制备具有抗高血压特性的肽的方法

专利名称：制备具有抗高血压特性的肽的方法
技术领域：
本发明是有关使用一种包含有约200kDa的细胞壁蛋白酶的乳酸菌，制备具有抗高血压特性的肽以及得到此乳酸菌的方法。
背景技术：
已经有报告指出在工业化国家中高血压(high blood pressure)是对于心脏病发作非常重要的一个危险因素，高血压通常是使用强效抑制血管紧张素转变酶(ACE)的药物予以治疗。早期预防高血压发展成为疾病，可以选择药物加以治疗，现在大量由食物取得的生物活性化合物也被考虑使用，用以促进一般人的健康状况。
血压的调节中，血管紧张素I-转变酶(ACE)扮演一重要角色，ACE的作用可以提升血压。在肾激素-血管紧张素系统，ACE将血管紧张素-I转换为血管紧张素-II，在激肽释放酶-激肽(Kallikrein-kinin)系统中，ACE不活化缓激肽(bradykinin)，有助于血管舒张作用，因此ACE抑制剂可用于降低血管压力，现在已有多种ACE抑制剂存在。第一个所报告的ACE抑制剂是在蛇毒中发现的天然肽，自此以后，有许多其它的ACE抑制剂也陆续被发现。
已知经由乳酸菌(LAB)发酵的牛奶可以产生抗高血压作用，这是由于乳酸菌的水解作用使得牛奶中的酪蛋白释放出肽，此肽作用如同ACE抑制剂。
Calpis Food Industry公司的发表论文[Yamamoto等人(1994，J.DairySci.，77917-922)]所述，利用纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus)CP790品种发酵牛奶，以产生抗高血压作用，是由于乳酸菌的纤维二糖乳酸杆菌蛋白分解作用使得牛奶中的酪蛋白释放出肽，此肽作用如同ACE抑制剂。这种肽的抗高血压作用已经测试于自发性高血压大鼠。利用没有蛋白分解活性的纤维二糖乳酸杆菌等基因的突变体发酵的牛奶，不能显示出任何抗高血压作用。
论文[Gobbetti M.等人(2000，Appl Environ Microbiol，66(9)，3898-3904.)]所述，是使用Lactococcus lactis亚种cremoris FT4或是使用Lactobacillus delbrueckii亚种bulgaricus SS1来发酵牛奶，以产生包含有ACE抑制肽的牛奶。
在专利案EP821968(Calpis Food Industry)中所述，是使用寄存编号为FERM BP-4835的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
于EP1016709(Calpis Food Industry)中所述，是使用寄存编号为FERMBP-6060的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
于WO01/32836(Valio Ltd)中所述，经由使用寄存编号为DSM13137的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
因为乳酸菌(LAB)是多种氨基酸营养缺陷型菌株，LAB依赖于复杂的蛋白质水解体系，以便从牛奶中的酪蛋白获得必要的氨基酸。使用LAB将酪蛋白水解成氨基酸是开始于藉由细胞壁蛋白酶水解酪蛋白成为寡肽，然后藉由寡肽传输系统将寡肽传输至菌胞内，一但寡肽进入到细胞内，细胞内的肽酶会将其水解成为自由氨基酸。
威斯康新大学(University of Wisconsin)与犹它州立大学(Utah StateUniversity)的论文[Pederson等(1999，J.of Bacteriology，1814592-4597)]中描述了来自纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种的prtH 204kDa细胞壁蛋白酶的DNA和氨基酸序列，但此论文没有叙述也不建议使用这一品种来制造具有抗高血压特性的肽。
Calpis Food Industry公司的论文[Yamamoto等(2000)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(6)1217-1222]中描述了来自纤维二糖乳酸杆菌CP790品种的prtY 45kDa细胞壁蛋白酶的DNA和氨基酸序列，CP790品种不包括prtH 204kDa细胞壁蛋白酶[参照Yamamoto等(2000)的“讨论”部分]。CP790品种是被使用于Calpis Food Industry的商业产品如“材料和方法”部分所记载，“CP790，是从Calpis培养菌原分离出来的，是日本发酵牛奶产品”。
发明概述本发明所要解决的问题是提供一种方法，以获得具有增进特性的乳酸菌(LAB)，特别是有关制造具有抗高血压特性的肽。
本发明的解决方案是基于本发明人已确定包含特定性质细胞壁蛋白酶的乳酸菌具有这样的特性。在此所指的细胞壁蛋白酶称为prtH200。本文实施例5中是说明具有prtH200细胞壁蛋白酶的乳酸菌于体内的情形，在此所述是其具有制造增进抗高血压特性的肽的功能。
在此所述的prtH200蛋白酶与威斯康新大学与犹它州立大学的论文[Pederson等(1999)](如上)所述的来自纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种的一prtH 204kDa细胞壁蛋白酶相符合，但在此论文中没有叙述也无建议使用CNRZ32品种来制造具有抗高血压性能的肽。
依据本发明人的了解，没有任何参考文件明白叙述包含有细胞壁蛋白酶的乳酸菌，该细胞壁蛋白酶对应于本发明例所述的prtH200蛋白酶。
实施例3是实验性说明使用寄存编号DSM 13137的纤维二糖乳酸杆菌品种如WO01/32836(Valio Ltd)所述，不包含prtH200细胞壁蛋白酶基因序列，其是由在此所述的特殊prtH200的PCR引物来识别，如Calpis FoodIndustry公司的论文[Yamamoto等(2000)]所叙述(如上)，在最新的日本发酵牛奶产品Calpis Food Industry包含一不具有prtH200细胞壁蛋白酶的品种(CP790)。
存在于乳酸菌中的基因序列编码成prtH200蛋白酶已被使用适当设计的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物(primer)的PCR扩增方法证实。当熟悉本领域的技术人员具有适当设计的PCR引物，对他而言，使用其一般知识来选择一特定适当的PCR扩增法去验证此基因序列是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
所以，熟悉本领域的技术人员可以筛选(screen)出乳酸菌的数量，验明包含有prtH200基因序列的乳酸菌，并因此得到具有改良工业相关特性的特选乳酸菌。
因此，本发明的第一个方面是有关一种获取乳酸菌的方法，包含(i)研究任一种乳酸菌，此乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中此基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PGR扩增方法来进行识别鉴定，所述PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC 3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’；和(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’；以及(ii)假如该乳酸菌符合步骤(i)标准，则可获得该乳酸菌；或(iii)假如该乳酸菌不符合步骤(i)标准，则重复步骤(i)研究其它乳酸菌，本实施例中的乳酸菌为纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种。
被称为“纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种”的品种描述于威斯康新大学与犹它州立大学的论文[Pederson等(1999)](如上)。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列如SEQ ID NO1及SEQ ID NO 2所示。
基于prtH200序列及其同源基因的适当PCR引物，可以为常规验证，以验证位于SEQ ID NO 1的prtH200基因及其同源基因，如下所述。
因此，本发明的第二个方面是有关一种获得乳酸菌的方法，包含(i)研究任一种乳酸菌，此乳酸菌包含一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中此基因序列定义为prtH200的基因序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性，此DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性；(c)一DNA序列，可编码一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段；以及(ii)假如该乳酸菌符合步骤(i)标准，则可获得该乳酸菌；或(iii)假如该乳酸菌不符合步骤(i)标准，则重复步骤(i)研究其它乳酸菌，本实施例中的乳酸菌为纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种。
