专利名称：检测和定型皮肤hpv的方法及其采用的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测和定型人乳头瘤病毒(HPV)的方法。具体而言，本发明涉及检测和定型超组B的皮肤HPV的方法。本发明还涉及用于本发明方法中的引物和探针。
背景技术：
所有疣的病源因子是称作人乳头瘤病毒(HPV)的多种不同组的病毒，其总共构成一组100种以上的病毒型，正如由DNA序列变异所确定。不同的HPV引起多种皮肤病和粘膜病。某些类型可带来疣，或乳头瘤，这是良性(非癌性)肿瘤。已发现其他类型导致侵入性宫颈癌。
在所有HPV类型中，有30种以上可通过性接触在人际间传播。因此，HPV感染是最普遍的性传播疾病(STDs)之一。损害可能在与携有HPV的人性接触后数周到数月内出现，也可能从不出现，这是因为HPV感染经常不会造成任何症状。目前，虽然损害和疣本身能被治疗，但还没有药物治疗可消除乳头瘤病毒感染。
乳头瘤病毒和多瘤病毒都属于乳多空病毒科，这是带有双链DNA基因组的小的非包膜肿瘤病毒家族。个别分离株是高度宿主特异的。特异于人(HPV)，牛(BPV)，鸟类(例如，FPV)，鹿(DPV)，棉尾兔(CRPV)，欧洲麇鹿(EEPV)和众多其他动物的的乳头瘤病毒已得以鉴定。
与其他主要通过血清型分组的病毒不同的是，乳头瘤病毒的分类采用同一宿主的基因型，并且以鉴定顺序编号(例如，HPV1-HPV83和BPV1-BPV4)。
HPV基于其诱导感染细胞恶性变化的能力，被广泛分成低风险和高风险类型。诸如1，2，4，6，11，13和32的低风险HPV类型主要与良性损害或普通疣相关，而诸如16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68和69的高风险类型主要与前恶性和恶性上皮损害相关。与由低风险类型，例如HPV-6和HPV-11，引起的疣相比，HPV的这些高风险类型引起的生长一般是扁平的并且几乎看不见。
根据组织向性，乳头瘤病毒一般也可加以分类。尽管所有已知的人乳头瘤病毒严格感染上皮来源的细胞(角化细胞)以及诱导上皮肿瘤，但是根据组织向性，它们可分组成粘膜HPV型或皮肤HPV型。
粘膜型(例如，HPV6和HPV16)包括那些感染生殖器和呼吸道的粘膜的HPV。皮肤型(例如，HPV1和HPV8)包括那些一般感染外部皮肤的HPV，例如那些引起皮肤疣的HPV，和那些引起患有疣状表皮发育不良(EV；罕见的遗传病，特征在于孩提时代为散布的平疣和斑点损害，以及生命后期有HPV-诱导的皮肤癌的倾向)的病人皮肤癌的HPV。
已显示与EV有关的HPV类型构成了一组分类成EV-型的皮肤HPV(例如，5，8，17，20和36型)。在这些病毒中，有些仅在遗传性诱因的个体中引起癌症。基于它们的系统发生关系，EV-型HPV和EV-型相关的HPV以及4型HPV在分类中统称为超组B-型，并且形成最大的一组皮肤HPV类型。
上文清楚地表明，HPV的类型一般可预测感染位点及其临床过程。
最新数据显示，超组B-型皮肤人乳头瘤病毒可能参与非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的发病机理，尤其是在免疫抑制(例如，肾移植受体)病人中。此外，皮肤HPV DNA，具体为5，36和38型的皮肤HPV DNA，可在高达90％的牛皮癣损害中得以检测，表明有病源学关系。然而，对皮肤HPV的研究受到下列事实阻碍这些研究包括大量和高度异源的病毒组，为此，需要平行采用多个基于PCR的检测体系。
现有技术中，皮肤HPV检测和定型体系有诸多限制。现有技术的HPV检测和定型体系的一个缺点为，在单个分析中只能检测数目有限的HPV型。因此，为了覆盖大范围的不同类型，需要进行若干单独的PCR分析(参见，例如，Shamanin等，1996，J.Natl.Cancer Inst.88802-811；Meijer等，2001，Cancer Detect.Prev.25533-547)。
此外，现有技术分析要求相对大的DNA片段(Shamanin等，1996，J.Natl.Cancer Inst.88802-811；Berkhout等，1995，J.Clin.Microbiol.33690-695；Forslund等，1999，J.Gen.Virol.802437-2443；Meijer等，2001，Cancer Detect.Prev.25533-547)。由于材料的适当保存(例如，福尔马林固定)以及临床材料保存差可能生成降解的DNA，因此，这类分析仅适用于对相对新鲜的未固定材料进行分析。这就妨碍了其应用，并且阻止了方法的标准化。
而且，迄今为止，现有技术仅公开了单对引物(例如，Forslund等，同上的简并引物)或嵌套PCR引物(例如，Berkhout等，同上)。虽然Forslund的方法显示有可能检测各种不同类型的HPV，但它们仍未表明所有的超组B-型HPV可从临床样本中加以检测。
而且，当今适用于检测皮肤HPV的分析体系没有与其偶联的定型体系。结果，为了定型HPV，需要对DNA扩增产物进行繁琐的重扩增，克隆和测序(Shamani等，1996，J.Natl.Cancer Inst.88802-811；Berkhout等，1995，J.Clin.Microbiol.33690-695)。
现有技术中，有些方法以相当的灵敏度检测多个HPV类型，另一个问题是所谓的嵌套-PCR形式(Berkhout等，1995，J.Clin.Microbiol.33690-695)。这类方法对污染极其敏感，非常少量的污染模板DNA就会生成假阳性结果。此外，这样的形式还很费力。
发明概述为了克服这些困难，本发明人现已发现一种检测属于超组B的各种不同的任何皮肤HPV类型的方法。此外，在本发明的其他方面，本发明人发现了一种与检测方法相容、用于超组B内HPV类型的有效定型体系的方法。
