专利名称：从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法
技术领域：
本发明涉及从2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮(以下称为酮基异佛尔酮，ketoisophorone)到(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮(以下称为放线醇，actinol)的微生物生产的一步方法和该方法中涉及的重组生物体。
放线醇在合成类胡萝卜素，例如玉米黄质(zeaxanthin)方面是有用的。EP982,406公开了一种有效的放线醇微生物生产，包括使用选自由单胞菌属、棒杆菌属、动性球菌属和节杆菌属的微生物构成的组的，并能将左旋二酮选择性的不对称还原为放线醇的微生物，用其接触左旋二酮(levodione)，并从反应混合物中回收生成的放线醇。EP 1,026,235公开了一种酶，左旋二酮还原酶，其作用于左旋二酮生产放线醇，它是从水生棒杆菌AKU611(FERMBP-6448)中分离的。EP 1,122,315公开了遗传物质，例如包含编码具有左旋二酮还原酶活性的酶的核苷酸序列的分离的DNA，由这种DNA编码的多肽，重组生物体等。
EP 1,074,630公开了一种有效的左旋二酮微生物生产，包括用至少一种能将酮基异佛尔酮转化成左旋二酮的、选自由鲁氏糖酵母(Saccharomycesrouxii)(鲁氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii))，戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)(单孢糖酵母(Saccharomyces unisporus)，戴耳凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii))，魏莱氏糖酵母(Saccharomyceswillianus)，拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)，和热带假丝酵母(Candida tropicalis)构成的组的酵母菌接触酮基异佛尔酮。对作用于酮基异佛尔酮以生产左旋二酮的酮基异佛尔酮还原酶的分离和表征最近已有报导。
迄今为止，还没有从酮基异佛尔酮直接生产旋光活性的放线醇的生物学的一步方法，其需要从酮基异佛尔酮到左旋二酮和从左旋二酮到放线醇的两个连续反应。
本发明涉及利用能同时将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮和将左旋二酮还原为放线醇的重组微生物，通过单步反应从酮基异佛尔酮生产高光学纯度的放线醇的方法。
更特别地，本发明提供从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，使用由于导入了酮基异佛尔酮还原酶基因或左旋二酮还原酶基因、或这两种基因而同时具备酮基异佛尔酮还原酶活性和左旋二酮还原酶活性的重组微生物或其无细胞提取物，使其接触酮基异佛尔酮，并从反应混合物中分离产生的放线醇。
另一方面，本发明提供从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，同时利用能催化酮基异佛尔酮转化为左旋二酮的酮基异佛尔酮还原酶和能催化左旋二酮转化为放线醇的左旋二酮还原酶，使它们接触酮基异佛尔酮。
本发明进一步提供一种重组微生物，其通过用左旋二酮还原酶基因转化能将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮的宿主微生物来获得。
更特别地，本发明提供一种重组微生物，其通过用酮基异佛尔酮还原酶基因转化能将左旋二酮还原为放线醇的宿主微生物来获得。
再一方面，本发明提供表达酮基异佛尔酮还原酶基因以及左旋二酮还原酶基因的重组微生物。
在本发明中，可以使用任何一种能从酮基异佛尔酮生产放线醇的重组微生物。在本发明中，可以使用能从酮基异佛尔酮生产左旋二酮的任何微生物作为宿主微生物，通过导入左旋二酮还原酶基因来获得能从酮基异佛尔酮生产放线醇的重组微生物。所述微生物还可以用作酮基异佛尔酮还原酶基因的供体菌株。优选的微生物选自由糖酵母属、接合糖酵母属和假丝酵母属的微生物构成的组。实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO1403、以及它们的突变株，和甚至是商业上可获得的面包酵母(baker’syeast)(可以从，例如Oriental Yeast Co.，Ltd获得)。