如上所述，包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌的一优点为，可以增加有关制造具有抗高血压特性的肽的特性。
因此，本发明的第三个方面是有关制备具有抗高血压特性的肽的方法，此方法包含发酵食材，其包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白，经由乳酸菌作用使得发酵食材获得具有抗高血压特性的肽，其特征在于该乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，且此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定，此PCR引物选自[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]由下列组成的群组PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’；和(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
第四个方面，本发明是有关一种制备具有抗高血压特性的肽的方法，此方法是利用乳酸菌发酵一食材，其包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白，以得到一发酵食材，其包含具有抗高血压特性的肽，其特征在于此乳酸菌包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中此基因序列是定义为prtH200的基因序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性，此DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性；(c)一DNA序列，可编码一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
如上所述，依据本发明人(群)所拥有的知识，没有在任何参考文件有明白叙述如本发明第三、四方面的工艺中使用乳酸菌的作用。然而，可能需要更进一步实验验证乳酸菌，在本发明申请日前所述的应用，已使用在根据第三及第四方面的工艺中，但其并无包含有于此叙述的prtH200基因序列。在这类高血压案例中特定的乳酸菌将无法达到本发明的第三及第四方面的主张目标，换而言之，第三和第四方面将包含一声明，即可视为“例外的可能特定乳酸菌种”。
本发明的第五个方面是有关一种制备肽的工艺，包含(i)获得一乳酸菌，其是利用根据本发明第一与第二方面取得乳酸菌的方法取得；以及(ii)发酵一材料，其包含具有在(i)中获得的乳酸菌的蛋白质，以获得含有肽的发酵材料。
本发明的第五个方面的一个实施方案为制备具有抗高血压特性的肽的工艺，包含(i)获得一乳酸菌，其是利用根据本发明第一或/及第二方面取得乳酸菌的方法取得；以及(ii)发酵一食材，其包含动物性牛奶蛋白或植物性白，此食材具有在(i)中获得的乳酸菌，以获得含有抗高血压特性的肽的发酵食材。
如上放弃讨论的涉及本发明第三与第四方面的步骤，是与第五方面及其具体实施方案间并无重大关系。第五方面包含一对于现有所讨论的prtH200蛋白酶的乳酸菌活性研究的步骤。对于现有的背景而言，这是一新的步骤。
于此所生产的肽，可以用来制造具有抗高血压特性的发酵食品。
因此，本发明的第六个方面是有关一种制备含有具有抗高血压特性的肽的发酵食品的工艺，此工艺包含下列几个步骤(i)根据在此描述的制备具有抗高血压特性的肽的方法来制备一发酵食材；(ii)以适当方式包装此发酵食材，获得一功能性食品。
有关“包装”应该可以被广泛的了解，其是指当一食材被发酵而得到一发酵食材，此发酵食材可以被包装起来以提供给消费者。它可以被包装在一瓶子或一利乐包(tetra pack)内等，最好是在包装上或相对应的销售工具上能够指明此功能性食品具有抗高血压特性。
第六方面的工艺说明了以上所述的工艺的一个优点。使用所述含有prtH200蛋白酶的乳酸菌直接提供作为发酵作用，产生大量有用具有良好的抗高血压特性的肽。因此，就不需要更进一步的从发酵食材中纯化或再浓缩出肽。此发酵食材可以直接包装，并作为功能性食品直接提供到市场。
在本发明所述的第七个方面是有关具有抗高血压特性的肽，其是由在此描述的制备具有高血压特性的肽的工艺来取得。
经由所述的包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽，不同于不包含有这种蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽，这可验证包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽具有增加抗高血压效力的功能性。
于本发明所述的第八个方面是有关一种包含具有抗高血压的肽的功能性食品，其是由所述的制造功能性食品的工艺所取得。
于本发明所述的第九个方面是有关一种使用第七方面的具有抗高血压特性的肽，用以制造治疗高血压的药剂。
于本发明所述的第十个方面是有关一种使用第八方面的含有具有抗高血压特性的肽的功能性食品，用以制造治疗高血压的药剂。
定义在讨论本发明的具体实施方式
之前提供有关本发明主要方面的各特殊术语的定义。
术语“乳酸菌”的定义是指革兰氏阳性菌、无细菌芽胞增殖菌(non-sporingbacteria)的组群，其能使糖发酵而产生出乳酸。
根据惯用的定义，术语“基因”的定义为遗传的基本物理与功能单位。一种基因为在特定染色体的特定位置上的整齐序列的核甘酸(例如DNA或RNA)，以编码成一特定功能的产品(例如蛋白质或RNA分子)。
“退化引物的命名(nomenclature of degenerated primers)”是根据现有技术的标准命名法，Y＝C或T；R＝A或G；M＝A或C；K＝G或T；S＝G或C；W＝A或T；H＝A或C或T；B＝G或T或C；V＝G或C或A；D＝G或A或T；N＝G、A、C或T。
术语“片段”与DNA/氨基酸序列有关，是包含表示一连续的部分序列的片段。例如，在具有600个氨基酸的氨基酸序列的75至300位置。
术语“对应片段(corresponding fragment)”与比较二序列的片段的对应长度有关，优选的，此二片段比较后的长度差异少于50％；换而言之，假如一片段为100bp，另一片段则最好少于150bp。更优选的，此二片段比较后的长度差异小于25％，以及最优选的，此二片段比较后的长度差异小于5％。
本发明的具体实施方式
藉由实施例描述如下。


图1纤维二糖乳酸杆菌CHCC5951品种(寄存编号DSM 14998)的脉冲式凝胶电泳(PFGE)分析鉴定。
发明详述prtH200细胞壁蛋白酶存在于乳酸菌中的细胞壁蛋白酶的活性已被证实，一合适的策略是以在基因编码成细胞壁蛋白酶的分解中利用一致命突变(lethal mutation)构建一乳酸菌，然后此构建细菌的蛋白质水解活性(以下述适当检测)可与相同的野生型细菌(wild type bacterium)进行比较。实验证明具致命突变的乳酸菌与野生型细菌比较蛋白质水解活性减少，且此基因编码成细胞壁蛋白酶被分解为基因编码成一活性乳酸菌细胞壁蛋白酶。
熟悉本领域的技术人员知道如何利用适当的致命突变来构建一乳酸菌，其制造方式请参考如Pederson等人(1999)及Yamamoto等人(1994)的论文。
在本发明的申请日，国家生物技术信息中心(NCBI)在其网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供了进行一标准BLAST计算机序列同源性搜寻的可能性。
SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2所示的纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列已经公布在GeneBank数据库中，登记号为AF133727，且其数据库序列标识(database sequence identification)为gi/5758038/gb/AF133727.1/AF133727。
标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200氨基酸序列作为参考序列，其中，搜寻结果如下所示(斜体字代表数据库序列标识，此报告明白确认已发表的序列，且熟悉本领域的技术人员知道如何藉此得到这些序列)gi/129346/sp/P15293/P2P_LACLCPII型蛋白酶前驱物(Lactocepin)(细胞壁-结合丝蛋白酶)。
有机体Lactococcus lactis subsp.cremoris.
同一性一1600氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有50％的同一性。
gi/149582/gb/AAA25248.1/蛋白酶。
有机体Lactobacillus paracasei.
同一性一1632氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有49％的同一性。
gi/1381114/gb/AAC41529.1/(L48487)蛋白酶前驱物。
有机体Lactobacillus delbrueckii.