根据本发明，检测皮肤超组B HPV的方法包括下列步骤提供怀疑藏有皮肤超组B HPV的样品，提供多个双向引物对，所述引物基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA，利用所述多个引物进行反应以扩增衍生自所述样品的DNA，以及通过所述DNA扩增反应的反应产物与多个属类皮肤超组B HPV探针杂交，从皮肤超组B HPV中检测DNA扩增产物。
在另一方面，本发明提供了定型皮肤超组B HPV的方法，包括下列步骤通过扩增多个双向引物对之间的皮肤超组B HPV的DNA提供DNA扩增产物，以及通过所述扩增产物与至少一个皮肤超组BHPV探针杂交从一个或多个超组B HPV型中检测DNA扩增产物，所述探针基本上互补于至少一个但不是全部皮肤超组B HPV型的DNA。
在进一步方面，本发明提供一组双向扩增引物，用于扩增超组BHPV-DNA。
在另一方面，本发明提供属类寡核苷酸探针，用于属类检测超组B HPV-DNA。
在另一方面，本发明提供种类-特异寡核苷酸探针，用于种类特异性或选择性检测属于HPV超组B的单个HPV-型。
附图描述
图1示出合适的双向引物对，用于扩增来自属于超组B的皮肤HPV的DNA。
图2示出属于超组B的皮肤HPV的DNA中超组B HPV-特异引物-结合区的序列(5’-3’)。为了清楚起见和便于所示序列的比对，这些区中的互补链未示出，但应理解含在其中。
图3示出合适的属类检测探针，用于检测衍生自皮肤超组B HPV的扩增子HPV(5’DIG-3’)。如文本所示，这些探针也可由所示的互补链组成。
图4示出皮肤超组B HPV的DNA中探针-结合区的序列(5’-3’)。为了清楚起见和和便于所示序列的比对，这些区中的互补链未示出，但应理解含在其中。
图5示出种类-特异性检测探针，适用于反系印迹(reverse lineblot)(RLB)定型衍生自皮肤超组B HPV的扩增子(5’氨基-3’)。如文本所示，这些探针也可由所示的互补链组成。
图6示出HPV 4型的双链DNA序列(根据EMBL登录号X70827编号)。所示为双向引物的位置(下划线)以及分别在图2和4中定义的探针-结合区(阴影部分)。
发明详述“互补序列”为与另一核苷酸序列根据沃森-克里克碱基配对法则形成氢键双链体的核苷酸序列。例如，5’-AAGGCT-3’的互补碱基序列为3’-TTCCGA-5’。
“表达”是指基因转录成结构RNA(rRNA，tRNA)或信使RNA(mRNA)，以及如果适用，随后翻译成蛋白。
如果多核苷酸在同一生物体中不是天然出现在一起，则它们彼此是“异源的”。如果某个多核苷酸在某生物体中不以其特定形式和排列天然出现，则它对该生物体是异源的。
如本发明所述，当对最大对应进行比对时，如果两个序列中的核苷酸序列相同，则多核苷酸具有同源序列。两个或多个多核苷酸之间序列比较一般是在比较窗上比较两个序列部分以鉴定和比较局部区域的序列相似性。比较窗通常为大约20到200个相邻核苷酸。多核苷酸的“序列同源性百分比”，诸如50，60，70，80，90，95，98，99或100％序列同源性可通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列而确定，其中比较窗中的多核苷酸序列部分与用于最佳比对两个序列的参照序列(不包括添加或缺失)比较，可包括添加或缺失(即，间隙)。百分比的计算如下(a)确定相同核酸碱基在两个序列中出现的位置数，以产生匹配位置数；(b)将匹配位置数除以比较窗中的位置总数；以及(c)结果乘以100，以产生序列同源性的百分比。比较用序列的最佳比对可通过计算机化执行已知算法或通过检查而进行。容易可用的序列比较和多序列比对算法分别为局部相似性基本查询工具(BLAST)(Altschul，S.F.等，1990.J.Mol.Biol.215403；Altschul，S.F.等，1997.Nucleic Acid Res.253389-3402)以及ClustalW程序，皆可从因特网上获得。其他合适的程序包括威斯康星遗传软件包(WisconsinGenetics Software Package)(Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI，USA)中的GAP，BESTFIT和FASTA。
如本发明所用，“基本上互补”表示两个核酸序列彼此具有至少大约65％，优选大约70％，更优选大约80％，甚至更优选90％，以及最优选大约98％的序列互补性。这意味着引物和探针必须与其模板和靶核酸分别显现足够的互补性，从而在严格条件下杂交。因此，本说明书中公开的引物序列无需反映模板上结合区的真正序列，并且可采用简并引物。基本互补的引物序列与扩增模板具有足够的序列互补性，从而导致引物结合和第二链合成。
术语“杂合体”是指通过在互补核苷酸之间的氢键形成的双链核酸分子，或双链体。术语“杂交”或“退火”是指单链核酸序列通过互补核苷酸之间的氢键形成双螺旋区段的过程。
术语“寡核苷酸”是指通过磷键(例如，磷酸二酯，烷基和芳基磷酸酯，硫代磷酸酯)或非磷键(例如，肽，氨基磺酸盐(sulfamate)等)而连接的核苷酸单体的短序列(通常为6到100个核苷酸)。寡核苷酸可包含修饰的核苷酸，具有修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修饰的糖基(例如，2’-O-甲基核糖基，2’-O-甲氧基乙基核糖基，2’-氟核糖基，2’-氨基核糖基等)。寡核苷酸可以是天然存在或合成的双链和单链DNA分子以及双链和单链RNA分子，形状有环状，支链或线性，并且任选包括能够形成稳定的二级结构的结构域(例如，茎和环结构以及环-茎-环结构)。
