一种编码维生素b的制作方法

专利名称：一种编码维生素b的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型维生素B6磷酸磷酸酶(VB6P磷酸酶)基因，采用携带该基因的载体转化转化获得的重组微生物，以及具有VB6P磷酸酶活性的多肽。本发明还涉及一种采用重组微生物或多肽从VB6P中制备维生素B6的方法。
本发明中采用的“维生素B6”包括吡哆醇(pyridoxol)(在下文中称作PN)、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6是一种人和动物的必需维生素，它可作为药物的原料和饲料添加剂来使用。
本发明提供了一种采用从苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中克隆得到的新的VB6P磷酸酶基因(称作pdxP)转化获得的重组微生物。
本发明进一步提供了一种从VB6P中制备维生素B6的方法，其通过采用微生物的无细胞(cell-free)提取物(下文中称作CFE)，并将VB6P与(i)CFE、或(ii)在存在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+，或Ni2+的条件下从上述CFE中进一步纯化获得的酶制剂相接触，并从反应混合物中分离获得的维生素B6。
本发明提供一种能编码VB6P磷酸酶的分离的脱氧核糖核酸(DNA)，以及一种能通过导入携带该分离的DNA的载体从而从VB6P中生产维生素B6的重组微生物。
本文中所述的VB6P磷酸酶基因(pdxP)是指一种编码VB6P磷酸酶的基因，所述的磷酸酶能催化VB6P脱磷酸化成为维生素B6，并对吡哆醇磷酸盐(phosphate)和吡哆醛磷酸盐具高度底物特异性。
当术语“分离的”应用于DNA时，是指DNA被从天然的遗传环境中分离，从而其不含其他的无关的或不需要的编码序列，并且其呈适合在遗传工程蛋白生产系统中使用的形式。术语“一种分离的DNA”也可选的被称作“一种克隆的DNA”。
本文中所采用的术语“载体”是指一种线性或环状的DNA分子，它通常来源于质粒或病毒DNA，或该两者的元件兼而有之。所述的载体可以是一种独立于染色体复制的形式，或者也可以是一种当导入宿主细胞时，整合至宿主细胞基因组并与所整合的染色体一起复制的形式。
术语“重组微生物”是指采用包含了感兴趣的分离DNA的载体转化的任何微生物。本发明的重组微生物表达编码用于从VB6P中制备维生素B6的VB6P磷酸酶的基因。
VB6P磷酸酶基因的克隆采用适当的蛋白酶如胰蛋白酶来消化苜蓿根瘤菌的VB6P磷酸酶纯化蛋白，并采用高压液相色谱(HPLC)来分级收集获得的肽段。采用蛋白质测序仪来确定肽的氨基酸序列，并且根据氨基酸序列来合成简并引物。通过简并引物PCR来合成VB6P磷酸酶基因的部分片段。通过采用合成的部分片段作为探针来筛选基因组文库从而获得全长VB6P磷酸酶基因。
合适的DNA片段的一个例子是来源于苜蓿根瘤菌的，如SEQ ID NO9所示的核酸序列。
在苜蓿根瘤菌的情况中，完整的基因组序列已公布(EMBL登记号为NO.AL591688)，并且BLAST检索结果表明SEQ ID NO9所示的苜蓿根瘤菌S.meliloti的pdxP的DNA序列与登记号为No.AL591688中的472329-473036区域——开放阅读框SMc0l730互补对应，除了一个核苷酸的取代之外，即位置163上的核苷酸；但是开放阅读框SMc0l730中所示的多肽功能以前并未被确定。
可从任何生物体中分离苜蓿根瘤菌的pdxP的功能等价物，例如，但不仅限于百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)，其他细菌，酵母和植物。
本发明提供了如SEQ ID NO9所示的编码VB6P磷酸酶的DNA序列，和在标准条件下与SEQ ID NO9所示的序列杂交的DNA序列或其片段。
本文所述的术语“在标准条件下杂交的DNA序列”是指通过利用菌落杂交、噬菌斑杂交或Southern杂交获得的DNA，其中SEQ ID NO9所示的任何DNA序列均可作为探针使用。
杂交的“标准条件”在本文的上下文中是指本领域技术人员常规采用的用于检测特异性杂交信号的条件，或优选被称作严谨杂交和非严谨漂洗的条件，或更优选被称作中等严谨的条件，或者更进一步优选被称作严谨杂交和严谨漂洗的条件，上述条件均为本领域技术人员所公知。因此一个具体的实例为通过将DNA采用地高辛(在下文中称作DIG)DNA标记和检测试剂盒(Roche Diagnostics，东京，日本)，按照制造商提供的说明书进行杂交的方式来检测DNA。所述的杂交溶液含有50％甲酰胺，5×SSC(10×SSC由87.65g的NaCl和44.1g的柠檬酸钠配制成1升体积来构成)，2％封闭试剂(RocheDiagnostics，东京，日本)，0.1％N-十二烷基肌氨酸钠(lauroylsarcosine)，和0.3％十二烷基硫酸钠(在下文中称作SDS)。可在42℃下过夜进行杂交，并在室温下采用含有0.1％SDS的2×SSC漂洗两次，每次5分钟；并在50℃到68℃下采用含有0.1％SDS的0.1×SSC漂洗两次，每次15分钟。可根据制造商的说明来进行检测。