同一性一1682氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有32％的同一性。
gi/18568398/gb/AAL76069.1/(AF468027)细胞膜蛋白酶。
有机体Lactobacillus pentosus.
同一性一415氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有63％的同一性。
Gi/9963932/gb/AAG09771.1/AF243528_1(AF243528)细胞膜蛋白酶。
有机体Streptococcus thermophilus.
同一性一781氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有30％的同一性。
gi/482386/pir/A44833PII型蛋白酶前驱物(EC 3.4.21.96)。
有机体Lactococcus lactis.
同一性一264氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有61％的同一性。
这些特定的序列全部代表一DNA序列，其编码成一多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含至少200氨基酸(amino acids，aa)片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性。
标准核甘酸-核甘酸BLAST[blastn]搜寻是使用SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列作为参考序列，其中，搜寻结果如下所示gi/149580/gb/M83946.1/LBAMPRO.蛋白酶(prtP)基因。
有机体Lactobacillus paracasei.
同一性一102bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有84％的同一性。
gi/47197/emb/X14130.1/SLPRT763.质体pLP763 prt基因，细胞壁-结合丝蛋白酶。
有机体Streptococcus lactis同一性一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86％的同一性。
gi/472834/gb/M24767.1/STRWGPROT.Wg2蛋白酶基因。
有机体S.Cremoris同一性一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86％的同一性。
gi/149476/gb/J04962.1/LACPRASE.PIII型蛋白酶(prtP)及成熟蛋白质。
有机体Lactococcus lactis.
同一性一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86％的同一性。
gi/18568397/gb/AF468027.1/.细胞膜蛋白酶(prtP)基因。
有机体Lactobacillus pentosus同一性一102bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有83％的同一性。
这些特定的序列全部代表一DNA序列，包含至少75个碱基对(bp)片段，其与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性。
其它“指纹”基因序列(orfF3，orfF4及orfF1)在此讨论的prtH200基因序列可以看作乳酸菌(LAB)的“指纹”。
orfF3优选的，除了prtH200基因序列之外，乳酸菌还包括一含有称为orfF3开放读码框(open reading frame)的基因，此基因可视为一附加的指纹。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF3的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 3及SEQ ID NO 4所示。实施例3的研究显示基于适当的引物来确认orfF3。
因此，在一优选实施例中，在此段描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框，其中此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定，此PCR引物选自下列所组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’，(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’；和(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
上述合适的PCR引物可以基于在此揭露的序列进行识别确认。
因此，在一优选实施例中，在此段描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3)，其中定义为orfF3的DNA序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框，且此DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性；(c)一DNA序列，编码一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
术语“开放读码框(open reading frame)”表示为一DNA的延伸，其包含将足够长的氨基酸编码成一蛋白质的转译过程的开始讯号以及转译的终止讯号，并因此而验证一蛋白质编码基因的存在。
在本发明的申请日，一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 4的1-893位置所示的演绎orfF3氨基酸序列作为参考序列，且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而，无须受限于理论，在此描述的orfF3基因编码成一细胞壁蛋白酶为可信的，因此，在一优选实施例中描述的orfF3基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
orfF4优选的，除了prtH200基因序列之外，所述乳酸菌还包括一含有开放读码框的基因，在此称为orfF4。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF4的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 5及SEQ ID NO 6所示。实施例3显示了基于适当的引物来确认orfF4。
因此，在一优选实施例中，所描述的乳酸菌包括此prtH200基因和一基因序列(称为orfF4)编码成一开放读码框，其中此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定，此PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]orfF4(a)(S)5’GGTGTTGCTCCTGAAGC 3’(A)5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3’。
上述合适的PCR引物可以基于在此揭露的序列进行识别确认。
因此，在一优选实施例中，在此描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF4)，其中定义为orfF4的基因序列是DNA序列编码成一开放读码框，且此DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 5的1-4881的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性；(c)一DNA序列，编码一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 6所示的1-1627位置的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
在本发明的申请日，一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 6的1-1627位置所示的演绎orfF4氨基酸序列作为参考序列，且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而，无须受限于理论，在此描述的orfF4基因编码成一细胞壁蛋白酶是可信的，因此，在一优选实施例中描述的orfF4基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
优选的，在此描述的乳酸菌包括所叙述的prtH200基因、orfF3基因以及orfF4基因。
orfF1优选的，除了prtH200基因序列之外，所述乳酸菌还包括一含有开放读码框的基因，在此称为orfF1。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF1的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 19及SEQ ID NO 20所示。
因此，在一优选实施例中，在此描述的乳酸菌是包括此prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF1)，其中所述定义为orfF1的基因序列是DNA序列编码成一开放读码框，且此DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 19的1-5358的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性；(c)一DNA序列，其编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SFQ ID NO 20的1-1785位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；
(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 19的1-5358位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