本发明所用术语“引物”是指当置于诱导合成互补于核酸链的引物延伸产物的条件，即在核苷酸，DNA聚合酶等聚合剂，以及合适的温度和pH存在时，能够退火至扩增靶，让DNA聚合酶连接从而用作DNA合成起始点的寡核苷酸。(扩增)引物优选为单链，用于最大效率扩增。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将依赖于诸多因素，包括温度和引物来源。如本发明所用的“双向引物对”是指DNA扩增，如PCR扩增领域中常用的一个正向引物和一个反向引物。
术语“探针”是指单链寡核苷酸序列，其会识别靶核酸序列分析物中的互补序列或其cDNA衍生物，并与之形成氢键双链体。
术语“严格”或“严格杂交条件”是指影响杂合体稳定性的杂交条件，例如，温度，盐浓度，pH，甲酰胺浓度等。这些条件根据经验进行优化，以使引物或探针与其靶核酸序列的特异性结合最大化并使非特异性结合最小化。所用术语还包括参照条件，在此条件下探针或引物与其靶序列杂交的可检测程度大于其他序列(例如，至少高于背景2倍)。严格条件是序列依赖的，并且随情形不同而不同。较长序列在更高温度下特异性杂交。一般而言，严格条件的选择在限定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。通常，在严格条件中，盐浓度小于大约1.0M Na+离子，一般大约0.01-1.0M Na+离子浓度(或其他盐)，pH7.0-8.3，以及温度对短探针或引物(例如，10-50个核苷酸)至少大约30℃，而对长探针或引物(例如，大于50个核苷酸)至少大约60℃。严格条件的实现也可加入去稳定剂，如甲酰胺。示例性低严格条件或“降低的严格条件”包括在37℃下用30％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的缓冲液杂交，以及在40℃下以2×SSC冲洗。示例性高严格条件包括在37℃下用50％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS的缓冲液杂交，以及在60℃下以0.1×SSC冲洗。杂交步骤在本领域是众所周知的，并且描述在例如，Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Inc.，1994。
本发明方法检测，鉴定和诊断属于超组B的人乳头瘤病毒，以及人乳头瘤病毒在生物体中的感染，所述生物体易受由超组B HPV引起的这类感染影响。
超组B HPV的检测本发明检测超组B HPV的方法可在衍生自人的样品上操作，但也可在其他样品，诸如环境样品，或其他可能存在HPV的地点的样品，诸如来自昆虫等其他生物体的样品上操作。优选地，用于本发明方法的样品包括人样品，诸如病人的细胞样品。更优选地，样品包括来自潜在感染或怀疑感染场所的病人细胞。
病人细胞样品可包括肿瘤性皮肤细胞(例如，在疣情形下，veruccas等，假设由皮肤HPV感染引起)。此外，样品可包括肿瘤性粘膜细胞样品，诸如在HPV感染女性泌尿生殖道的情形下的宫颈细胞样品，而且，肺，喉，口腔，扁桃腺，食管，阴茎，阴户，肛门，直肠，前列腺，子宫的癌组织和其他组织也可作为样品用于本发明的方法中。
用于本发明方法中的这种样品的获得和制备方法对本领域技术人员是公知的，或者从本发明公开内容中会变得一目了然。有关DNA分析和操作的通用方法参见，例如，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第2版，第1-3卷，Sambrook等主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987)及其定期的更新资料。
优选地，本发明方法用于检测HPV型4，5，8，9，12，14，15，17，19，20，21，22，23，24，25，36，37，38，47，48，49，50，60和/或65。所有这些类型被分类成皮肤超组B HPV。
还未发现的皮肤HPV超组B的成员就可通过本发明方法进行合适地检测正是本发明的优势方面。而且，定型超组B HPV的方法可被放大，以便于在本发明的HPV定型体系中并入这些新发现的类型。
本发明人在所有皮肤超组B HPV类型的DNA中现已发现两个离散的区域，其紧密地分隔在一起，并且在各种不同的超组B HPV类型之间显示同源性。这两个同源区或共有区域位于皮肤超组B HPV基因组的L1可读框(ORF)中。这两个共有区域的DNA序列示于图2中。第一个共有区域包括在此定义成以5’-3’方向在HPV 4型基因组上从大约核苷酸位置6539到大约核苷酸位置6559延伸的区域(根据EMBL登录号X70827编号，HPV 4型)以及其他皮肤超组B HPV型的基因组内的对应区域。第二共有区域包括在此定义成以5’-3’方向在HPV 4型基因组上从大约核苷酸位置6583到大约核苷酸位置6610延伸的区域以及其他皮肤超组B HPV型的基因组内的对应区域。
基于这个发现，本发明提供了一组双向引物，其中各个引物分别能够退火至多个皮肤超组B HPV型的两个共有区域中的一个。完整的组优选提供多个双向引物对，当其共同使用时，能够退火至任何皮肤超组B HPV的DNA中的这两个共有区域，以及能够扩增这两个共有区域之间和相邻(即位于这两个共有区域侧翼)的限定的DNA序列。
从所有皮肤超组B HPV中扩增上述两个共有区域之间区域的合适双向引物对的例子示于图1中。从本发明公开内容中，本领域技术人员显然可设计出除图1所示之外的其他组的引物，并且用于扩增位于皮肤超组B HPV基因组的L1 ORF中的两个共有区域侧翼或与之侧翼相接的特异序列。例如，有可能使用稍短或稍长的引物，或含有例如，肌醇残基或模糊碱基的引物序列，或者甚至与图1的引物序列比较含有一个或多个错配的引物。一般而言，与图1的寡核苷酸序列显示至少65％，更优选至少80％同源性的序列被视为适用于本发明的方法。