本发明还包括与SEQ ID NO9所示的DNA序列具有至少70％的同源性，优选至少80％，更优选超过90％的同源性的DNA序列或其片段。
宿主细胞和载体从VB6P中通过表达VB6P磷酸酶来重组生产维生素B6的合适的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，其选择仅受到其表达活性酶能力的限制。在一种具体实施例方式中，本发明采用了重组大肠杆菌(Escherichia coli)。作为宿主菌株，属于埃希氏菌属(Escherichia)的任何菌株均可采用，并且属于埃希氏菌属的微生物可从天然来源中分离，或者从培养中心购买。优选的，E.coli JM109(Takara，Shiga，日本)可被用于本发明。可在E.Coli中存在并用于表达E.Coli中的重组DNA的合适的载体包括，但不仅限于，pUC系列的质粒，pBR322和其衍生物如pKK223-3。
在另一具体实施例方式中，本发明采用了重组苜蓿根瘤菌(S.meliloti)。作为宿主菌株，属于根瘤菌属(Sinorhizobium)的任何菌株均可采用，并且属于根瘤菌属的的微生物可从天然来源中分离，或从培养中心购买。优选的，苜蓿根瘤菌(S.meliloti)IFO 14782(DSM 10226)可被用于本发明。作为在苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中表达重组DNA的载体，宿主范围广泛的载体，如pVK100，pRK290，pLAFR1或RSF1010均可采用。通过插入编码在苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中具有功能的启动子，如ptac，plac，ptrc，pS1(苜蓿根瘤菌小核糖体亚单位启动子)，或pNm(新霉素抗性基因启动子)的DNA片段。
通过按如下方式进行的三亲杂交方法可将用于整合pdxP的重组质粒导入苜蓿根瘤菌IFO 14782中。分别培养作为受体菌株的苜蓿根瘤菌，作为辅助菌株的携带辅助质粒的大肠杆菌，和作为供体菌株的携带供体质粒的大肠杆菌并进行混合。在平板上混合培养后，可在含有适当抗生素的琼脂平板上筛选接受了重组质粒的苜蓿根瘤菌。可通过从平板上生长的克隆中制备质粒并经核酸内切酶消化检测来筛选携带质粒的重组菌株。
根据本领域的标准技术实施构建重组载体的方法。本发明中，将pdxP置于ptac启动子调控下的pkk 223-3中以构建E.Coli中作为表载体的pKKpdxp。在另一实施方案中，将pdxP置于受ptac启动子调控的pVK100中以构建S.meliloti中作为表达载体的pVKptacpdxP。
多肽本发明还提供了具有VB6P磷酸酶活性的多肽和所述多肽的功能性衍生物。这类功能性衍生物被定义为在本发明的氨基酸序列的基础上通过添加、缺失和/或取代该序列的一个或多个氨基酸残基，其中所述的衍生物仍具有VB6P磷酸酶活性。这种功能性衍生物既可通过本领域已知的化学肽合成方法，又可通过在如本文所公开的DNA序列的基础上采用本领域已知的方法进行的重组途径来制备。本领域已知那些在蛋白和肽中通常不改变所述分子活性的氨基酸替换。最常见的替换为Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Ala/Glu，Asp/Gly及其反向替换。
此外，本发明的多肽还包括如SEQ ID NO10所示的多肽，特别是那些具有VB6P磷酸酶生物活性的，以及那些与SEQ ID NO10所示多肽具有至少70％同源性，优选至少80％，特别优选超过90％同源性的并且具有所述活性的多肽。
从VB6P中制备维生素B6本发明中获得的重组微生物可在含有可同化碳源、可消化氮源、无机盐、和生长所需的其他营养元素。作为碳源，例如，葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、糊精、或甘油均可采用。作为氮源，例如，蛋白胨、玉米浸泡液、大豆粉、酵母提取物、肉浸液、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿素、或其混合物均可采用。此外，对于微量元素，钙、镁、锌、锰、钴、和铁的硫酸盐、水合氯化物、或磷酸盐均可采用。并且，如果需要，传统的营养因子，作为捕获剂的磷酸铁、或止泡剂，如碳酸镁、氧化铝、水铝英石、动物油、植物油、或矿物油也可补充添加至发酵培养基中。培养基pH的为约5.0至约9.0。培养温度为约5℃至约45℃的范围。培养时间为约1天至约15天。在培养过程中，通风和搅拌常常能获得良好的效果。