这些酵母已在EP 1,074,630中公开，并被保藏在至少一个下述保藏单位，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard Manassae，VA20100-2209，美国；HUT培养物保藏室(HUT Culture Collection Room)，发酵技术部(Department ofFermentation Technology)，广岛大学(Hiroshima University)；和大阪发酵研究所(Institute for Fermentation Osaka)(IFO)，17-85Jusohonmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka，日本。每一菌株都可以应任何人的要求从相关的保藏单位获得。
在本发明中，可以使用能从左旋二酮生产放线醇的任何微生物作为宿主微生物，通过导入酮基异佛尔酮还原酶基因来获得能从酮基异佛尔酮生产放线醇的重组微生物。所述微生物还可以用作左旋二酮还原酶基因的供体菌株。优选的微生物选自由单胞菌属(Cellulomonas)、棒杆菌属(Corynebacterum)、动性球菌属(Planococcus)和节杆菌属(Arthrobacter)的微生物构成的组，包括单胞菌株(Cellulomonas sp.)AKU672(FERM BP-6449)、水生棒杆菌(Corynebacterium aquaticum)AKU610(FERM BP-6447)、水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)、P.okeanokoites AKU152(IFO 15880)、A.sulfureus AKU635(IFO 12678)和它们的突变株。这些微生物在EP 982,406中公开。单胞菌株AKU672(FERM BP-6449)、水生棒杆菌AKU610(FERMBP-6447)和水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)根据布达佩斯条约，以霍夫曼-拉罗奇有限公司Grenzacher大街124，CH-4070，瑞士巴塞尔的名义，在1998年8月4日保藏在高级工业科学和技术国际学会(AIST)，TsukubaCentral 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本。P.okeanokoitesAKU152(IFO 15880)和A.sulfureus AKU635(IFO 12678)以上述的保藏号保藏在IFO，任何人可以从该保藏单位公开地获得它们。最优选的一个菌株是水生棒杆菌AKU611。
在本发明中，可以使用既不能从酮基异佛尔酮生产左旋二酮、也不能从左旋二酮生产放线醇的任何微生物作为宿主微生物，通过导入编码酮基异佛尔酮还原酶的基因以及编码左旋二酮还原酶的基因来获得能从酮基异佛尔酮生产放线醇的重组微生物。
所述重组微生物的生长细胞或静止细胞培养物，或固定化细胞或无细胞提取物等，都可用于放线醇的生产。生长细胞培养物可以通过在营养培养基中培养所述重组微生物来获得，培养基包含糖类，例如葡萄糖或蔗糖，醇类，例如乙醇或甘油，脂肪酸，例如油酸和硬脂酸或它们的酯，或油类，例如菜籽油或豆油，作为碳源；硫酸铵，蛋白胨，氨基酸，玉米浆，麦麸，酵母提取物等，作为氮源；硫酸镁，氯化钠，碳酸钙，磷酸氢钾，磷酸二氢钾等，作为无机盐来源；和麦芽提取物，肉膏等，作为其他营养物来源。
重组微生物的培养可以是有氧的或无氧的条件、pH值从4.0到9.0、温度在从10到50℃的范围内、培养15分钟到72小时，优选的，pH值从5.0到8.0、温度在20到40℃的范围内，培养30分钟到48小时。
利用如此获得的生长细胞培养物，可通过任何本领域公知的方法来制备静止细胞培养物或固定化细胞或无细胞提取物。
取决于其他的反应条件，反应混合物中酮基异佛尔酮的浓度可以变化，但通常在0.1g/l到300g/l之间，优选的在1g/l到30g/l之间。
在本发明中，可以通过用酮基异佛尔酮还原酶并伴随地使用左旋二酮还原酶接触酮基异佛尔酮来生产放线醇。
最优选的一个左旋二酮还原酶和制备它的方法在EP 1,026,235中描述。这个酶的特点在于下列理化性质1)该左旋二酮还原酶催化左旋二酮到放线醇的区域性和立体选择性还原反应。
2)该酶的相对的分子量估计为142,000-155,000±10,000Da，由四个分子量为36,000±5,000Da的同源亚基组成。
3)最适温度是15-20℃，pH 7.0，最适pH值是7.5。
4)该酶需要NAD+或NADH作为辅助因子，被单价阳离子，例如K+、Na+、Cs+、Rb+和NH4+高度地激活。
