专利名称：金属螯合物在人或动物进食中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二价金属Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe与蛋氨酸羟基类似物的已知螯合物在人和动物营养(单胃动物和多胃动物)中的用途。本发明进一步涉及制备固体形式的蛋氨酸羟基类似物与铁(II)、钒(IV)和(V)及钼(V)和(VI)的新型螯合物，以及液体水溶液形式的与铁(II)和(III)及铬(III)的新型螯合物的方法。最后，本发明涉及所述固体形式的铁(II)、钒(IV)和(V)及钼(V)和(VI)的新型螯合物，以及液体水溶液形式的铁(II)和(III)及铬(III)的新型螯合物在人和动物营养中的用途。
已知的是，金属螯合物是由有机分子(比如氨基酸或肽链或α-酮酸或α-羟基酸)和金属离子通过强配位键形成的化合物。一些已知的金属螯合物用于人体营养品的领域。它们的用途归因于由所涉及的金属元素发挥的生物学作用，在几种酶反应中作为活化剂，以及在所有生物机体的各种代谢功能中作为调节剂。螯合分子的存在促进了金属元素的吸收、利用和功用，因为后者在生物体的所有区域由有机组分所携带。这也导致了未用的金属在排泄物中的损失大大减少，因此导致了显著的经济节约和环境优点。
表征高生物利用率金属螯合物的一般特征是(a)配合物的中性(金属的正电荷被配体的负电荷所平衡)；(b)不存在负抗衡离子(氯根，硫酸根)；(c)配合物的低分子量(＜1,500道尔顿)；(d)明确的金属/螯合剂(双齿)比率，可以≤1∶2。
而且，金属螯合物应该通过由可以容易找到的原料开始经由简单而清洁的方法高收率地获得。这些特征可以利用适合的配体实现，后者应该容易去质子和在进行螯合的这种位置上具有至少两个给体原子。配体的实例是适当官能化的氨基酸和其它有机酸。
就铁而言，它的螯合形式的给药对于贫血是特别有效的。贫血是由于红细胞的数目的减少、血红蛋白的量的降低或这二者缺乏所导致的血液的病理状态。铁是血红蛋白的基础，因为它是其中氧固定于血红素的中心。需要较大量的铁的人群是有月经或怀孕的女性、两岁以下的小孩、素食者、患有痔疮的人、患有溃疡的人以及最后献血者。贫血者所感觉的症状是疲倦、对寒冷的较高敏感性、急躁、注意力不集中和心悸。
此外，铁可以防止病毒或细菌感染，因为它促进了免疫系统的兴奋。另外，铁促进了属于B族的维生素的新陈代谢。已知的是，这些维生素的缺乏可以导致疾病比如皮炎或甚至更严重的疾病如糙皮病(由于维生素B3的缺乏)。铁干预肾上腺素和去甲肾上腺素的合成过程。最后，铁的缺乏导致了伤口的愈合缓慢。
本发明的第一个目的是提出用于在人体营养品中给药的同化作用剂(integrator)。所述同化作用剂也给药于患有金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe缺乏的病人。
本发明的第二个目的是提出用于给药于单胃或多胃动物的农业畜牧技术营养品的同化作用剂。所述同化作用剂还给药于需要给予金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe的单胃或多胃动物，并具有高生物利用率。
本发明的第三个目的是提出制备固体形式的蛋氨酸羟基类似物或它们的盐之一与铁(II)、钒(IV)和/或钒(V)和钼(V)和/或钼(VI)的金属螯合物，和液体水溶液形式的与铁(II)和(III)及铬(III)的金属螯合物的方法，其中所述金属以强配位键键接于双官能有机配体，以便形成稳定的金属螯合物。
本发明的另一个目的是提出所述固体形式的铁(II)、钒(IV)和/或钒(V)及钼(V)和/或(VI)的新型螯合物，以及液体水溶液形式的铁(II)和(III)及铬(III)的新型螯合物用于制备人和动物营养品的金属同化作用剂的用途。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二个目的通过提出具有通式(I)的金属螯合物[2∶1]的用途来实现(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2M·nH2O (I)
其中该双官能螯合剂是2-羟基-4-甲基硫代丁酸，α-羟基酸，称为“蛋氨酸羟基类似物”(MHA)；M是选自Co，Ca，Mg，Zn，Fe，Cu和Mn的二价金属阳离子，以及n是水分子的数目，该螯合物用作制备治疗患有金属少量元素缺乏的病人或用于在农畜牧业技术领域中给药于单胃或多胃动物的金属同化作用剂。在通式(I)中，具有0-12个水分子，优选0-6个水分子，例如，0-4个水分子。2-羟基-4-甲基硫代丁酸与铁离子形成了具有明确化学计量的螯合物，含有2分子的螯合剂/铁原子，按照它与二价金属Mg，Ca，Mn，Co，Cu和Zn形成螯合物的相同方式。