本发明方法原则上可通过采用任何核酸扩增方法进行，诸如聚合酶链式反应(PCR；Mullis 1987，U.S.专利No.4,683,195，4,683,202，en4,800,159)或通过采用扩增反应进行，诸如连接酶链式反应(LCR；Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193；EP申请No.，320,308)，自动维持序列复制(3SR；Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，链置换扩增(SDA；U.S.专利Nos.5,270,184，en5,455,166)，转录扩增体系(TAS；Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 61197)，滚环扩增(RCA；U.S.专利No.5,871,921)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，切割片段长度多态性(Cleavase Fragment LengthPolymorphism)(U.S.专利No.5,719,028)，等温和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)，分叉延伸扩增方法(RAM；U.S.专利Nos.5,719,028和5,942,391)或其他合适的DNA扩增方法。
本发明优选的实施方案采用PCR方法，包括采用一组合起来匹配在所有已知属于超组B的HPV型的L1可读框内序列的5个重叠正向和4个重叠反向引物，通过引物起始扩增超组B HPV-DNA。
由于在此定义的L1 ORF中的两个共有区域被紧密地分隔在一起，优选的一组双向扩增引物扩增超组B HPV-DNA的短片段(即，大约72个碱基对)。这为从质量差的模板DNA，诸如降解到一定程度的DNA中扩增DNA序列提供了可能，从而在本发明方法中能够使用福尔马林固定的样本作为样品材料，以及使用其他保存不太好的材料。
为了使用一个或多个扩增引物扩增带有少量错配的HPV型的DNA，扩增反应可在降低的严格条件下进行(例如，PCR扩增利用退火温度38℃，或存在3.5mM MgCl2的条件下)。本领域技术人员能够选择合适的严格条件。
引物序列和超组B HPV-特异DNA扩增引物的对应序列示于图1中。
L1 ORF中两个共有区域侧翼的序列区域的另一重要方面在于，其DNA序列包括属于超组B的多种不同的HPV的共同基元，如图4所示。
因此，通过扩增L1 ORF中特异于超组B HPV的两个共有区域之间的DNA序列区域，所有超组B HPV可通过利用一组属类皮肤超组B HPV检测探针进行检测，所述检测探针必须会与那些含有共同基元的HPV的扩增子杂交。当共同使用时，这种属类检测探针会结合所有亚组B HPV扩增产物。本发明人已发现，非常有利的体系采用与3个设有摆动碱基的重叠属类探针的鸡尾酒杂交，以检测所有可能的通过皮肤超组B HPV引物扩增的HPV类型。一组合适的与所有超组BHPV扩增子的上述两个共有区域之间区域结合的属类检测探针的例子示于图3中。
从本发明公开内容中，本领域技术人员会一目了然，可以设计除了图3的其他组的属类检测探针，并且用于检测位于所有皮肤超组BHPV的L1 ORF中两个共有区域侧翼的DNA序列。例如，有可能使用稍短或稍长的探针，或含有模糊碱基或摆动碱基的探针序列，它们被定向至稍微不同簇的HPV型，或者除了图3之外的不同组的探针，诸如与其靶序列相比含有一个或多个错配的探针。一般而言，与图3的寡核苷酸序列显示至少65％，更优选至少80％同源性的序列被视为适用于本发明的方法，用于属类检测所有超组B HPV的扩增子。
同样，图3中所列的互补序列在本发明方法中可合适地用作属类检测探针，前提是互补链在所用的扩增反应中扩增，诸如当PCR用于扩增时。
检测扩增产物原则上可由本领域公知的任何合适的方法来完成。检测片段可直接用放射性标记，抗体，发光染料，荧光染料或酶试剂染色或标记。直接DNA染色包括例如，嵌入染料，诸如吖啶橙，溴化乙锭，单叠氮化锭或Hoechst染料。
此外，DNA片段通过掺入标记dNTP碱基至合成的DNA片段中而得以检测。与核苷酸碱基有关的检测标记包括例如，荧光素，氰蓝染料或BrdUrd。
本发明优选包括通过反应产物与一个或多个属类皮肤HPV超组B探针杂交而检测由上述对皮肤超组B HPV DNA进行扩增反应得到的反应产物。
当使用基于探针的检测体系时，用于本发明的合适的检测步骤可例如包括酶免疫分析(EIA)形式(Jacobs等，1997，J.Clin.Microbiol.35，791-795)。为了以EIA方式进行检测，扩增反应中所用的正向或反向引物可包括捕获基团，例如生物素基团，以使超组B HPV-DNA PCR扩增子固定在例如链亲和素包被的微量滴定板孔上，用于随后的EIA检测超组B HPV-扩增子(参见下文)。本领域专业人员会理解，可采用在EIA形式中用于固定超组B HPV-DNA PCR扩增子的其他基团。定型超组B HPV位于皮肤超组B HPV的L1 ORF中的两个共有区域侧翼的DNA序列区的另一重要方面在于，其DNA序列也独特于各个属于超组B的HPV类型，正如在图4中可见。
所以，在本发明的另一方面，属于超组B的各种不同的HPV型通过使用多个种类特异皮肤超组B HPV检测探针可得以检测，所述探针分别仅结合于属于超组B的一个特异型HPV的扩增子。由此，通过扩增在此定义的两个共有区域之间的DNA序列区，接着对各个HPV型的独特序列进行探测，提供了用于定型各种不同的超组B HPV的方法。