左旋二酮还原酶在辅助因子存在下按照以下公式催化左旋二酮还原为放线醇左旋二酮+NADH放线醇+NAD可以从能将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮的微生物中获得酮基异佛尔酮还原酶和其遗传物质，例如包含编码具有酮基异佛尔酮还原酶活性的酶的核苷酸序列的分离的DNA。优选的微生物选自由糖酵母属、接合糖酵母属和假丝酵母属的微生物构成的组，包括酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403、它们的突变株，和甚至是商业上可获得的面包酵母(可以从，例如Oriental Yeast Co.，Ltd获得)。这些微生物在EP 1,074,630中公开。
例如，可以如下执行酶反应基本的反应混合物(总容量1ml)200μl 1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)、40μl含8mM NADH的0.2mM KOH、200μl酮基异佛尔酮溶液和20-80μl酶溶液，加水至1ml，在pH值从4.0到9.0、温度范围从10到50℃孵育5分钟到48小时，优选的在pH值从5.0到8.0、温度范围从20到40℃孵育15分钟到24小时。
取决于其他的反应条件，反应混合物中酮基异佛尔酮的浓度可以变化，但通常在0.1g/l到300g/l之间，优选的在1g/l到30g/l之间。
在如上所述的反应混合物中生物生产或酶生产的放线醇可以用有机溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或正丁烷提取，回收有机溶剂层中的放线醇。提取物可以通过已知的方法分析，如气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法或纸层析法等。
在反应之后，反应混合物中的放线醇可以，例如，通过用容易使放线醇溶解的、不与水混合的有机溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯、或乙酸正丁酯进行提取来回收。放线醇的进一步提纯可以通过浓缩提取物直接结晶放线醇或通过各种层析法的组合，例如薄层层析法、吸附层析法、离子交换层析、凝胶过滤层析、或高效液相色谱法来进行。
以下实施例进一步说明本发明，但是并不限制本发明的范围。
实施例1利用酿酒酵母INVScI静止细胞还原酮基异佛尔酮生产左旋二酮将酿酒酵母INVScI接种到YP-棉子糖培养基(每试管5ml)中，培养基包含10g/l Bacto酵母提取物、20g/l Bacto蛋白胨和20g/l棉子糖，在30℃培养20小时。种子培养物(seed medium)的一部分接种到同样的培养基(每试管10ml)中，在30℃培养5小时。将此次培养的600nm波长初始光密度值调节到0.2。在添加20％半乳糖溶液(1ml)后，继续培养16小时。收集每个试管的主要培养液，通过离心作用收获细胞。离心分离的团状物在用0.1MKPB(pH6.0)洗涤后用作以下酮基异佛尔酮还原反应的静止细胞。
酮基异佛尔酮还原反应如下进行。将0.11g静止细胞悬浮于1ml反应缓冲液中，反应缓冲液是包含50g/l葡萄糖和5.0g/l酮基异佛尔酮的0.1MKPB(pH6.0)，在30℃在试管中轻轻地摇动(200rpm)培养。通过对反应混合物离心回收反应溶液并除去静止细胞团状物。产生的反应溶液用等体积的乙酸乙酯提取，通过气相色谱法进行分析[柱BGB-176(BGB Analytik AG，Switzerland)，仪器GC-14A(SHIMADZU，Japan)，运载气体He，柱温度从100℃到150℃以1℃/分钟升高，注入器温度200℃]。
反应结果在表1中描述。反应17.0小时后，从5g/l酮基异佛尔酮产生了2.8g/l左旋二酮。主要的副产物，放线醇的(S，R)-异构体的浓度为0.7g/l。
表1利用酿酒酵母INVScI细胞进行的酮基异佛尔酮还原反应
实施例2来源于水生棒杆菌AKU611的左旋二酮还原酶基因导入酿酒酵母INVScI如下所述，通过利用根据纯化的左旋二酮还原酶的部分氨基酸序列的信息设计的PCR引物，克隆了编码左旋二酮还原酶基因的DNA片段。
首先，利用基因组分离试剂盒(BIO101)制备水生棒杆菌AKU611(FERMBP-6448)的基因组DNA。利用制备的基因组DNA作为模板，通过利用热循环仪(Perkin elmer 2400，U.S.A.)进行PCR扩增获得没有过多侧翼区的左旋二酮还原酶基因的完整编码序列。使用的两个合成引物是LV ORF(+)(SEQID NO1)(具有EcoRI位点GAATTC)和LV-ORF(-)(SEQ ID NO2)(具有PstI位点CTGCAG)。PCR混合物(0.02ml)包含5pmol每种引物、0.2mM每种dNTP和1U LA Taq(Takara Shuzo co.LTD/Kyoto，Japan)。最初的模板变性步骤为94℃1分钟。98℃20秒、70℃2分钟和72℃4分钟的扩增循环重复25次。