用于制备具有通式(I)的金属螯合物的方法描述在国际专利申请PCT/IT99/00225中，包括MHA与二价金属Mg，Ca，Mn，Co，Cu和Zn的相应碳酸盐的直接反应。
在根据本发明的一个实施方案中，申请人已经改进了制备具有通式(I)的金属螯合物的方法，该方法设想MHA和金属(II)氧化物比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe的氧化物直接反应。
在该新型实施方案中，使用金属(II)的氧化物代替如在申请PCT/IT99/00225中所述的碳酸盐，工艺和操作条件与在申请PCT/IT99/00225中提到的那些相比没有改变，因此所述操作条件被认为在本申请中包含。
有利的是，使用以下物质氧化镁与碳酸镁的混合物，或者氧化镁完全替代碳酸镁，氧化锌与碳酸锌，或者氧化锌完全代替碳酸锌，以及氧化钙与碳酸钙的混合物，或者氧化钙完全代替碳酸钙。
申请人发现，以下金属螯合物用于人体营养品是有利的-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Zn·2H2O该两个水分子不键接于该金属。
-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Cu它是没有水分子键接于金属的无水配合物。
-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Co·2H2O该两个水分子被络合。
-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mn·2H2O该两个水分子被络合。
-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Ca·2H2O该两个水分子不键接于该金属。
-(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mg·2H2O该两个水分子不键接于该金属。
在本发明的另一个实施方案中，所述第三个目的通过提出制备固体形式的蛋氨酸羟基类似物或它的盐之一与铁(II)、钒(IV)和/或钒(V)和钼(V)和/或钼(VI)的金属螯合物，和液体水溶液形式的与铁(II)和(III)及铬(III)的金属螯合物的方法来实现。
在钒和钼的情况下，制备它们的螯合物的方法包括它们的相应氧化物与蛋氨酸羟基类似物的反应。
另外，在钒和钼的情况下，制备它们的螯合物的方法包括它们相应的金属盐与蛋氨酸羟基类似物的反应。
例如，一定量的固体V2O5或MoO3与蛋氨酸羟基类似物的溶液在高温和搅拌下一起添加。由该反应获得了钒或钼的螯合物的透明溶液和固体沉淀。在优选的实施方案中，申请人将氧化钒V2O5和蛋氨酸羟基类似物布置在容器内。氧化钒和蛋氨酸羟基类似物以1∶2到1∶8，优选1∶4到1∶6(钒/MHA)的摩尔比存在。
该容器装有搅拌装置、加热装置和反应回流用装置。该反应在机械搅拌和回流下进行20-60分钟，优选30分钟的时间。在反应的末尾，获得了深绿色溶液，在冷却之后由该溶液获得了固体绿色沉淀。从沉淀物的化学和物理分析申请人证实了它是具有化学式VOL2的钒(IV)配合物，其中L＝去质子蛋氨酸羟基类似物。
在反应过程中，氧化钒(V)被还原为钒(IV)。
在铁(II)的情况下，该制备方法通过MHA的钠盐(或碱金属或碱土金属盐)与硫酸亚铁(或任何其它可溶性铁(II)盐)在水环境中的反应来进行。
为了使反应达到完全，MHA/铁(II)的摩尔比是2∶1。亚铁螯合物从反应环境中沉淀下来，过滤并用水洗涤，以便清除所形成的可溶性硫酸钠。
在过滤和洗涤之后，然后干燥螯合产物，以便减少吸附水的量。该产物是具有以下化学式的低水溶性的浅黄色粉末(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Fe·2H2O水分子直接键接于铁(TGA数据)。
红外线振动光谱显示了所发生的螯合事实上，该光谱具有按照以上结构式的系列特征谱带。
尤其，在1,596cm-1可以发现归因于羧酸基团的非对称展缩的谱带，如对于去质子化和配位所预计的那样，相对于游离MHA(1,720cm-1)，它显著地移向低频。这样获得了纯而稳定的产物。
在本发明的一个实施方案中，可以通过以≥2，优选3的MHA/M(III)比率将铁或铬(III)的可溶性盐和MHA溶解在水环境中，保持pH在适当的值，以防止相应氢氧化物沉淀来获得铁(II)和铬(III)与MHA的螯合物的稳定溶液。