具有VB6P磷酸酶活性的蛋白可以按照上述方法制备得到的培养物本身、培养物的无细胞提取物(CFE)、从CFE中分离的蛋白、或固定酶的形式来使用，用于从VB6P中制备维生素B6。整合至质粒的pdxP在适当的宿主细胞中的表达可通过从重组微生物的培养物中制备CFE和将其进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来进行分析。从VB6P中制备维生素B6的酶生产可通过将酶活性蛋白与水性培养基中的VB6P相接触来实现。所述的水性培养基可以是水性溶液，如果需要的话可以为缓冲液。将VB6P溶于水并加入至水性培养基中。从VB6P中制备维生素B6的生产可在pH介于5.5-9.0范围内的水性培养基中实现，优选7.0-8.0，其温度范围为15℃至45℃，优选30℃至40℃，并在存在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+的条件下培养15分钟至5小时。
在从VB6P中制备维生素B6后，可从反应混合物中分离和纯化生产的维生素B6。为了这个目的，可利用维生素B6的各种特性，采用常规用于从反应混合物中提取特定产物的方式来进行。例如，通过加热或加入变性剂如甲醇或乙醇来使蛋白质变性，并通过过滤从反应混合物中分离。滤液中的目的物质将被吸收至活性碳上，并随后经离子交换树脂进一步洗脱和纯化。可选的，可将滤液直接加样至离子交换树脂上，并且在洗脱后，目的产物可从乙醇和水的混合物中重结晶析出。可通过HPLC对反应混合物中产生的维生素B6的量进行定量分析。
通过参考下述实施例，将有助于本发明更详细的说明。
常规方法苜蓿根瘤菌IFO 14782可用作基因克隆实验中的染色DNA来源，和作为通过转化结合从VB6P中制备维生素B6的宿主菌株。大肠杆菌K-12的衍生物也可作为分子克隆实验和从VB6P中制备维生素B6的宿主菌株。大肠杆菌菌株在LB培养基(在下文中称作LB)中培养，所述的LB培养基含有1％的细菌培养用胰化蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，0.5％细菌培养用酵母提取物(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，和0.5％NaCl；同时，苜蓿根瘤菌在添加有0.061％的MgSO4·7H2O和0.036％的CaCl2·2H2O的LB培养基(在下文中称作LBMC)中培养。向培养基中添加细菌培养用琼脂(1.5％)用于制备琼脂平板。采用QIAGENMidi(QIAGEN GmbH，德国)试剂盒或采用自动DNA分离系统PI-50(KuraboIndustry Ltd.，日本)从大肠杆菌或苜蓿根瘤菌中分离质粒DNA。
采用QIAGEN genomic-tips分离染色体DNA。
按照制造商的说明来使用限制性酶、碱性磷酸酶、连接酶、大肠杆菌JM109和HB101感受态细胞(Takara Bio.Inc，Shiga，日本)，TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Japan K.K.，日本)。质粒pKK223-3购于AmershamBiosciences Corp.公司。为了进行限制性酶切分析，在琼脂糖凝胶中使DNA片段相互分开，并采用商业化的QIAEXII(QIAGEN GmbH)系统通过提取的方式从凝胶中分离得到。采用ALF DNA测序仪(Amersham Biosciences)来确定DNA序列。
实施例1VB6P磷酸酶基因的克隆(1)苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色体DNA的制备将苜蓿根瘤菌IFO 14782在LBMC上，在30℃下培养16小时。通过离心收集细胞，并采用QIAGEN genomic-tips分离染色体DNA。
(2)VB6P磷酸酶基因部分片段的获得为了设计用于通过采用简并PCR方法克隆VB6P磷酸酶基因的PCR引物，采用蛋白质测序仪来确定肽的N-末端和内部的氨基酸序列，得到了肽Fr60(SEQ ID NO1)，Fr64(SEQ ID NO2)，Fr70(SEQ ID NO3)和N-末端(SEQ ID NO4)。
通过简并PCR方法获得了编码苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶的DNA。采用了相应于苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO4)的CN02(SEQ ID NO5)作为正向引物。采用了相应于苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶内部氨基酸序列(SEQ ID NO2)的C642(SEQ ID NO6)作为反向引物。