通过这个反应，扩增出包含左旋二酮还原酶基因的完整ORF(0.8kb)的DNA片段。使用EcoRI和PstI处理这个扩增出的左旋二酮还原酶基因，与预先用EcoRI和PstI消化的载体pKK223-3(Amersham Bioscience/Bucking-hamshire，England)连接，构建质粒pKKLR(1-15)。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，选出几个克隆用于序列分析。检查每一候选克隆所克隆的左旋二酮还原酶基因序列。将其中一个显示了与水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)的左旋二酮还原酶序列完全相同的序列的克隆命名为JM109[pKKLR(1-15)]。从该菌株中分离pKKLR(1-15)用于进一步的实验。
从包含左旋二酮还原酶基因和大肠杆菌载体pKK223-3的质粒pKKLR(1-15)上将编码左旋二酮还原酶基因的0.8kb DNA片段切下，插入用于酿酒酵母的表达载体pYES2。将0.8kb左旋二酮还原酶片段与质粒pYES2的EcoRI消化形连接，在该连接的DNA钝化和该DNA的自连接后，其结果是原本就存在于pYES2上的GAL1启动子和CYC1终止子与质粒上的左旋二酮还原酶基因相连。在证实了插入的左旋二酮还原酶基因的方向之后，这个命名为pLVRS1的质粒被用来转化酿酒酵母INVScI。该质粒在附图
中说明，附图描绘了质粒DNA pLVRS1将LVR基因导入拜列氏接合糖酵母ATCC11486细胞。PGAL1、TCYC1、pMB1 ori、AmpR、URA3、2micron ori和f1ori分别指GAL1启动子、CYC1终止子、pMB1(pUC来源的质粒)起点、氨苄青霉素抗性基因、URA3基因、2微米DNA起点和f1起点。LVR基因用灰色箭头表示。
利用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)将左旋二酮还原酶编码质粒pLVRS1导入酿酒酵母INVScI细胞。转化方法基本上与转化试剂盒的方案相同。由于亲本菌株的尿嘧啶营养缺陷型和质粒的URA3标记存在，通过将转化溶液涂布在缺乏尿嘧啶的固体合成培养基上，并将这些平板在30℃孵育4天，可以选择出转化的细胞。利用酿酒酵母INVScI转化体菌株的候选物的总DNA作为供体DNA转化大肠杆菌DH5alpha菌株后，通过核对包含pLVRS1的大肠杆菌DH5alpha菌株的出现，确认了在酵母菌株中存在该质粒。具有pLVRS1的菌株酿酒酵母(pLVRS1)然后被用于进一步实验。
实施例3利用包含来源于水生棒杆菌AKU611的左旋二酮还原酶基因的酿酒酵母INVScI静止细胞还原酮基异佛尔酮生产放线醇利用具有pLVRS1的酿酒酵母INVScI静止细胞进行的酮基异佛尔酮还原反应按照与实施例1描述的基本相同的方法来执行。
反应结果在表2中描述。反应19.0小时后，从5.0g/l酮基异佛尔酮产生了1.6g/l放线醇。由于相对较高的(S，R)-异构体浓度值(0.48g/l)，放线醇的光学纯度不是很高(67.2％)。
表2利用具有pLVRS1的酿酒酵母INVScI进行酮基异佛尔酮还原反应
KIP酮基异佛尔酮；(R)-LDN(R)-左旋二酮；(R，R)-ACT(R，R)-放线醇；(S，R)-ACT(S，R)-放线醇，(S)-PHO(S)-phorenol将0.33g静止细胞悬浮于1ml反应缓冲液中，反应缓冲液是包含150g/l葡萄糖和10.0g/l酮基异佛尔酮的0.1M KPB(pH 6.0)，在20℃在试管中轻轻地摇动(200rpm)培养。按照实施例1的描述回收和提取反应溶液，并通过气相色谱法进行分析。
反应结果在表3中描述。反应25.0小时后，从10.0g/l酮基异佛尔酮产生了3.3g/l放线醇。由于(S，R)-异构体的浓度被抑制到0.52g/l，放线醇的光学纯度增加到81.5％。
表3利用具有pLVRS1的酿酒酵母INVScI进行酮基异佛尔酮还原反应
KIP酮基异佛尔酮；(R)-LDN(R)-左旋二酮；(R，R)-ACT(R，R)-放线醇；(S，R)-ACT(S，R)-放线醇，(S)-PHO(S)-phorenol