在本发明的申请日，一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 20的1-1785位置所示的演绎orfF1氨基酸序列作为参考序列，且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而，无须受限于理论，在此描述的orfF1基因编码成一细胞壁蛋白酶是可信的，因此，在一优选实施例中描述的orfF1基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
优选的，在此描述的乳酸菌包括所叙述的prtH200基因、orfF3基因、orfF4基因以及orfF1基因。
脉冲式凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析鉴定另一个揭示所述LAB特征的适当方法是利用所谓的脉冲式凝胶电泳(PFGE)分析鉴定技术。
PFGE分析鉴定是一现有的标准技术，在此所偏好的模式是关于从关注的细菌中分离出独立染色体DNA，使用限制酶SmaI做完全消化和使用适当的MW标志在琼脂(agarose gel)上跑。于此所述的实施例7更详细叙述PFGE方案。
借助分析琼脂，可以定义所关注的LAB的特定DNA频带。如图1显示出于此所述优选的纤维二糖乳酸杆菌CHCC5951(寄存编号为DSM 14998)。图1和实施例7显示了CHCC5951的PFGE分析鉴定定义至少12个染色体的频带，这些频带是频带编号1283kbp频带编号2259kbp频带编号3219kbp频带编号4138kbp频带编号5127kbp
频带编号6119kbp频带编号7106kbp频带编号888kbp频带编号971kbp频带编号1059kbp频带编号1154kbp频带编号1246kbp一些已经获得相同的PFGE分析鉴定的菌种，包含于上述背景技术章节中所描述的Calpis Food Industry和Valio Ltd的菌种。
测试菌种中没有一个包含有与283kbp的频带编号1和219kbp的频带编号3二频带相同的结合；而且，测试菌种中没有一个包含有与46kbp的频带编号12相同者。
这些频带编码信息是用来负责改进所述乳酸菌的特性。
因此，在一优选实施例中所述的乳酸菌包含有prtH200基因以及，登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的PFGE分析鉴定为结合二种PFGE分析鉴定频带对应至283kbp频带和219kbp频带者，其中PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案，并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA跑电泳。
所称的“PFGE分析鉴定频带相对应至登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的特殊大小的PFGE分析鉴定频带”应该理解为DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌有可能视为参考品种，优选的，有兴趣的LAB必须制造相同PFGE鉴定分析(使用相同协议)与DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌。有兴趣的LAB的消化DNA和DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌据此都可以使用适当的MW标志在琼脂上跑电泳。藉由分析电泳琼脂，熟悉本领域的技术人员可以藉由基本法则判断有兴趣的LAB的频带对应于特定大小频带的DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌，如熟悉本领域的技术人员所熟知的，其大小上可能会有一些微细变异，在现有的内容，如此的微细变异最好在±5kbp之内，因此，如果DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的参考频带是例如283kbp，则相关的有兴趣的LAB的分析频带大小最好是283kbp±5kb。
在另一优选实施例中，于此所述的乳酸菌，包含有prtH200基因以及，登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的PFGE分析鉴定频带对应于PFGE分析鉴定46kbp频带者，其中PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案，并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA跑电泳。
更优选的使用相同方法分析乳酸菌，于此所述包含下列所有PFGE分析鉴定频带频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的283kbp频带；频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的219kbp频带；以及频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的46kbp频带。
最优选的，在此所述的乳酸菌包含对应至上面所述所有的纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的十二种PFGE分析鉴定频带。
聚合酶链反应(PCR)扩增如上所述，在此描述的基因序列的存在最好利用此使用PCR引物的PCR扩增来证实，且此PCR引物的设计是根据在此所教导的。当熟悉本领域的技术人员具有适当设计的PCR引物时，对他而言，使用一般知识来选择一特定适当的PCR扩增方案去验证这些基因是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
优选的，此PCR扩增方案(反应)是根据实施例1所描述的内容来制定。
一旦进行PCR扩增，研究产生的PCR扩展序列是否相当于在此段描述的基本片段，对熟悉本领域的技术人员而言，为其研究惯常的程序。由于熟悉本领域的技术人员一般概略地知道一阳性PCR片段会有多大的长度，所以通常可基于PCR片段的长度来进行验明，且阳性PCR片段与在此段描述的基因PCR片段有关。选择性地，PCR片段可以为DNA片段，然后产生的DNA序列可与在此揭露的序列相比较；再者，相当于此PCR片段的具有基因致命变种的乳酸菌可被制造，然后此制造细菌的蛋白质水解活性(参下面)可以与相对的野生细菌进行比较，且在此二细菌间的蛋白质水解活性的测量变化可被实验确认，而不管相当于扩展PCR片段的基因是否为一基因编码成一乳酸细胞壁蛋白酶，如此段所描述。
总之，不管一特定乳酸菌是否包含能给予相对阳性PCR片段的基因，熟悉本领域的技术人员可使用在此教导所设计的PCR引物来进行验明。
PCR是用来研究此基因是否存在于乳酸菌中最好的方式，然而，也可以以其它进行，例如，利用南方墨点分析法(Southern blot analysis)。
PCR引物如上述说明，关于PrtH200基因的适当PCR引物为PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’；和(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
PrtH200(a)(S)为SEQ ID NO 7所示；PrtH200(a)(A)为SEQ IDNO 8所示；PrtH200(b)(S)为SEQ ID NO 9所示；PrtH200(b)(A)为SEQ ID NO 10所示；PrtH200(c)(S)为SEQ ID NO 11所示；PrtH200(c)(A)为SEQ ID NO 12所示。
当使用(a)的引物时，此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长度应该介于400bp至800bp之间，更优选的长度则介于500bp至700bp之间。当使用(b)的引物时，此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长度应该介于200bp至500bp之间，更优选的长度则介于250bp至375bp之间。当使用(c)的引物时，此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长剫该介于400bp至800bp之间，更优选的长度则介于500bp至700bp之间。
最优选的PrtH200相关的PCR引物为编号(a)的引物以及编号(b)的引物。
如上述说明，关于orfF3的适当PCR引物为orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’，(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’；和(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
orfF3(a)(S)为SEQ ID NO 13所示；orfF3(a)(A)为SEQ ID NO14所示；orfF3(b)(S)为SEQ ID NO 15所示；orfF3(b)(A)为SEQID NO 16所示。
当使用(a)的引物时，此扩展的orfF3 PCR片段优选的长度应该介于1250bp至1900bp之间，更优选的长度则介于1500bp至1725bp之间。当使用(b)的引物时，此扩展的orfF3 PCR片段优选的长度应该介于1250bp至1900bp之间。更优选的长度则介于1500bp至1725bp之间。
最优选的orfF3相关的PCR引物为编号(a)的引物。
如上述说明，关于orfF4的适当PCR引物为orfF4(a)(S)5’GGTGTTGCTCCTGAAGC 3’(A)5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3’。
orfF4(a)(S)为SEQ ID NO 17所示；orfF4(a)(A)为SEQ ID NO 18所示。
当使用(a)的引物时，此扩展的orfF4 PCR片段优选的长度应该介于700bp至1150bp之间，更优选的长度则介于875bp至1025bp之间。
DNA序列的同源/一致性参照上述内容，DNA序列的同源/一致性由二序列，第一序列与第二序列，两者间的同一性差异程度所决定。
在本发明的申请日，国家生物技术信息中心(NCBI)将其提供至其网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，以供一标准BLAST计算机序列同源性的搜寻。
BLAST程序叙述于[Altschul等(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLASTanew generation of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.253389-3402]。
在本文中，优选的计算机同源搜寻程序为“标准核甘酸-核甘酸BLAST[blastn]”搜寻，且在本申请案的申请日，在NCBI网站已具有过滤性(filter)低复杂性；预期性(expect)10，及序列长度11等设定。