根据Takara Shuzo的说明书来进行PCR反应。取苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色体DNA(0.1μg)作为模板，ExTaq聚合酶作为PCR聚合酶。PCR反应条件如下94℃5分钟，94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒共30个循环，72℃7分钟。反应后，取部分样品在1.5％(w/v)的凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳分析，并采用QIAEXII纯化一0.5-kb大小的产物，并将其克隆至pCR2.1TOPO。取3个不同独立的具有预期插入片段的克隆子来进行DNA测序，结果证实3个克隆子的插入片段的DNA序列几乎完全相同，并且从DNA序列推测得到的氨基酸序列包含SEQ ID NO1，2，3和4的全部氨基酸序列。将克隆子之一，phoC28用作下一步的研究。随后，根据phoC28的插入片段的DNA序列合成PCR引物C101(正义引物)(SEQ ID NO7)和C102(反义引物)(SEQ ID NO8)，并通过PCR引物获得VB6P磷酸酶基因的部分片段。PCR反应条件如下94℃5分钟，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒共30个循环，72℃7分钟。分别采用苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色体DNA(0.1μg)和ExTaq聚合酶作为模板和PCR聚合酶。通过PCR扩增得到的一预期约0.5-kb的产物被克隆至pCR2.1TOPO。作为DNA序列分析的结果，证实了获得了许多与phoC28序列完全一致的克隆子。将克隆子之一，携带苜蓿根瘤菌IFO 14782的VB6P磷酸酶基因部分片段的pC1用作下一步的实验。
(3)苜蓿根瘤菌染色体消化物的Southem杂交分析采用DIG DNA标记试剂盒，利用DIG-11-dUTP标记pC1的0.5-kb EcoRl片段，并将其作为Southern杂交分析的探针来确定适当的限制性酶，从而用于构建基因组文库。按照如下方法来进行Southern杂交分析。采用限制性酶来消化染色体DNA(3.4μg)，并取反应物在0.8％(w/v)的凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。采用真空印迹装置(Model 785 Bio-Rad)将DNA转移至浸于10×SSC中的尼龙膜上。该膜在杂交缓冲液中(50％甲酰胺，5×SSC，2％的封闭试剂，0.1％N-十二烷基肌氨钠，和0.3％SDS)先预杂交6小时，并随后在加入变性探针的缓冲液中42℃下过夜预杂交。在室温下采用含0.1％SDS的2×SSC漂洗印迹两次，每次5分钟；并在68℃下采用含0.1％SDS的0.1×SSC漂洗印迹两次，每次15分钟。采用DIG检测试剂盒来检测与探针杂交的DNA片段。结果是，在苜蓿根瘤菌染色体消化Southern杂交分析中，所述探针与2.3-kbSal I，3.5-kb EcoR I和7.0-kb Kpn I DNA片段杂交。
(4)苜蓿根瘤菌IFO 14782基因组文库的构建将EcoRI部分消化的染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析。从凝胶中回收15-至30-kb DNA片段，并将其与经EcoRI消化和经细菌碱性磷酸酶去磷酸化的pVK100连接。将连接产物用于体外包装反应，并将噬菌体颗粒用于感染处于生长对数期的大肠杆菌8767细胞。将细胞悬液涂布于含10μg/ml四环素(在下文中称作Tc)的LB平板上。获得抗Tc的克隆子并将其保存作为苜蓿根瘤菌IFO 14782的基因组文库。
(5)筛选苜蓿根瘤菌IFO 14782的基因组文库为了从如实施例1-(4)所制备的文库中筛选具有苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶基因的克隆子，将生长于10μg/ml Tc的LB平板上的克隆子转移至尼龙转移膜上(HybondTM-N+-Amersham Pharmacia Biotech)，并采用如实施例1-(3)所制备的探针进行菌落杂交。在苜蓿根瘤菌IFO 14782基因组文库的3000个克隆子中筛选获得了7个阳性克隆子。采用Q1AGEN-midi tip从阳性克隆子中制备得到质粒，并分别经限制性酶EcoR I和SalI消化。将消化后的质粒在1.0％(w/v)的凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳分析，并按照如实施例1-(3)所述的方法进行Southern杂交分析，结果证实探针与消化的质粒的2.3-kb SalI片段和3.5-kb EcoR I片段杂交。将阳性克隆子的携带有约24-kb EcoR I片段的质粒之一命名为pVEC1。
(6)VB6P磷酸酶基因测序将pVEC1的2.3-kb Sal I和3.5-kb EcoR I片段连接至pUC19，并分别将获得的质粒命名为pUCEC1和pUCEC19。pUCEC1和pUCEC19插入片段的核酸序列采用ALF DNA测序仪来确定。DNA测序结果表明，可观察到一编码包含SEQ ID NO1，2，3和4全部氨基酸序列的、由235个氨基酸组成的ORF的708-bp的序列。该结果表明，如SEQ ID NO9所示的708-bp序列相应于VB6P磷酸酶基因，并将该基因命名为pdxP。pdxP附近的染色体DNA限制性酶切图谱如