序列表<110>DSM IP资产公司(DSM IP ASSETS B.V.)<120>从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法<130>NDR5223<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工的<400>1ggaggcgaat tcatgaccgc aaccagctcc<210>2<211>27<212>DNA<213>人工的<400>2gggctgctgc agtcagtacg cggcgga
权利要求
1.从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，包括在反应混合物中用重组微生物或其无细胞提取物接触酮基异佛尔酮，并从反应混合物中分离生产的放线醇，其中所述重组微生物通过转化宿主微生物获得，所述宿主微生物例如，选自由糖酵母属、接合糖酵母属和假丝酵母属的微生物构成的组，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株，其能利用左旋二酮还原酶基因将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮，所述左旋二酮还原酶基因例如来源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶基因，所述棒杆菌属的微生物例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在pH值从4.0到9.0，优选从5.0到8.0，温度范围从10到50℃，优选从20到40℃，反应15分钟到72小时，优选的反应30分钟到48小时。
3.从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，包括在反应混合物中用重组微生物或其无细胞提取物接触酮基异佛尔酮，并从反应混合物中分离产生的放线醇，其中所述重组微生物通过转化宿主微生物获得，所述宿主微生物例如选自由单胞菌属、棒杆菌属、动性球菌属和节杆菌属的微生物构成的组，例如单胞菌株AKU672(FERM BP-6449)、水生棒杆菌AKU610(FERMBP-6447)、水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)、P.okeanokoitesAKU152(IFO 15880)、A.sulfureus AKU635(IFO 12678)和它们的突变株，其能用酮基异佛尔酮还原酶基因将左旋二酮还原为放线醇，所述酮基异佛尔酮还原酶基因例如来源于糖酵母属、接合糖酵母属或假丝酵母属的微生物，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应在pH值从4.0到9.0，优选从5.0到8.0，温度范围从10到50℃，优选从20到40℃，反应15分钟到72小时，优选的反应30分钟到48小时。
5.从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，包括在反应混合物中用重组微生物或其无细胞提取物接触酮基异佛尔酮，并从反应混合物中分离生产的放线醇，其中所述重组微生物例如，选自由单胞菌属、棒杆菌属、动性球菌属和节杆菌属的微生物构成的组，例如单胞菌株AKU672(FERM BP 6449)、水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)、水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)、P.okeanokoites AKU152(IFO 15880)、A.sulfureus AKU635(IFO 12678)和它们的突变株，其表达酮基异佛尔酮还原酶基因以及左旋二酮还原酶基因，所述左旋二酮还原酶基因例如来源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶基因，所述棒杆菌属的微生物例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变株。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反应在pH值从4.0到9.0，优选从5.0到8.0，温度范围从10到50℃，优选从20到40℃，反应15分钟到72小时，优选的反应30分钟到48小时。