用于种类特异性检测来自在此公开的超组B型HPV的DNA的L1ORF中的区域的探针举例在图5中。这些种类特异性探针优选仅结合于至少部分DNA序列区域，正如在属于超组B的单一HPV型的两个共有区域之间扩增的区域。本领域专业技术人员可制备相似的探针，在来自超组B HPV的DNA的L1 ORF的核苷酸序列基础上，用于种类特异性检测，而无需太多的试验，正如在此阐述。同样，图5中所列的互补序列作为种类特异检测探针可合适地用于本发明方法中，前提是这种互补链扩增在所用的扩增反应中。
根据本发明，定型方法中所用的探针选择性与某个(些)HPV型的扩增子结合，但在很低的严格杂交条件下，与其他HPV型的扩增子不结合或仅弱结合。因此，在一个实施方案中，本发明可用于确定感染病人的HPV类型。随着恶性疾病的发展(以及临床预后)极其依赖于HPV型，这具有重要意义。因此，在定型方面，本发明提供确定病人中HPV感染的类型的方法。
根据本发明，在定型超组B HPV的方法中，合适的探针例如，仅与亚组HPV型的扩增子杂交。这类探针，例如，可以是图3的属类探针。在这样的实施方案中，例如，使感染HPV型限制至具体的亚组(或排除这样的亚组)的能力是足够的。
在本发明定型超组B HPV的方法中，与定型探针结合的扩增子的亚组可由单一HPV型扩增子组成，或可由多个不同类型的扩增子组成，以致种类特异探针与生成自样品的扩增子的结合或非结合(如果合适)会使研究人员推导出感染病人的HPV型的同一性。与所需HPV型结合，但不与非所需HPV型结合的探针可通过本领域专业人员公知的方法生成。
本发明现在提供探针以显著特异性与之结合的扩增子的具体区域。尽管同源区域可能存在于所有生成的HPV扩增子中，但是该具体区域的核酸序列对不同类型的HPV是独特的。
如果相似的定型需要对尚未清晰地包括或发现的超组B HPV进行，这种HPV类型的扩增子的核酸序列不必互补于本文提供的任何探针。然而，利用本发明公开内容，通过常规比对和序列比较计算机程序，合适的杂交区域可由本领域专业人员容易地在其他扩增子中进行鉴定。
在本发明定型超组B HPV的方法的优选实施方案中，使用一组24个不同探针(图5)，或其互补序列，与图4所示的衍生自24个不同皮肤超组B HPV的扩增子的种类特异序列杂交。
用于本发明定型方面的合适的检测步骤例如，可包括固定扩增子以及通过例如Southern印迹探测其DNA序列。其他形式包括如上所述的EIA形式。为了便于检测结合，种类特异超组B HPV探针可包括标记部分，诸如荧光团，发色团，酶或放射性标记，从而促进探针与扩增反应产物的结合的监控。这种标记对本领域专业人员是众所周知的，并且包括例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，β-半乳糖苷酶，腊根过氧化物酶，链亲和素，生物素，地高辛，35S或125I。其他样品对本领域专业人员是一目了然的。
虽然可采用其他方法，本发明定型方法优选通过所谓的反系印迹(RLB)分析进行，诸如对粘向性(mucosotropic)HPV最新开发的分析(vanden Brule等，2002，J.Clin.Microbiol.40，779-787)。为此目的，RLB探针优选用5’氨基合成，随后固定在例如，羧基包被的尼龙膜上。RLB形式的优势为体系的方便及其速度，由此允许高通量样品处理。
本发明定型超组B HPV的方法可在相似样品材料上进行，如用于上述检测超组B HPV的材料。此外，根据本发明方法，定型超组BHPV可直接在扩增子或通过使用DNA扩增反应得到的DNA扩增反应产物上进行，如上文对检测超组B HPV所述。
因为本发明方法的两个方面在不同检测探针的应用中存在差异，在一个方面，本发明方法包括对疑似超组B HPV DNA的扩增，接着通过利用属类检测探针鸡尾酒而检测任何HPV的扩增子(即，检测感染有超组B HPV)，所述鸡尾酒共同与生成的所有超组B HPV扩增子杂交。在另一方面，本发明方法包括对超组B HPV DNA的扩增，接着在例如反系印迹分析中对24个HPV进行定型。因此，根据本发明方法，检测和定型可平行进行。
引物和探针在进一步方面，本发明提供一组双向扩增引物，用于在本发明方法中扩增超组B HPV-DNA。这些引物优选是寡核苷酸引物，序列长度为大约8到大约35，优选大约15到大约30，更优选大约21到大约28个核苷酸。在最优选的实施方案中，正向引物包括大约21个核苷酸，而反向引物包括大约28个核苷酸。优选地，其中一个引物标记有基团，以利于固定双链超组B HPV扩增子链中的一条，以及在甚至更优选的实施方案中，反向引物标记有生物素。
本发明双向引物的核苷酸序列的设计应允许在引物和靶DNA之间在如本文定义的超组B HPV基因组的L1 ORF中两个共有区域之一的位置处形成稳定的杂合体。另外，正向引物的核苷酸序列优选基本上互补于区域中的一个或多个超组B HPV的基因组中L1 ORF的反义链，所述区域如图2的正向引物区域所定义，而反向引物的核苷酸序列优选基本上互补于区域中的一个或多个超组B HPV的基因组中L1ORF的有义链，所述区域如图2的反向引物区域所定义。与此标准一致的引物例如示于图1中。当共同使用时，图1的引物将对在所有超组B HPV的基因组中的相应区域的DNA进行扩增。
本文引物的选择是“基本上”互补于(即，至少65％，更优选至少80％完全互补于)在各个待扩增的特异序列的不同链上存在的共有区域。有可能使用稍短或稍长的引物，或含有例如，肌醇残基或模糊碱基的引物序列，或者甚至与图1的引物序列比较时含有一个或多个错配的引物。一般而言，与图1的寡核苷酸序列显示至少65％，更优选至少80％同源性的序列被视为适用于本发明的方法。当利用低严格杂交条件时，序列错配也不是至关重要的。在本发明中，引物优选基本上互补于超组B HPV的L1 ORF中的两个共有区域中的至少一个的序列。