图1所示。
实施例2pdxP的表达和从VB6P中生产维生素B6(1)大肠杆菌中pdxP的表达为了在大肠杆菌中表达在tac启动子下调控的pdxP基因，构建了pKKpdxP质粒。利用advantage-HF PCR试剂盒(Clontech，USA)，采用10-pmol的引物，引物P101(SEQ ID NO11)和引物P102(SEQ ID NO12)，从100ng的苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色体DNA中扩增得到pdxP基因。反应条件如下在94℃持续15秒后，进行30个循环的94℃15秒，68℃4分钟。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用QIAEXII从凝胶中回收得到0.86-kb的DNA片段。利用TOPO TA克隆试剂盒将获得的0.86-kb片段克隆至CRII-TOPO载体中，并且检测获得的5个不同的候选克隆子的插入片段的DNA序列。结果是，候选者之一，携带准确的插入序列的TOPOpdxP105被用于进一步的研究。
将TOPOpdxP105中的0.86-kb Sma I片段按照允许pdxP在tac启动子调控下转录的方向连接至pKK223-3的Sma I位点中，并将获得的质粒命名为pKKpdxP(图2)。
随后，将两个不同的携带pKKpdxP的克隆JM109(即，JM109/pKKpdxP-1和JM109/pKKpdxP-7)接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)和1mg/ml维生素B6的LB培养基中。经1.5-小时培养后，通过加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷吡喃糖(IPTG)来诱导pdxP表达。在接着培养4.5小时后，收获细胞并将其悬浮于20mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液中，所述缓冲液含有15％蔗糖，1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM MnCl2，1-mM MgCl2和0.1mM苯基甲磺酰基氟化物(PMSF)。将细胞悬浮物在800kg/cm2的压强下进行细胞挤压破碎(French press)，并将获得的裂解物在4℃下35000×g离心60分钟从而除去细胞碎片。在采用同种缓冲液透析后，将上清液作为CFE使用。为了证实PdxP的表达，将CFE在12.5％(w/v)的凝胶上进行SDS-PAGE分析，并采用考马斯亮蓝染色(快速染色CBB试剂盒，nacalai tesque日本)。在大肠杆菌JM109/pKKpdxP-1中检测到预期分子量大小(29.0KDa)的多肽的过度表达，但是在大肠杆菌JM109/pKKpdxP-7中却没有观察到。随后，大肠杆菌JM109/pKKpdxP-1的CFE被用于进一步的研究。
(2)在重组大肠杆菌CEF中从VB6P中制备维生素B6通过采用如实施例2-(1)所述的方法制备的CFE，可进行从VB6P中制备维生素B6的生产。反应混合物含有50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，2mM吡哆醇5’-磷酸盐(PNP)，1mM MnCl2和125μl的CFE(0.5mg蛋白)。在37℃下反应15分钟，并通过HPLC采用4’-脱氧吡哆醇按下述的内标法来定量测定PN的量。为了制备HPLC的样品，200μl的100mg/l的4’-脱氧吡哆醇作为内标物，将50μl的60％高氯酸，和950μl的去离子水加入50μl的吡哆醇标准溶液或反应混合物中，并随后将混合物置于冰上10分钟。随后在15000rpm下离心混合物，并将上清液加样于如下层析柱中。分析条件如下层析柱Capcell pak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，日本)；移动相0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾，和2％乙腈(pH3.5)；层析柱温度30℃；流动速率，1.0ml/分钟；和检测器紫外线仪(292nm)。结果如表5所示。在含有JM109/pKKpdxP CFE的反应混合物中形成的PN的浓度为0.50mM，并且其比JM109/pKK223-3的浓度(0.37mM)高1.4倍。
表5JM109/pKKpdxP CFE中形成的PN的量