7.通过用纯化的酮基异佛尔酮还原酶和纯化的左旋二酮还原酶接触酮基异佛尔酮，从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，所述纯化的酮基异佛尔酮还原酶例如来源于糖酵母属、接合糖酵母属或假丝酵母属的微生物，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株，其能催化酮基异佛尔酮转化为左旋二酮，所述纯化的左旋二酮还原酶例如来源于棒杆菌属的微生物，例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变株，其能同时催化左旋二酮转化为放线醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应在pH值从4.0到9.0，优选从5.0到8.0，温度范围从10到50℃，优选从20到40℃，反应5分钟到48小时，优选的反应15分钟到24小时。
9.一种可通过转化宿主生物体获得的重组微生物，所述宿主生物体例如糖酵母属、接合糖酵母属或假丝酵母属的微生物，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株，其能利用左旋二酮还原酶基因将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮，所述左旋二酮还原酶基因例如来源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶基因，所述棒杆菌属的微生物例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变株。
10.一种可通过转化宿主生物体获得的重组微生物，所述宿主生物体例如单胞菌属、棒杆菌属、动性球菌属和节杆菌属的微生物，例如单胞菌株AKU672(FERM BP-6449)、水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)、水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)、P.okeanokoites AKU 152(IFO 15880)、A.sulfureus AKU635(IFO 12678)和它们的突变株，其能利用酮基异佛尔酮还原酶基因将左旋二酮还原为放线醇，所述酮基异佛尔酮还原酶基因例如来源于糖酵母属、接合糖酵母属或假丝酵母属的微生物，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株。
11.一种表达酮基异佛尔酮还原酶基因以及左旋二酮还原酶基因的重组微生物，所述酮基异佛尔酮还原酶基因例如来源于糖酵母属、接合糖酵母属或假丝酵母属的微生物，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO 0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO 0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO 1403和它们的突变株，所述左旋二酮还原酶基因例如来源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶基因，所述棒杆菌属的微生物例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变株。
全文摘要
公开了从酮基异佛尔酮生产放线醇的方法，包括在反应混合物中用重组微生物或其无细胞提取物接触酮基异佛尔酮，并从反应混合物中分离生产的放线醇，其中所述重组微生物通过转化宿主微生物获得，所述宿主微生物例如，选自由糖酵母属、接合糖酵母属和假丝酵母属的微生物构成的组，例如商业上可获得的面包酵母、酿酒酵母ATCC7754、鲁氏糖酵母(鲁氏接合糖酵母)HUT7191(IFO0494)、戴耳克氏糖酵母HUT7116(单孢糖酵母IFO0298)、戴耳克氏糖酵母(戴耳凯氏有孢圆酵母)HUT7102、魏莱氏糖酵母HUT7106、拜列氏接合糖酵母ATCC11486、热带假丝酵母IFO1403和它们的突变株，其能用左旋二酮还原酶基因将酮基异佛尔酮还原为左旋二酮，所述左旋二酮还原酶基因例如来源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶基因，所述棒杆菌属的微生物例如水生棒杆菌AKU611(FERM BP－6448)或其突变株。
文档编号C12R1/865GK1863919SQ03823205
公开日2006年11月15日 申请日期2003年9月16日 优先权日2002年9月27日
发明者星野达雄, 濑户口丰, 清水昌, 田畑和之 申请人:Dsm Ip 资产公司