权利要求17的方法，其中所述物质自身被标记，并且所述方法还包括直接观察所述标记的位置。
19.确定细胞培养物的增殖率的方法，该方法包括培养已被修饰从而包含荧光蛋白的细胞；并且以时间为函数测量所述细胞发射的荧光，从而确定所述细胞的增殖率。
20.权利要求19的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
21.权利要求19的方法，其中所述培养物是从单个细胞生长的。
22.确定待测化合物对细胞增殖的作用的方法，该方法包括在所述化合物存在和缺无时培养细胞，其中所述细胞已经被修饰从而包含荧光蛋白；在所述化合物存在和缺无时以时间为函数测定荧光强度从而确定所述化合物存在和缺无时的增殖率；并比较所述化合物存在和缺无时的增殖率；其中所述化合物存在与缺无时增殖率的改变鉴定所述化合物为细胞增殖的调节物。
23.权利要求22的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
24.权利要求22的方法，其中所述培养从单个细胞开始。
25.确定肿瘤异质性的方法，所述方法包括从该肿瘤包含的单一细胞或单一细胞组培养多个集落；并确定所述细胞培养物的增殖率；表现出不同增殖率的培养物表明此肿瘤的异质性。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞已经被修饰从而包含荧光蛋白并且通过以时间为函数测量发射的荧光强度来确定增殖率。
27.权利要求25的方法，其中所述细胞已经被修饰从而包含位于胞核的第一种荧光蛋白和位于胞浆的第二种荧光蛋白，其中所述第一种荧光蛋白和第二种荧光蛋白颜色不同。
全文摘要
可稳定修饰活细胞来使细胞浆和细胞核发射不同的颜色，从而可通过视觉或仪器辅助来观察分析所述细胞的状态及物质对所述细胞的作用。如果需要，可实时进行这些观察。另外，通过使用被修饰来表达单一荧光蛋白的细胞并以时间为函数观察荧光强度可体外实时确定增殖率和药物的敏感性。
文档编号C12Q1/68GK1688717SQ03823937
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月18日 优先权日2002年8月16日
发明者姜平, 徐明旭, 杨萌 申请人:抗癌公司