在一个优选的实施方案中，申请人已经改进了铬(III)的稳定溶液的制备方法，其中铬盐，例如硫酸铬Cr2(SO4)3与蛋氨酸羟基类似物MHA在搅拌下反应，例如通过加热20-120分钟，优选30-60分钟的时间。铬盐和蛋氨酸羟基类似物以1∶2到1∶30，优选1∶2到1∶20的摩尔比存在。在反应的末尾，获得了铬(III)与蛋氨酸羟基类似物的配合物的溶液。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述第四个目的通过提出固体形式的铁(II)、钒(IV)和/或钒(V)及钼(V)和/或钼(VI)，以及液体水溶液形式的铁(II)和(III)及铬(III)的所述新型螯合物用于制备人和动物营养品的金属同化作用剂的用途。
在本发明中所述的金属螯合物可以以各种用量比相互混合用于制备金属同化作用剂。
因此，提出用于人和动物营养品的同化作用剂可以含有根据本发明的一种或多种金属螯合物。
申请人对上述和根据本发明的金属螯合物进行了系列实验。
体外试验对于体外试验，使用人结肠腺癌细胞(CACO-2)，它们是最常用于研究肠功能的体外体系，尤其对于跨上皮运输，因为所述细胞(CACO-2)形成了类似于小肠的超微结构、功能和电性能。
细胞间连接的形成可以通过测定单层细胞的跨上皮电阻(TEER)来监控。因为细胞间连接限制了溶质的(穿细胞)移动，所以TEER改变通常用作所述连接的渗透性指数。
在
图1中示出了用于细胞生长和分化的设备。
图1中用A表示的所述细胞在图1中用B表示的载体(可渗透滤器)上生长和分化，直到形成由功能细胞间连接所结合单层分化细胞为止。所述滤器B分开了顶端环境C(AP)(模拟肠腔)与模拟毛细血管血液流动的位于下室的基底侧环境D(BL)。
所述细胞用两种不同浓度的Fe(III)/MHA(1∶3)和Fe(III)/NTA(1∶2)(次氮基三乙酸作为参考螯合物)在缓冲溶液中在pH5.5和37℃下处理3小时。将所述溶液放入顶端隔室C(AP)中，而基底侧隔室(D)(BL)含有位于pH7.4的缓冲溶液中的去铁铁传递蛋白的无铁溶液。在所述实验过程中，在预定时间间隔下，测定TEER(Ω·cm2)，结果表示在图2(在3小时的过程中每30分钟一次)和图3(在24小时之后)中。
这些结果在图4中示出，表示了在用不同浓度的Fe(III)/MHA和Fe(III)/NTA处理3小时之后的细胞内铁的含量。数据以nmol铁/滤器来表示。
从图4可以推断出，铁/MHA螯合物从顶端环境C通过细胞的量高于在对照物中观察到的该量。
而且，从图5(表示了在用两种不同浓度的Fe(III)/MHA和Fe(III)/NTA处理之后的从顶端环境C到基底侧环境D的铁运输)可以推断出，运输的铁的浓度是可比的。数据以nmol铁/滤器来表示。
在图4和5中所示的数据证明，铁螯合物强烈地被肠微绒毛所吸收并在血流内移动。
从图2(示出了TEER测量值)可以推断出，细胞间连接没有改变，因此证明了铁螯合物对细胞无毒，与在非螯合铁比如硫酸亚铁的情况下所发生的情况相反。
图3显示了在除去含有铁/MHA或铁/NTA的pH5.5的缓冲溶液，保持细胞在培养基中之后24小时的TEER的测量值。所述图3显示了铁/MHA螯合物在细胞内稳定，没有引起毒性效应。
最后，这些试验显示，根据本发明的MHA/M螯合物被有效吸收，在肠细胞内稳定，并且是无毒的。
以上所示结果为固体形式的铁(II)、钒(IV)和/或钒(V)及钼(V)和/或钼(VI)，以及液体水溶液形式的铁(II)和(III)及铬(III)的所述新型螯合物用于制备人和动物营养品的金属同化作用剂的用途提供了支持。
体内试验所述试验涉及单胃动物(比如猪)和多胃动物(比如小牛)。
a)单胃动物(猪)35日龄和在19日断奶的两个试验组的猪(对照组和试验组)给予仅仅锌源不同的食物。
所述食物含有每千克食物3,500千卡ED，1.15g赖氨酸，和总量81mg(81ppm)的锌元素，它的31mg(31ppm)由原料提供，而50mg(50ppm)分别以硫酸锌(对照物)和根据本发明的锌与MHA的螯合物(试验)的形式提供。
该两个组的动物通过巢、活重和性别来保持平衡，并喂养27天。另外4只动物立即处死，根据下列工序制备它们的样品。两个组的动物在试验开始之前和在27天之后称重。在试验结束时，杀死这些猪，从每一只猪取出胃、肠，左肾和肝。清空胃和肠，再次称重，以便获得所述器官的净重。取肾、肝和脑的样品，并冷冻。然后将胃、肠、左肾和肝与剩余的屠体(carcass)放在一起，用混合器均化。然后从这样获得的物质中取样，并冷冻。这些样品然后用脱水设备脱水，并进行化学分析。
通过原子吸收光谱对冷冻干燥的样品测定锌、铜和铁的水平。锌的全身水平和该产品有关。
根据在试验开始和结束时的躯体的“净”重(即，没有消化道的内容物)和它的锌含量，还可以测定每日锌保留量。在表1中示出了对这些样品进行的化学分析的结果。这些猪在16.2kg的平均重量时被处死。平均每日重量增加是324g。