在另一方面，本发明提供用于属类检测超组B HPV-DNA的寡核苷酸探针。本文的检测探针的选择“基本上”互补于通过本发明扩增反应生成的双链DNA扩增子链中的一条。优选地，探针基本上互补于固定的，例如生物素标记的，从超组B HPV的L1 ORF生成的扩增子的反义链。
扩增子包括的区域特征在于共同的基元，以及在各种不同的超组B HPV之间的独特序列。用于检测这些扩增子的属类探针的设计是足够互补的，以与生成自一个或多个超组B HPV型的扩增子的任意链杂交。属类检测探针序列不需要反映任意扩增子链的真正序列，也不需要反映所有超组B HPV的实际序列。本发明在图3中现提供一组带有模糊碱基(摆动碱基)的探针，以利于它们与至少一亚组的生成自各种不同的超组B HPV的所有可能的扩增子结合。这使检测所有超组BHPV所需的属类探针数最小化。
本发明属类检测探针与其靶序列比较允许含有一个或多个错配。一般而言，与图3的寡核苷酸序列显示至少65％，更优选至少80％同源性的序列被视为适用于本发明的方法，用于属类检测所有超组BHPV的扩增子。所以，当参照图1和图3的引物或探针时，目的在于包括与图1和图3显示至少65％，更优选至少80％同源性的序列。
同样，图3中所列的互补序列在本发明方法中可合适地用作属类检测探针，前提是互补链在所用的扩增反应中扩增。
与有些超组B HPV型结合但不与其他超组B HPV型结合的探针可由本领域专业人员公知的方法生成。
为了便于检测，属类超组B HPV探针可包括标记部分，诸如荧光团，发色团，酶或放射性标记，从而促进探针与扩增反应产物的结合的监控。这种标记对本领域专业人员是众所周知的，并且包括例如，荧光素，氰蓝染料，β-半乳糖苷酶，腊根过氧化物酶，链亲和素，生物素，35S或125I。其他样品对本领域专业人员是一目了然的。用于本发明方法中的优选的属类超组B HPV探针的标记为地高辛(DIG)标记。
这些属类检测探针优选是寡核苷酸探针，序列长度为大约8到大约70，优选大约15到大约40，更优选大约25到大约35个核苷酸。在最优选的实施方案中，属类检测探针包括大约30个核苷酸。
仍在另一方面，本发明为种类特异性或选择性检测单个HPV型或属于超组B的HPV型的亚组提供寡核苷酸探针。在优选的实施方案中，为各个HPV型提供一个探针，因此这样的探针是种类特异的。本发明公开一组24个合适的种类特异探针序列，用于种类特异性检测图5中所示的特异超组B HPV。虽然有些错配是允许的，但是优选定型探针完全互补于其各自的靶序列。如上所述，图5中所示的互补序列也可在本发明方法中用作种类特异探针，前提是扩增反应能扩增互补DNA片段。所以，当参照图3和图5的探针时，目的在于包括其互补序列。
种类特异性或选择性检测探针可用于各种不同的定型步骤中。合适的步骤包括探针-靶被固定的情形，还可使用探针被固定的情形的步骤。作为后者的例子，可使用生物芯片形式，也可使用反系印迹形式，诸如RLB或系探针分析(line probe assay)。取决于固定基质和选定的表面化学，本领域专业人员能够挑选合适的基团标记寡核苷酸探针用于基质固定。在优选的实施方案中，该基团为在探针的5’-端导入的氨基基团。
种类特异性检测探针优选为寡核苷酸探针，序列长度为大约8到大约30，优选大约15到大约25，更优选大约19到大约23个核苷酸。由于使用属类检测探针的设计，本领域专业人员会意识到在一个杂交反应中所用的一组探针内，单个探针的退火温度通过提供G+C含量和探针长度之间的平衡可适当加以调整。
在一个实施方案中，本发明还提供包括实施本发明方法所用的引物和探针的试剂盒。这样的试剂盒的优选实施方案包括扩增引物，属类检测探针和种类特异探针，如在图1，图3和图5中分别公开。
下列非限制性实施例说明若干个本发明的实施方案。
实施例1超组B的HPV的扩增，EIA检测和RLB定型方法HPV测试组为了评价RLB定型方法的灵敏度和特异性，下列HPV型的质粒克隆子用作测试组HPVs 4，5，8，9，14，17，19，21，22，23，25，36，38，49，和50。
临床样本为了评价对临床样本的HPV检测和定型，使用福尔马林-固定的石蜡包埋的皮肤组织样品。利用所谓的夹心方法(Walboomers等，1999，J.Pathol.18912-19)切成一系列5μm切片。简而言之，外部切片被苏木素-曙红染色用于组织学分析，而将内部切片(在总约1cm2的组织中)置于试管中，用于PCR。加入250μl裂解混合物(10mMTris-HCl(pH7.5)，0.45％ Tween 20和500μg蛋白酶K(Roche，Mannheim，Germany))，并在37℃下温育过夜。样品被煮沸，在标准台式离心机(10,000rpm)上离心1分钟。冷却后，10μl用于PCR。
皮肤HPV超组B-PCR利用5个正向引物(即，5f，6f，7f，8f，9f；图1)和3个生物素酰化的反向引物(即，5r-bio，6r-bio，7r-bio，和8r-bio；图1)的混合物，对分离的HPV质粒DNA或预处理的样品进行PCR。50μl的PCR反应混合物含有1.5mM MgCl2，200μM各种dNTP，12.5pmol各种引物，1单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，以及各种不同浓度的HPV质粒DNA或10μl的样品粗提物的Taq Gold缓冲液(Perkin-Elmer，Foster City，CA)。利用PE 9700热循环仪(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行40个PCR循环。各个PCR反应的起始为预加热步骤，94℃下10分钟，接着40个由下列步骤组成的循环变性步骤(94℃下20秒)，引物退火步骤(38℃下30秒)，以及延伸步骤(71℃下80秒)。斜坡时间(ramping time)如前所述(van denBrule等，2002，J.Clin.Microbiol.40779-787)。终了延伸步骤延长4分钟。