此参考序列采用此程序，且此程序一起验明已发表序列与一参考序列的对应片段间的同一性百分比。
使用标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序，在此描述的prtH200序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有60％的同一性；更优选的，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有70％的同一性；最优选的，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少100碱基对(bp)，优选的片段为至少200碱基对(bp)，更优选的片段为至少400碱基对(bp)，最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
使用标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序，在此描述的orfF3序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有60％的同一性；更优选的，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有70％的同一性；以及，最优选的，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少100碱基对(bp)，优选的片段为至少200碱基对(bp)，更优选的片段为至少400碱基对(bp)，最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
使用此标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序，在此描述的orfF4序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有60％的同一性；更优选的，含有至少75碱基对片段的DNA序列与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有70％的同一性；以及，最优选的，含有至少75碱基对片段的DNA序列与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少100碱基对(bp)，优选的片段为至少200碱基对(bp)，更优选的片段为至少400碱基对(bp)，最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
选择性地，此同源/一致性可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定，例如，在GCG程序软件包中所提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，Version 8，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。
使用GAP来进行DNA序列比对具有下列设定GAP创造罚分(creationpenalty)为5.0且GAP延伸罚分(extension penalty)为0.3，当使用GAP时，关于BLAST程序所提供的同一性百分比也可为优选的同一性。
氨基酸序列的同源(Homology to amino acid sequences)相似于核甘酸同源分析，在本文中，一优选的计算机同源搜寻程序为“标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]”搜寻，且在本申请案的申请日，在NCBI网站已具有成分统计是，过滤性低复杂性；预期性10，序列长度3，矩阵BLOSUM 62，间隔损失存在11延伸1等设定。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在此描述的prtH200序列是编码成一多肽(polypeptide)，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有40％的同一性；优选的，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有50％的同一性；更优选的，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有65％的同一性；最优选的，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ IDNO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少300氨基酸(aa)，较优选的片段为至少400氨基酸(aa)，更优选的片段为至少800氨基酸(aa)，最优选的片段则为至少1200氨基酸(aa)。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在此描述的orfF3序列编码成一多肽(polypeptide)，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有40％的同一性；较优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有50％的同一性；更优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有65％的同一性；最优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少300氨基酸(aa)，优选的片段为至少400氨基酸(aa)，更优选的片段为至少800氨基酸(aa)，最优选的片段则为至少1200氨基酸(aa)。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在此描述的orfF4序列是编码成一多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有40％的同一性；优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ IDNO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有50％的同一性；更优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有65％的同一性；最优选的，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有80％的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言，此片段通常为至少300氨基酸(aa)，优选的片段为至少400氨基酸，更优选的片段为至少800氨基酸，最优选的片段则为至少1200氨基酸。
选择性地，此同源性可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定，例如，在GCG程序软件包中所提供的GAP(Program Manual for the WisconsinPackage，Version 8，1994年8月，Genetics Computer Group，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453。
使用GAP来进行多肽序列比对具有下列设定GAP创造罚分为3.0且GAP延伸罚分为0.1，当使用GAP时，关于BLAST程序所提供的同一性百分比也可为优选的同一性。
杂交反应(Hybridisation)此杂交反应根据前文所预期包含一同功DNA序列(analogous DNAsequence)，其是杂交至一双股DNA探针。在一核甘酸探针与一同源DNA或RNA序列之间决定杂交反应为低严格性、中严格性或高严格性的适当实验条件包含，将含有欲杂交DNA片段或RNA的滤膜(fliter)预浸(pre-soaking)在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等.1989)溶液中10分钟，并将滤膜置于5×SSC、5×Denhard’s溶液(Sambrook等.1989)、0.5％SDS及100mu g/ml改质超声处理的鲑鱼精DNA(Sambroo等.1989)的溶液中进行预杂交(prehybridization)，随后在含有10ng/ml随机引物(Feinberg，A.P.andVogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.1326-13)、P-dCTP-标记(特定活性＞1×10cpm/mu g)探针的相同溶液中杂交12小时，且其温度为45℃。然后此滤膜在2×SSC、0.5％SDS溶液下清洗二次30分钟，其温度为至少55℃(低严格性)，优选的温度为至少60℃(中严格性)，仍为优选的温度为至少65℃(中/高严格性)，更优选的温度为至少70℃(高严格性)，以及最优选的温度为至少75℃(很高严格性)。
利用X光片(X-ray film)侦测在上述条件下的寡核甘酸探针杂交的分子。
包含蛋白质的发酵材料术语“包含蛋白质的材料”的相关表述如“包含具乳酸菌的蛋白质的发酵材料”，在此表示任何包含有蛋白质的材料皆可以使用乳酸菌使其增长和制造成为含有肽的发酵材料，需了解的是肽的取得必须是藉由乳酸菌细胞壁蛋白酶水解蛋白质而来。
举例而言，包含蛋白质的材料可以是适当的标准乳酸菌发酵介质如M17琼脂或MRS琼脂，此介质优选的是包含动物性牛奶蛋白，牛奶蛋白的构成要素举例而言，如同全脂或脱脂牛奶或牛奶酪蛋白。
食材本发明的食材包含动物乳汁蛋白质或是植物蛋白质。
优选的，食材包含有所列举的动物乳汁蛋白质，例如全脂或脱脂动物乳汁或乳汁酪白质等的乳汁蛋白质成分。
优选的，食材包含所列举的植物蛋白质，例如谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大豆、脱脂大豆或大豆蛋白质。
乳酸菌有关“乳酸菌”的命名是指革兰氏阳性菌、无细菌芽胞增殖(non-sporingbacteria)的组群，其能使糖发酵而产生乳酸。
其中，包括乳酸杆菌属乳酸菌(genus Lactobacillus)，例如纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusdelbruekii subsp.bulgaricus)等；乳酸球菌属乳酸菌(genus Lactococcus)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；链球菌属乳酸菌(genusStreptococcus)，例如嗜热性链球菌唾液亚种(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus)；明串球菌属乳酸菌(genus Leuconostoc)，例如乳酸明串球菌(Leuconostoc lactis)；双歧杆菌属乳酸菌(genusBifidobacterium)，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；以及片球菌属乳酸菌(genus Pediococcus)。