ND没有检测到(3)苜蓿根瘤菌中pdxP的表达采用Bgl II消化可移动粘粒pVK100，随后回收约21.3-kb的片段。在采用细菌碱性磷酸酶处理片段后，将来源于pKKpdxP的1.1-kb BamH I片段与BglII消化和去磷酰化片段连接产生质粒pVKPtacpdxP(图3)。随后通过三亲结合实验获得携带pVKPtacpdxP的苜蓿根瘤菌IFO 14782，并将所述细胞接种于含有1％葡萄糖，0.5％多聚蛋白胨，0.2％细菌培养用酵母提取物，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O，和0.001％FeSO4·7H2O的种子培养基中；并将种子培养物转移至含4％葡萄糖，2％多聚蛋白胨，0.2％细菌培养用酵母提取物，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O，和0.001％FeSO4·7H2O的葡萄糖-多聚蛋白胨培养基中，并在30℃下培养3天。通过离心收集细胞，并采用盐溶液洗涤，并悬浮于20mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液中，所述缓冲液含有15％蔗糖，1mM(DTT)，1mM MnCl2，1-mMMgCl2和0.1mM PMSF。将细胞悬浮物在800kg/cm2的压强下进行细胞挤压破碎(French press)，并将获得的裂解物在4℃下35000×g离心60分钟从而除去细胞碎片。在采用同种缓冲液透析后，上清液作为CFE使用。
(4)通过重组苜蓿根瘤茵CFE进行的从VB6P中制备维生素B6通过采用如实施例2-(3)中所制备的CFE来检测从VB6P中制备维生素B6的生产。反应混合物含有50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，2mM PNP，1mMMnCl2和125μl的CFE(0.4mg蛋白)。在37℃下反应30分钟，并通过如实施例2-(2)所述的HPLC来定量测定PN的量。结果如表6所示。在含有苜蓿根瘤菌IFO14782/pVKPtacpdxP CFE的反应混合物中，形成的PN的浓度为1.66mM，并且其比苜蓿根瘤菌IFO 14782中的浓度(0.41mM)高4倍。
表6苜蓿根瘤菌IFO14782/pVKPtacpdxP CFE中形成的PN的量
ND没有检测到序列表<110>罗奇维生素股份公司(Roche vitamins AG)<120>一种编码维生素B6磷酸磷酸酶的基因及其应用<130>NDR5234<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>1Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly1 5 10 15Glu Ala Ile Lys20<210>2<211>14<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>2Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Met Phe Glu Asp Leu Pro Arg1 5 10<210>3<211>23<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>3Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly Ile Asp1 5 10 15Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg20<210>4<211>10<212>PRT
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<221>CDS<222>(1)..(708)<223>
<400>9atg aag aag ctc gac cgc atg ccg acc cac gcc gaa ttc gcc cat gtc 48Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His Ala Glu Phe Ala His Val1 5 10 15acc gac tgg gtc ttc gac ctc gac aac acg ctc tat ccg cat cac gtc 96Thr Asp Trp Val Phe Asp Leu Asp Asn Thr Leu Tyr Pro His His Val20 25 30aat ctg ttc tca cag atc gac cgc aac atg acg gcc tat gtt gcc gaa 144Asn Leu Phe Ser Gln Ile Asp Arg Asn Met Thr Ala Tyr Val Ala Glu35 40 45ctc ctg tcg ctg gag cct gcg gag gcg aag aag ctg cag aag gaa tac 192Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Glu Ala Lys Lys Leu Gln Lys Glu Tyr50 55 60tac cgc gac