酶免分析PCR产物利用链亲和素包被的微量滴定板(Roche，Mannheim，Germany)和如前所述(Jacobs等，1997，J.Clin.Microbiol.35791-795)温育过夜后的读出进行EIA，除了杂交温度使用55℃外。将3个DIG-标记的属类寡探针(即，SkinPR1-DIG，SkinPR2-DIG，以及SkinPR3-DIG；图3)的混合物用于杂交。
PCR产物的HPV反系印迹(RLB)利用先前对粘向性HPV型开发的体系(van den Brule等，2002，J.Clin.Microbiol.40779-787)，进行RLB分析。该体系是基于使用微型印迹仪(miniblotter)用于在羧基包被的尼龙膜上平行点样多达42个含有5’-氨基基团的不同寡探针。随后，多达42个PCR产物可被吸管吸入微型印迹仪的平行通道中，其方式是使通道垂直于先前沉积的寡探针的行。以此形式实施杂交，接着膜与抗生物素共轭物温育，以及检测增强的化学发光(ECL)。
为RLB选定的HPV-特异5’氨基连接的寡核苷酸(Isogen，Maarssen，The Netherlands)示于图5中。利用引物/探针选择软件(Oligo)，选择的方式使得Tm为(约)55℃，以及长度为约20bp。寡探针共价结合于带负电荷的膜(Biodyne C，Pall BioSupport，East Hills，NY)。简而言之，通过利用16％(wt/vol)EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；Sigma，St.Louis，MO)，膜被活化，并置于微型印迹仪体系(MN 45，Immunetics，Cambridge，MA)上。寡核苷酸施加在平行系列上，温育1分钟后，通道被抽气，而利用100mM NaOH使膜灭活，接着以补充有0.1％ SDS(BDH，Dorset，England)的2×SSPE(0.18M NaCl，10mMNaH2PO4和1mM EDTA(pH7.7)；Life Technologies，Rockville，MD)冲洗。
对杂交而言，10μl生物素酰化的PCR产物稀释在150μl的2×SSPE/0.1％ SDS中，热变性(96℃)，并在冰上快速冷却。PCR产物被吸管吸入垂直于寡探针的行的平行通道内。42℃下杂交1小时，接着51℃下以2×SSPE/0.5％ SDS冲洗两次。随后，在42℃下膜与链亲和素-过氧化物酶共轭物温育45-60分钟(1∶4000倍稀释的2×SSPE/0.5％ SDS；Roche，Mannheim，Germany)，在42℃下以2×SSPE/0.5％ SDS冲洗两次，并在室温下用2×SSPE/0.5％ SDS漂洗两次，共5分钟。检测方法是采用化学发光ECL检测液(Amersham，Buckinghamshire，England)，再曝光于膜(Hyperfilm，Amersham，Buckinghamshire，England)1-10分钟。随后显影膜。为了重复使用，膜的剥离方法是，在80℃下以1％ SDS冲洗两次，共30分钟，接着室温下在20mM EDTA(pH8)中温育15分钟。膜密封在塑料中，保存在4℃直至使用。
结果扩增超组B的HPV和随后EIA检测衍生自1ng的克隆HPVs 4，5，8，9，14，17，19，21，22，23，25，36，38，49，和50的PCR产物在所有情形下都显示清晰的EIA信号，然而，用人DNA没有观察到交叉反应性。这表明高度的特异性。利用混合有人胎盘DNA的克隆HPVs 5，8，21，和50的稀释系列，也可以对灵敏度很好地进行皮肤HPV超组B-PCR EIA；分析灵敏度范围为10fg(HPVs 5，和21)到100fg(HPVs 8和50)。同样，RLB定型显示了特异信号，没有交叉反应性，而灵敏度等于EIA，如果不是高于的话。
实施例2福尔马林-固定的临床样本的分析利用实施例1中所述的材料和方法，除了所用DNA分离自从87个DNA质量良好的皮肤样本(即，在β-球蛋白PCR中的阳性样品)中用福尔马林-固定和石蜡包埋的组织样品，对皮肤超组B HPV DNA的扩增进行测试。这些样品包括59个肾移植受体样品，其中有21例鳞状细胞癌(SCC)，23例基细胞癌(BCC)和15例光化性角化症(AK)。另29个样品获自免疫活性病人，包括13例SCC，12例BCC和4例AK。
用属类超组B探针进行EIA检测显示阳性率为病例的62％肾移植受体的样本中有76％，而免疫活性病人的样本中有34％。这些阳性率包括在获自肾移植受体的样品中有15/21病例的SCC(71％)，15/23病例的BCC(65％)，以及14/15病例的AK(93％)，以及在获自免疫活性病人的样品中有4/13病例的SCC(31％)，2/12病例的BCC(17％)以及4/4病例的AK(100％)。
通过RLB定型肾移植受体和免疫活性病人的SSC样品显示了在每个样品中有1-7个不同类型的HPV。合起来，下列19个HPV类型在一个或多个样品中得以检测HPVs 4，5，8，9，14，15，17，19，20，21，23，24，25，36，37，38，47，49，50。这些数据与文献公布的利用其他PCR体系从冷冻样本中获得的数据相一致(Shamani等，1996，J.Natl.Cancer Inst.88802-811；Berkhout等，J.Clin.Microbiol.33690-695；Forslund等，J.Gen.Virol.802437-2443；Harwood等，J.Med.Virol.61289-297；Meijer等，Cancer Detect.Prev.25533-547)。