乳酸菌可用来作为含有其它微生物体的混合物，例如，酵母(yeasts)。
对于熟悉本领域的技术人员，许多不同的乳酸菌为可公开获得的，请参照德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，DSMZ)，以及国家生物技术信息中心(NCBI)的网际网络分类浏览器(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/.)。
为了验证识别一合适的具体乳酸菌，对熟悉本领域的技术人员而言是简单的日常工作，例如，取得足够数量的可公开获得的不同乳酸菌，并识别一或多种具体菌种，其包含在此讨论的基因序列。优选的，是利用在此描述的PCR扩增方案来完成的。
优选地，乳酸菌为一种杆菌门(phylum Firmicutes)的细菌，优选的是杆菌纲(class Bacillus)，更好的是乳酸杆菌目(order Lactobacillales)，在此目中的乳酸菌为一种乳酸杆菌科(family Lactobacillaceae)，优选的为乳酸杆菌属，更好地，它是一种纤维二糖乳酸杆菌种。有关分类法更进一步地详细说明记载于与Bergey细菌分类手册第二版第一册(Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology，Second Edition，Volume 1The Archea and theDeeply Branching and Phototrophic Bacteria)。
一个特别好的纤维二糖乳酸杆菌种(Lactobacillus helveticusstrain)CHCC5951的样品已经保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，取得的登记号为DSM 14998，保藏日为2002年5月15日。此保藏是根据国际认可的有关微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Micro organisms for the Purposes of PatentProcedure)的规定为了专利程序而做的。
所以，有关在此使用的乳酸菌的一优选实施例为登记号DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌。
在此关系中，本发明的一个独立方面是有关一种登记号DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
使用菌原材料是培养出DSM14998的菌种，熟悉本领域的阅读者可藉由一般的突变发展或再离析技术获得更进一步的突变体或衍生物，并保持适当的能力来制造具抗高血压特性的肽。
另外，一纤维二糖乳酸杆菌种(Lactobacillus helveticus strain)CHCC4080的样品已经保藏在DSMZ(徳国微生物和细胞培养物保藏中心，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)内，取得的登记号为DSM 14997，保藏日为2002年5月15日。此保藏是根据国际认可的有关微生物保存布达佩斯条约的规定为了专利程序而做的。
乳酸菌的蛋白水解活性(Proteolytic activity of the lactic acidbacteria)于此段描述的prtH200、orfF3及orfF4基因序列可视为指纹，其具有高度适合证明在此描述的乳酸菌。无须受限于学理，理论上，尽管在此描述的指纹基因序列无法展现任何有利的特性，一些品种仍然可以存在。
因此，一旦验证在乳酸菌中具有本文描述的指纹基因序列存在时，其是有利于测试乳酸菌的蛋白水解活性。在本文中，一个优选的乳酸菌是具有较佳的蛋白水解活性，详细说明如下。
在本文中，当一乳酸菌具有合成一活性细胞壁蛋白酶的能力时，此乳酸菌被认为具有蛋白水解活性；换而言之，证明蛋白酶可于细菌的细胞部分外的活性能力。再者，此蛋白酶应该具有使其降解(degrade)蛋白质(例如牛奶中的酪蛋白)的专一性能力，以得到具有抗高血压特性的肽。
优选的，一细菌的蛋白水解活性是利用一方案确定，包括下列步骤(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜；(ii)抽取(extract)产生的肽；以及(iii)测量此些抽取出肽的抗高血压特性，其是利用一基因检测法来测量需要抑制50％血管收缩素转化酶(ACE)活性的肽浓度。
所述ACE抑制活性检测法在此也称之为DL50，较低的DL50值即表示包含在本发酵食材中的肽的抗高血压效果较佳。
在该方案的步骤(i)中，优选的食材为新鲜牛奶；再者，细菌最好以1％v/v整夜的贮存培养菌方式灌注至食材中并维持于一适当的温度，这一适当温度为适合细菌生长的温度，针对特定的细菌，熟悉本领域的技术人员应知道如何确定。对于乳酸杆菌种，其适当温度为37℃，而对乳酸球菌种的适当温度则为30℃。
在实施例2提供了一详细的优选方案，以说明发酵及抽取步骤，并详细说明此DL50的ACE活性检测。
优选的，此乳酸菌具有蛋白质水解活性的能力的获知，这一方案包括下列步骤(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜；(ii)抽取产生的肽；以及(iii)测量此些抽取出肽的抗高血压特性，其是利用一基因检测法来测量需要抑制50％ACE活性(DL50)的肽浓度。
产生的肽的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
优选的，此乳酸菌为具有产生肽的ACE抑制活性(DL50)0.25至4.0(毫克/毫升)间的能力；更优选的，此蛋白质水解乳酸菌为具有产生肽或其它活性成分的ACE抑制活性(DL50)0.25至3.5(毫克/毫升)间的能力。
较低的DL50范围可以0.25毫克/毫升及1.0毫克/毫升代替。
发酵在本发明的制作过程中，所述食材是藉由乳酸菌在操作条件下进行发酵，其可依据食材的种类及/或乳酸菌的结合而予以变化。优选的，若食材并非为一水性溶液，则需将食材先溶解于一适当的水性溶液中，然后再与乳酸菌相混合，并以发酵方式培养。
乳酸菌的培养可藉由将预培养乳酸菌的菌原(starter)加入食材培养基(medium)来完成，其可先经过高温消毒(heat-sterilized)并冷却至一预设温度进行孵化。此乳酸菌菌原的最佳培养数量为105至107个乳酸菌/每毫升培养基；孵化的温度通常为20至50℃，优选的为30至45℃；孵化时间通常为3至48小时，且优选的为6至24小时。特别的是，此过程最好是在pH值3.5至7范围的培养基中进行孵化，且为了有效率地进行乳酸菌孵化，其pH值最好是在5至6之间。再者，为进行pH-饱和的孵化，其pH值最好维持在4至7的范围内。没有严格的限制，当乳酸菌的数量超过108个/毫升之时，此培养即可终止。
有关一制作过程的优选实施例，此食材的发酵是在每100毫升的食材中生产出0.5至25毫克具有抗高血压特性的肽或其它活性成分的情况下完成，更好的，是在每100毫升的食材中生产出1至5毫克具有抗高血压特性的肽。
自发酵食材取得的抗高血压特性的后续纯化(purification)呈上所述，在此描述的乳酸菌的使用，是直接提供进行发酵，以便于发酵后得到有用量的具有很好抗高血压特性的肽。
然而，在一些环境下，最好对自发酵食材取得的抗高血压肽进行一后续纯化步骤，例如，当肽被制作成一药片剂，其需要很高浓度的抗高血压肽。
因此，本发明的一实施例是与在此描述的使用有关，即发酵食材需经更进一步处理，以纯化或向上浓缩(up-concentrate)该具有抗高血压特性的肽。
举例而言，具有抗高血压特性的肽的发酵食材进行离心，并可对分离后的上层液(supernatant)以一反相树脂进行纯化处理以获得最后悬浮物，用以增加获得包含具有抗高血压特性的肽。
此离心分离法最好使用，例如，转速在2,000rpm至20,000rpm并持续1至20分钟，此离心分离法也可在一离心机中进行。
此取得的上层液更可进一步利用反相树脂(reverse-phase resin)进行纯化处理，以反相树脂对肽进行吸附及洗脱(elution)，及/或利用反相色层分析法(chromatography)，使得肽的纯度增加。
有关此反相树脂理论文献的更多的技术说明请参阅EP 821968。
选择性地，此发酵食材更可进行进一步处理，其方式为在发酵食材上进行纳米过滤(nanofiltration)，为了从发酵食材中去除乳酸或单价离子可以采用这种做法。
有关此纳米过滤理论文献的更多的技术说明请参阅WO 01/32905。
包含具有抗高血压特性的肽的功能性食品如上所述，是使用所述的包含prtH200蛋白酶的乳酸菌直接进行发酵，以得到大量有用且具有很好的抗高血压特性的肽。因此，并不一定要从发酵食材中更进一步的纯化或向上浓缩该肽，且发酵食材可以直接包装并如食品般于市场上供应，最好是以冷冻干燥形式存在的功能性食品或食品添加物等。
在实施例6中该说法将获得验证。简言之，实施例6的结果显示，无需任何其它处理，发酵牛奶本身即具有良好的降低血压功效。另外，经冷冻干燥的发酵牛奶可悬浮于中性牛奶中，进而可产生一适当的功能食品，此经冷冻干燥的发酵牛奶可因而被视为一适当的食物添加剂产品。
因此，本发明的实施例是有关一功能性食品的制作过程，其包含具有抗高血压特性的肽，此食品的制作方法包括下列步骤(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材；(ia)将此发酵食材进行干燥；以及(ii)以适当方式包装此发酵食材，以得到一功能性食品。
其中，步骤(ia)最好使用冷冻干燥法。
换而言之，对于最终的功能性食品不需要再做任何处理，其也可以有一特性为包含一重要部分即发酵过程中所存在的乳酸菌，实施例6清楚的表示这样的产品具有良好的功能和在功能性食品中存在有乳酸菌具有实质的优点。
因此，本发明的实施例是有关一种功能性食品的制作过程，该功能性食品包含具有抗高血压特性的肽，制作方法包括下列步骤(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材；
(ia)保留小部分的乳酸菌于发酵食材的发酵过程中；以及(ii)以适当方式包装此发酵食材，以得到一食品或食品添加物。
“保留小部分的乳酸菌于发酵食材的发酵过程中”如上所述可以解释为不需要考虑移除乳酸菌。一些细菌可能需要移除。数量上，在发酵食材的发酵过程中可能至少需要保留5％的乳酸菌存在；或是在发酵食材的发酵过程中保留至少20％的乳酸菌存在。
如实施例6所示，保留在功能性食品中的乳酸菌可能为死掉或有活性的，由于热处理的发酵食材也可以有良好的降血压特性，所以更优选的为来自于发酵食材的抗高血压肽可经过适当的纯化作用。