从涉及两种不同来源的每日锌保留量的在表2中示出的数据可以推断出，由生物体保留的锌螯合物的同化作用比硫酸锌的同化作用高26％(P＝0.07)。表3显示了涉及锌源对肝、肾和脑中的锌、铜和铁的含量的影响和因此对与以无机形式存在于饮食中的所述元素的相互作用的影响。事实上，通过减少一种，吸收另一种而由所述自由离子施加的相互作用是已知的。
所述三种无机物在肝中的含量不受饮食的影响，因此不受锌源的影响。锌的平均值是296mg/kg，铜的值是6 3mg/kg和铁的值是220mg/kg。相反，肾显示了较高含量的锌(+18％，P＝0.07)，铁(+36％，P＜0.01)和铜(+36％，P＝0.12)，并且只有后一个值没有达到统计显著性的阈值，但它显示了所述金属元素的保留量的增加的倾向性。
在大脑中，具有较高含量的锌(+13％)、铜(+20％)、铁(+25％)的倾向性。所得结果指出，相对于无机来源比如硫酸盐，螯合形式的金属元素具有更高的生物利用率，并且与其它离子的相互作用减低，这导致了后者的更高保留。
众所周知，猪是最接近人的动物模型之一，因此它们常常用作人体领域的评价和研究的模型。
b)多胃动物(肉用牛)具有567kg(对照)和565kg(试验)的平均起始重量的各包括6只动物的两组雌性Charolaise小牛(30月龄)用相同的饮食喂养90天。唯一的区别是对照物给予碳酸锌和试验组给予根据本发明的锌螯合物。每日摄食22kg/动物，锌元素的总日供应量是700mg。
测定各动物的在试验开始和结束时的活重，屠体重和屠宰收率。数据在表4中示出。
相对于喂给碳酸锌的那些，喂给锌螯合物的动物具有明显更高的最终重量(652kg对642kg，p＜0.05)，明显更高的每日重量增加(1,039g对934g，p＜0.05)，明显更高的屠体重量(377kg对366kg，p＜0.01)，和明显更高的收率(57.83％对57.03％，p＜0.01)。数据在表4中示出。在表5中示出了由于锌螯合物以所速比率在给予动物的饮食中的存在带来的效果。
所述结果显示了相对于所述元素的无机来源的锌螯合物的上述畜牧技术性能的显著改进。各种Fe/MHA配合物的稳定常数用电位滴定法计算。铁(III)配合物的稳定性是非常高的，以及在酸性pH下也形成了螯合物质。未配位的Fe3+离子仅仅存在于非常低的pH值下(＜2.5)，而在较高的pH值下，所有铁(III)作为螯合物质金属/配体＝1∶2配合。
表1
表2
表3
表4
表权利要求
1.选自具有以下通式(I)的那些之中的至少一种金属螯合物的用途(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2M·nH2O(I)其中M是选自Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe中的二价金属阳离子，以及n是水分子的数目；用于制备在人体营养品中给药的同化作用剂。
2.根据权利要求1的用途，其中该同化作用剂给药于患有金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe缺乏的病人。
3.根据权利要求1的用途，其中所述至少一种金属螯合物选自以下组中(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Zn·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Cu；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Co·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mn·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Ca·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mg·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Fe·2H2O用于制备在人体营养品中给药的同化作用剂。
4.根据权利要求3的用途，其中该同化作用剂给药于患有金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe缺乏的病人。
5.选自具有以下通式(I)的那些之中的至少一种金属螯合物的用途(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2M·nH2O(I)其中M是选自Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe的二价金属阳离子，以及n是水分子的数目；用于制备给药于单胃或多胃动物的农畜牧业技术营养品的同化作用剂。