实施例3
福尔马林-固定的临床样本的分析对另外42个肾移植受体的非黑素瘤皮肤癌分析皮肤超组B HPVDNA的扩增，如实施例2中所述，除了所有PCR产物通过EIA和RLB分析之外。用属类超组B探针进行EIA检测显示阳性率为这些病例的67％(28/42)，而RLB显示对24个测试HPV型中至少一个的阳性率为病例的88％(37/42)。检测的HPV型包括下列18个类型HPVs 4，5，8，9，12，14，15，19，20，21，23，24，25，36，37，38，48，和49。以降序排列，下列HPV类型是最普遍的HPVs 20，4，5，25，15，23，和14。同样，在这顺序中，还发现了多个HPV感染。这些数据暗示RLB比EIA更灵敏。
权利要求
1.检测皮肤超组B HPV的方法，包括下列步骤(a)提供怀疑藏有皮肤超组B HPV的样品；(b)提供多个双向引物对，基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA；(c)利用所述多个引物进行反应以扩增衍生自所述样品的DNA；以及(d)从所述样品中检测皮肤超组B HPV的DNA扩增产物。
2.权利要求1的方法，其中步骤(d)的实施是使所述DNA扩增反应的反应产物与多个属类皮肤超组B HPV探针杂交。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多个双向引物对包括基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA中的第一共有区域的引物，以及其中多个双向引物进一步包括基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA中的第二共有区域的引物。
4.权利要求3的方法，其中所述第一和第二共有区域位于皮肤超组B HPV的L1 ORF。
5.权利要求4的方法，其中所述第一和第二共有区域基本上如图2中所定义。
6.权利要求5的方法，其中所述多个引物对包括图1的引物。
7.权利要求6的方法，其中在所述多个双向引物对中，各个引物对之一包括生物素标记。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述扩增DNA的反应在降低的严格条件下进行。
9.权利要求2-8任一项的方法，其中所述多个超组B HPV探针基本上互补于来自所有超组B HPV的所述DNA扩增产物的核酸序列。
10.权利要求2-9任一项的方法，其中所述超组B HPV探针包括图3的探针。
11.权利要求10的方法，其中所述探针包括DIG标记。
12.定型皮肤超组B HPV的方法，包括下列步骤(a)利用多个双向引物对，通过扩增皮肤超组B HPV的DNA，提供DNA扩增产物；以及(b)通过使所述扩增产物与至少一个皮肤超组B HPV探针杂交从一个或多个超组B HPV型中检测DNA扩增产物，所述探针基本上互补于至少一个但不是全部皮肤超组B HPV型的DNA。
13.权利要求12的方法，其中所述多个双向引物对包括基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA中的第一共有区域的引物，以及其中多个双向引物对进一步包括基本上全体互补于所有皮肤超组B HPV的DNA中的第二共有区域的引物。
14.权利要求13的方法，其中所述第一和第二共有区域位于皮肤超组B HPV的L1 ORF中。
15.权利要求14的方法，其中所述第一和第二共有区域基本上如图2中所定义。
16.权利要求15的方法，其中所述多个双向引物对包括图1的引物。
17.权利要求16的方法，其中在所述多个双向引物对中，各个引物对之一包括生物素标记。
18.权利要求12-17任一项的方法，其中所述至少一个探针基本上互补于实际一种超组B HPV型的DNA。
19.权利要求12-18任一项的方法，其中所述至少一个探针选自图5的探针。
20.权利要求12-19任一项的方法，其中检测包括使用反系印迹。
21.用于前述权利要求任一项的方法中的双向引物，其中引物基本上全体互补于所有超组B HPV的L1 ORF中的第一和第二共有区域。
22.图1的双向引物。
23.用于检测皮肤超组B HPV的属类检测探针，其中探针基本上全体互补于在HPV 4的核苷酸位置6539-6610之间的所有超组B HPV的L1 ORF中的区域以及其他皮肤超组B HPV型的对应区域。
24.图3的属类检测探针。
25.用于检测皮肤超组B HPV型的检测探针，其中探针基本上互补于在HPV 4的核苷酸位置6539-6610之间的至少一个但不是全部皮肤超组B HPV型的L1 ORF中的区域以及其他皮肤超组B HPV型的对应区域。
26.用于检测皮肤超组B HPV型的种类特异性检测探针，其中探针基本上互补于在HPV 4的核苷酸位置6539-6610之间的实际一种皮肤超组B HPV型的L1 ORF中的区域以及其他皮肤超组B HPV型的对应区域。
27.图5的种类特异性检测探针。
全文摘要
本发明涉及检测和定型人乳头瘤病毒(HPV)的方法。具体而言，本发明涉及检测和定型超组B的皮肤HPV的方法，以及用于本发明方法中的引物和探针。本发明的显著优势在于，大量HPV型可在单个分析中进行检测，适用于固定的和保存差的材料，以及检测方法和定型方法可偶联在一起。
文档编号C12Q1/70GK1685065SQ03823091
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月26日 优先权日2002年9月26日
发明者克里斯托弗若斯·约安内斯·兰波特斯·玛芮亚·迈耶尔, 派绰斯·约瑟福斯·弗蒂南德斯·斯尼德斯 申请人:斯蒂汀病理学研究基金会