因此，本发明的实施例是有关一功能性食品的制作过程，此食品包含具有抗高血压特性的肽，制作方法包括下列步骤(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材；(ia)步骤(i)的发酵食材更进一步的经过如上所描述的方式纯化或向上浓缩具抗高血压特性的肽；(ib)然后在食材中加入经步骤(ia)纯化或向上浓缩的肽；以及(iv)以适当方式包装此发酵食材，以得到一功能性食品。
更优选的，步骤(ib)的食材是如所述的制造过程的发酵食材，这相关于哪一种功能性食品需要具有相对较高浓度的具有抗高血压特性的肽的情形。
具有抗高血压特性的肽的使用与优选剂量利用本发明方法获得具有抗高血压特性的肽，其通常为肽混合物，且可能包含有其它肽。使用于食物或饮料中，可以直接使用包含有肽及/或纯化产品的发酵食材，选择性地，使用前药剂可以藉由冷冻干燥，喷雾干燥或鼓风机干燥而成为粉末形式。
本发明的抗高血压肽的优选有效用量与人的年龄与状态有关，剂量为0.05到10毫克/千克体重/日，优选的则为0.3到3.0毫克/千克体重/日。如果剂量没有低于0.05毫克/千克体重/日，可以预期有足够的效用；如果剂量没有大于10毫克/千克体重/日，此效用可能有效地显现作用。
使用于胆固醇降低疗法(Teo，K.等，Circulation(2000)1021748-1754)的论文描述ACE抑制药物(Emalapril)可能具有对降低胆固醇的治疗有正面效用，特别是降低冠状动脉粥样硬化性(coronary atherosclerotic)疾病。
因此，本发明的一独立观点是有关使用含有抗高血压特性的肽，其是由本发明的制程所制造出的药剂或功能性食品，用于胆固醇降低疗法，特别是关于降低冠状动脉粥样硬化性(coronary atherosclerotic)疾病。

发明内容
与实施方案所呈现的专利范围本发明的实施例及观点可以显示于所谓的权利要求格式中，本发明的一些内容与实施例以下述的权利要求形式呈现。
1.一种获得乳酸菌的方法，包括(i)研究任一种乳酸菌，此乳酸菌是包含有一基因序列编码成为一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中该基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定，该PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’；及(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’；及(ii)假如乳酸菌符合步骤(i)的标准，则获得了该乳酸菌；或
(iii)假如乳酸菌不符合步骤(i)标准，则重复步骤(i)研究其它乳酸菌。
2.权利要求1所述的获得乳酸菌的方法，其中在步骤(i)中也包含研究任一乳酸菌包含有基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框，其中该基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定，且该PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’，(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’；及(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
3.一种获得乳酸菌的方法，包括(i)研究任一种乳酸菌，该乳酸菌是包含有一基因序列编码成为一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中该基因序列定义为prtH200为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性，且该DNA序列选自由下列组成的群组(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性。
(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段；以及(ii)假如乳酸菌符合步骤(i)标准，则可获得该乳酸菌；或
(iii)假如乳酸菌不符合步骤(i)标准，则重复步骤(i)于其它乳酸菌中。
4.权利要求3所述的获得乳酸菌的方法，其中在该步骤(i)中也包含研究任一乳酸菌包含有基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框，其中该基因序列定义该orfF3为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框，且该DNA序列选自下列组成的群组(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性。
(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
5.权利要求1到4中任一获得乳酸菌的方法，其中该乳酸菌具有蛋白质水解的能力，其方法包含下列步骤(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜；(ii)抽取产生的肽；以及(iii)测量这些抽取出肽的抗高血压特性，其是利用一基因检测法来测量需要抑制50％ACE活性的肽浓度；产生的肽具有的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
6.前述任一项权利要求所述的获得乳酸菌的方法，其中该乳酸菌为杆菌门的细菌，优选为杆菌纲，最优选为乳酸杆菌目。
7.权利要求6所述的获得乳酸菌的方法，其中该乳酸杆菌目的细菌为乳酸杆菌科，优选为乳酸杆菌属，最优选为纤维二糖乳酸杆菌。
8.权利要求7所述的获得乳酸菌的方法，其中该细菌为具有登记号为DSM14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变体。
9.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法，该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的食材，以获得含有抗高血压特性的肽的发酵食材，其特征在于该乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中该基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定，该PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sensesequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’；及(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
10.权利要求10所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中该乳酸菌更包含有一基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框，其中该基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定，该PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’，(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’；及(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
11.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法，该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性奶蛋白或植物性蛋白的食材，以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材，其特征在于该乳酸菌包含有一基因序列编码成细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中该基因序列定义为prtH200为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性，该DNA序列选自下列组成的群组(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性；(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
12.权利要求11所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中该乳酸菌更包含一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3)，其中该基因序列定义为orfF3的DNA序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框，且该DNA序列选自下列组成的群组(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性；(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸的片段，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
13.一种制备肽的方法，包括(i)根据权利要求1到8任一项的获得乳酸菌的方法获得一乳酸菌；以及(ii)使用在步骤(i)获得的乳酸菌发酵含蛋白质的材料，以获得含肽的发酵材料。
14.权利要求13所述的制备肽的方法，其中该方法为一制造具有抗高血压肽的工艺，包括(i)根据权利要求1到8的获得乳酸菌的方法，以获得一乳酸菌；以及(ii)使用在步骤(i)获得的乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的发酵食材，以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材。
15.权利要求9到14任一项所述的制备肽的方法，其中该食材包含动物性牛奶蛋白。
16.权利要求15所述的制备肽的方法，其中该动物性牛奶蛋白为酪蛋白。
17.权利要求15所述的制备肽的方法，其中该食材为牛奶或牛奶制品。