cac ggc acc acg ctt cag ggc ctg atg ctt cat cac ggc 240Tyr Arg Asp His Gly Thr Thr Leu Gin Gly Leu Met Leu His His Gly65 70 75 80atc gat ccc aat gat ttc ctc gaa aga gcc cac gcc atc gac tat agc 288Ile Asp Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser85 90 95gtg gtg ccg gcc gat ccg gcg ctc ggc gag gcg atc aag gcg ctg ccc 336Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Lys Ala Leu Pro100 105 110gga cgc aag ttc atc ttc acc aac ggc agc gtc gcc cat gcg gag atg 384Gly Arg Lys Phe Ile Phe Thr Asn Gly Ser Val Ala His Ala Glu Met115 120 125
acc gcg cgg gcg ctc ggc att ctc gag cat ttc aac gac atc ttc gac 432Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ile Leu Glu His Phe Asn Asp Ile Phe Asp130 135 140atc gtc gcc gcc ggc ttc ata ccg aag ccc gcc ggc gac acc tac gac 480Ile Val Ala Ala Gly Phe Ile Pro Lys Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Asp145 150 155 160aag ttc atg ggc ctt cac cgc atc gac acg gcg aat gag gtg atg ttc 528Lys Phe Met Gly Leu His Arg Ile Asp Thr Ala Asn Glu Val Met Phe165 170 175gag gat ctg ccg cgc aac ctg gtc gtc cct aag gcg ctc ggc atg aag 576Glu Asp Leu Pro Arg Asn Leu Val Val Pro Lys Ala Leu Gly Met Lys180 185 190acg gtg ctg ctc gtg ccg cgc aat ctc gaa tac gag ttc gcc gag gcc 624Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Glu Phe Ala Glu Ala195 200 205tgg gaa acg tcg agc gac gcg gac gat cag atc gac tac gtc acg gaa 672Trp Glu Thr Ser Ser Asp Ala Asp Asp Gln Ile Asp Tyr Val Thr Glu210 215 220gac ctg gcg ggt ttc ctg cgc agt gtg att gtt tag 708Asp Leu Ala Gly Phe Leu Arg Ser Val Ile Val225 230 235<210>10<211>235<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>10Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His Ala Glu Phe Ala His Val1 5 10 15Thr Asp Trp Val Phe Asp Leu Asp Asn Thr Leu Tyr Pro His His Val20 25 30Asn Leu Phe Ser Gln Ile Asp Arg Asn Met Thr Ala Tyr Val Ala Glu35 40 45Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Glu Ala Lys Lys Leu Gln Lys Glu Tyr50 55 60Tyr Arg Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly65 70 75 80Ile Asp Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser
85 90 95Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Lys Ala Leu Pro100 105 l10Gly Arg Lys Phe Ile Phe Thr Asn Gly Ser Val Ala His Ala Glu Met115 120 125Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ile Leu Glu His Phe Asn Asp Ile Phe Asp130 135 140Ile Val Ala Ala Gly Phe Ile Pro Lys Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Asp145 150 155 160Lys Phe Met Gly Leu His Arg Ile Asp Thr Ala Asn Glu Val Met Phe165 170 175Glu Asp Leu Pro Arg Asn Leu Val Val Pro Lys Ala Leu Gly Met Lys180 185 190Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Glu Phe Ala Glu Ala195 200 205Trp Glu Thr Ser Ser Asp Ala Asp Asp Gln Ile Asp Tyr Val Thr Glu210 215 220Asp Leu Ala Gly Phe Leu Arg Ser Val Ile Val225 230 235<210>11<211>32<212>DNA<213>人工的<400>11gaagcttccc gggccgtgtc ataaacccgc cc 32<210>12<211>32<212>DNA<213>人工的<400>12caagcttccc gggatcatcg ccgggtttta cg 3权利要求
1.一种选自如下组的编码维生素B6磷酸磷酸酶的分离的DNA(a)如SEQ ID NO9所示的DNA序列；(b)一种编码具有维生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并且所述DNA在标准条件下能与(a)中所定义的DNA序列或其片段杂交；(c)一种编码具有维生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，其中所述多肽与SEQ ID NO10所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性；(d)一种编码具有维生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与SEQ ID NO9所示的DNA序列具有至少70％的同一性；(e)一种(a)至(c)中任意一项的简并DNA序列。
2.含有权利要求1所述的分离DNA的载体或质粒。
3.由权利要求1所述的分离的DNA编码的多肽。
4.一种能从维生素B6磷酸盐中制备维生素B6的Sinorhizobium或埃希氏菌属的重组微生物，其中所述微生物采用权利要求1所述的DNA或权利要求2所述的载体或质粒来转化。
5.权利要求4所述的微生物，其中所述的微生物为携带有pVKPtacpdxP的Sinorhizobium meliloti IFO 14782(S.meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP)。
6.权利要求4所述的微生物，其中所述的微生物为携带pKKpdxP的大肠杆菌JM 109(大肠杆菌JM109/pKKpdxP)。
7.一种制备具有维生素B6磷酸磷酸酶活性的无细胞提取物的方法，其包括培养权利要求4所述的微生物，其中所述微生物在含有可同化碳源、可消化氮源、无机盐、和其他微生物生长所需的营养元素的培养基中培养，pH值为约5.0至约9.0，温度为约5℃至约45℃，在需氧条件下培养1天至约15天，和破裂微生物细胞。
8.从维生素B6磷酸盐中制备维生素B6的方法，其包括在反应混合物中，将维生素B6磷酸盐与如权利要求4所述的微生物的无细胞提取物相接触，并从反应混合物中回收获得的维生素B6。
9.权利要求7或8所述的方法，其中所述的微生物为携带pVKPtacpdxP的Sinorhizobium meliloti IFO 14782(S.meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP)。
10.权利要求7或8所述的方法，其中所述的微生物为携带pKKpdxP的大肠杆菌JM 109(大肠杆菌JM109/pKKpdxP)。
全文摘要
本发明公开了一种选自如下组的编码维生素B
文档编号C12P17/12GK1685044SQ03823204
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月23日 优先权日2002年9月27日
发明者星野达雄, 长桥喜惠, 田副正明 申请人:Dsm Ip资产公司