6.根据权利要求5的用途，其中该同化作用剂给药于患有金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe缺乏的单胃或多胃动物。
7.根据权利要求5的用途，其中所述至少一种金属螯合物选自以下组中(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Zn·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Cu；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Co·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mn·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Ca·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Mg·2H2O；(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Fe·2H2O用于制备给药于单胃或多胃动物的农畜牧业技术营养品的同化作用剂。
8.根据权利要求7的用途，其中该同化作用剂给药于患有金属少量元素比如Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe缺乏的单胃或多胃动物。
9.制备金属螯合物(CH3SCH2CH2CH(OH)COO)2Fe·2H2O的方法，包括其中让蛋氨酸羟基类似物的碱金属盐或碱土金属盐与可溶性铁(II)盐在水环境中反应的步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中该反应在蛋氨酸羟基类似物的钠盐和硫酸亚铁之间进行。
11.根据权利要求9或10的方法，其中过滤由该反应获得的铁(II)螯合物和用水洗涤。
12.制备金属钒螯合物的方法，包括其中让钒(V)氧化物或盐与蛋氨酸羟基类似物的溶液反应的步骤。
13.根据权利要求12的方法，其中钒氧化物是V2O5。
14.根据权利要求12或13的方法，其中反应在高温和搅拌下进行。
15.根据权利要求12-14任一项制备的金属钒螯合物用于制备在人体营养品中给药的同化作用剂的用途。
16.根据权利要求12-14任一项制备的金属钒螯合物用于制备给药于单胃或多胃动物的农畜牧业技术营养品的同化作用剂的用途。
17.制备金属钼螯合物的方法，包括其中让钼(VI)氧化物或盐与蛋氨酸羟基类似物的溶液反应的步骤。
18.根据权利要求17的方法，其中钼氧化物是MoO3。
19.根据权利要求17或18的方法，其中该反应在高温和搅拌下进行。
20.根据权利要求17-19任一项制备的金属钼螯合物用于制备在人体营养品中给药的同化作用剂的用途。
21.根据权利要求17-19任一项制备的金属钼螯合物用于制备给药于单胃或多胃动物的农业畜牧技术营养品的同化作用剂的用途。
22.铁(III)或铬(III)与MHA的配合物的稳定水溶液，其中MHA/M(III)的摩尔比≥2。
23.制备根据权利要求22的稳定水溶液的方法，包括其中让蛋氨酸羟基类似物MHA与可溶性铁(III)或铬(III)盐的水溶液反应的步骤。
24.根据权利要求22的铁(III)或铬(III)配合物的稳定溶液用于制备在人体营养品中给药的同化作用剂的用途。
25.根据权利要求22的铁(III)或铬(III)配合物的稳定溶液用于制备给药于单胃或多胃动物的农畜牧业技术营养品的同化作用剂的用途。
全文摘要
本发明涉及二价金属Mg，Ca，Mn，Co，Cu，Zn和Fe与蛋氨酸羟基类似物的已知螯合物在人和动物营养品(单胃动物和多胃动物)中的用途。本发明进一步涉及制备固体形式的蛋氨酸羟基类似物与铁(II)、钒(IV)和(V)及钼(V)和(VI)的新型螯合物，以及液体水溶液形式的与铁(II)和(III)及铬(III)的新型螯合物的方法。最后，本发明涉及所述固体形式的铁(II)、钒(IV)和(V)及钼(V)和(VI)的新型螯合物，以及液体水溶液形式的铁(II)和(III)及铬(III)的新型螯合物在人和动物营养品中的用途。
文档编号A23L1/304GK1688211SQ03823842
公开日2005年10月26日 申请日期2003年6月27日 优先权日2002年9月6日
发明者E·钦蒂, A·奇里波拉 申请人:阿格里斯图迪奥有限责任公司