18.权利要求9到17任一项所述的制备肽的方法，其中该乳酸菌具有蛋白质水解活性的能力，在一方案包括下列步骤(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜；(ii)抽取产生的肽；以及(iii)测量这些抽取出肽的抗高血压特性，其是利用一基因检测法来测量需要抑制50％ACE活性(DL50)的肽浓度；产生的肽的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
19.权利要求9到18任一项所述的制备肽的方法，其中该乳酸菌为杆菌门的细菌，优选为杆菌纲，更优选为乳酸杆菌目。
20.权利要求19所述的制备肽的方法，其中该乳酸杆菌目的细菌为乳酸杆菌科，优选是乳酸杆菌属，更优选是纤维二糖乳酸杆菌。
21.权利要求20所述的制备肽的方法，其中该细菌为登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
22.权利要求9到21任一项所述的制备肽的方法，其中该发酵食材完成时的情形是，每100毫升的食材含有0.5到25毫克的具有抗高血压特性的肽。
23.权利要求9到22任一项所述的制备肽的方法，其中该食材的发酵需要在摄氏20到50度中发酵3到48小时。
24.权利要求9到23任一项所述的制备肽的方法，其中该发酵食材是在酸碱值在pH3.5到7间的情况下进行。
25.权利要求9到24任一项所述的制备肽的方法，其中该发酵食材更可进行一纯化或向上浓缩该具有抗高血压特性的肽。
26.权利要求25所述的制备肽的方法，其中该发酵食材经离心并获得分离出的包含具有抗高血压的肽的上层液。
27.权利要求26所述的制备肽的方法，其中该肽是藉由反相树脂纯化该上层液。
28.权利要求25所述的制备肽的方法，其中该发酵食材可进行一纳米过滤处理。
29.一种制备含有抗高血压特性的肽的功能性食品的方法，该方法包括下列步骤(i)根据权利要求9到24任一项所述的方法来制备一发酵食材；以及(ii)以适当方式包装该发酵食材，以得到一功能性食品。
30.权利要求29所述的制备功能性食品的方法，更进一步的包含下列中间步骤[介于步骤(i)和(ii)之间](ia)权利要求20的步骤(i)的发酵食材进一步地按照权利要求25到28任一项所述纯化或向上浓缩该具有抗高血压特性肽的过程；以及(ib)然后将经步骤(ia)的纯化或向上浓缩的肽添加于一食材上。
31.权利要求30所述的制备功能性食品的方法，其中该权利要求21的步骤(ib)的食材为根据权利要求9到24任一项的制造发酵食材的方法制备的发酵食材。
32.一种具有抗高血压特性的肽是藉由权利要求25到28任一项所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法而获得的。
33.一种包含具抗高血压特性的肽的功能性食品是藉由权利要求29到31任一项所述的制备功能性食品的方法而获得的。
34.使用权利要求32所述的具有抗高血压特性的肽制造一药剂用以治疗高血压。
35.使用权利要求33所述的包含具抗高血压特性的肽的功能性食品制一药剂用以治疗高血压。
36.一种具有登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
实施例假如没有另外说明，每一个步骤皆可使用标准方法来进行，此标准方法例如是描述在一般教科书中的(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.″Molecular Cloning.A laboratory manual″.Cold Spring HarborLaboratories，2nd Edition/3 Volume，1989；Ausubel，F.M.，等(eds.)″Current Protocols in Molecular Biology″.John Wiley和Sons，1995.)。
实施例1PCR扩增反应模板DNA(template DNA)是藉由苯酚-氯仿(phenol-chloroform)反应取得，如前面所述述(Marmur(1961，Journal of Molecular Biology，3，208-218)。此最终制备是在TE缓冲液+RNAse中的基因组模板DNA。
此PCR反应的制备如下所述(i)1.0μl的模板DNA1.0μl的前置引物(forward primer)(5pmol/μl)1.0μl的反置引物(reverse primer)(5pmol/μl)1.0μl 2.5mM的dNTD(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物)5.0μl Mg缓冲液(20mM MgSO4)0.5μl DNA聚合酶(Pwo，100U)10.5μl水(H2O)(ii)PCR扩增的热程序是在94℃下1分钟30个循环，在50℃下90秒(当引物Tm在55℃左右)，55℃下90秒(当引物Tm在62℃左右)，45℃下90秒(当引物Tm在50℃左右)以及在72℃下1分钟。在30个循环完成后，这些样品在4℃下进行冷却。
(iii)此PCR产品在60V、1.5％琼脂糖凝胶(agarose gel)上跑电泳，在紫外光下自琼脂糖凝胶中分离，并根据制造商操作指南(Qiagen，Cat.No.28704)来使用器材QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。
实施例2蛋白水解(ACE)活性分析贮存培养菌(stock culture)的制备乳酸杆菌(Lactobacillus)种是形成在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MRS agar)上，并在厌氧性(anaerobically)、37℃的环境下培养48小时，选择单一菌落(colony)，再接种至MRS培养液中，并于37℃下成长整晚。乳酸杆菌种是形成在M17琼脂上，并在好氧性(aerobically)、30℃的环境下培养48小时，选择单一菌落，再接种至M17培养液中，并于30℃下过夜培养。准备来自隔夜的贮存培养菌，将其贮存在-80℃的20％甘油中。
发酵牛奶的制备与肽的抽取将实施例1的隔夜贮存培养菌(1％v/v)接种至200毫升新鲜牛奶中进行发酵，并依据使用的菌种保持温度整夜在37℃或30℃。
在该新鲜牛奶中，肽的抽取可藉由使用下列方案来达成-在室温下进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上层液，并以NaOH调pH值至8.3(ACE活性试验的最佳pH值)。
-在室温下对取得的上层液进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上层液(乳浆)，其包含肽。
-利用Lowry试验(Lowry等，1951.J.Biol.Chem.，193265-275)，测定在乳浆中的肽浓度(每毫升乳浆中含有的肽毫克数)。
此乳浆直接以ACE分析并在-20℃下冷冻，且此乳浆浆包含肽成分，其在实施例3中称为“肽溶液”。
ACE活性分析发酵牛奶中的肽进行体外(in vitro)ACE活性试验。肽浓度为DL50(mg/ml)，其抑制50％的ACE活性，较低的此值是具有较佳的发酵牛奶的抗高血压功效。抽取出的肽是以下列的方案来进行量测此试验分析主要是ACE退化一HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)基质，并加入染色剂(color reagent)进行染色。若存在有肽，此肽抑制ACE，并有较少的HHL基质退化，也就是在加入染色剂之后，形成有较少的颜色。
溶液制备培养缓冲液(Incubation buffer)188mmol/l硼酸，pH值8.3，及1.375mmol/l的氯化钾。(将2.91克硼酸与25.63克氯化钾溶解在200ml的蒸馏水中，以1mol/l的氢氧化钾(potassium hydroxide)将pH值调整为8.3，并以蒸馏水稀释至250毫升；贮存在室温下)。
基质溶液(Substrate solution)5.8mmol/l的HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)。(将250毫克的HHL溶解在约90毫升的培养缓冲液中，并以相同缓冲液填充成100毫升，40℃贮存，此基质溶液可使用至少2星期)。
停止溶液(Stop solution)100mmol/l的HEPES，pH值为9，2.5mmol的EDTA。(将23.83克的HEPES与0.93克的EDTA溶解在800毫升的蒸馏水中，以1mol/l的氢氧化钠将pH值调整为9，并以蒸馏水稀释至1升。室温贮存。)染色剂136mmol/l的三聚氯氰(cyanuric chloride)在1，4-二氧杂环乙烷(1，4-dioxane)中。(将12.50毫克的三聚氯氰溶解在400毫升的1，4-二氧杂环乙烷中，并以1，4-二氧杂环乙烷填充至500毫升，贮存在室温下及暗棕色玻璃瓶内)。
分析(所有溶液先平衡至室温)-制造一经由培养缓冲液连续稀释的肽溶液，连续6次稀释将未稀释的肽溶液稀释至完全(只有培养缓冲液)。
-对每次稀释而言，于一玻璃管中放置10μl的肽溶液、40μl的基质(HHL)溶液(2.5g/l)以及2.5μl的ACE(0.25单位/毫升)。
-阳性对照包括2.5μl的ACE、10μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-阴性对照包括12μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-在37℃下培养1小时。
-加入300μl的停止溶液停止反应，随后以150μl的染色剂混合。
-容许其沉积5分钟，并在室温下以3300g离心30分钟，以去除变质的蛋白质和过量的三聚氯氰。
-搬移每一样品的300μl上层液至微量滴定盘(microtiter plate)的孔洞中。
-在405nm下对照水进行读取。
ACE抑制百分比是以下列公式表示 每次稀释具有其所属的ACE抑制百分比值，其是提供一曲线表示ACE抑制百分比与乳浆的肽浓度的函数。DL50(具50％抑制活性的肽浓度)的获得是藉由读取位在该曲线与轴上对应的50％ACE抑制点的交叉点的肽浓度而得到。
实施例3分析prtH200，orfF3与orfF4基因序列在不同细菌中的存在研究不同乳酸菌种中prtH200、orfF3与orfF4基因序列的存在。进行在实施例1所描述的PCR反应，表1a显示利用PCR引物组用来研究prtH200基因编码成一蛋白酶的存在。表1b显示利用PCR引物组用来研究orfF3基因存在。表1c显示利用PCR引物组用来研究orfF4基因存在。
在这些表中也提供扩增PCR片段的预计长度，且该预计长度是基于prtH200 SEQ ID NO 1，orfF3 SEQ ID NO 3以及orfF4 SEQ ID NO 5来决定。
表1a(prtH200蛋白酶)

表1b(orfF3蛋白酶)

有义序列(S)，反义序列(A)表1c(orfF4蛋白酶)

有义序列(S)，反义序列(A)表2是显示PCR研究的所有结果。
表2

“p”为prtH200引物组；“o3”为orfF3引物组；“o4”为orfF4引物组；“+”代表一正PCR片段；“-”代表无PCR片段或一负PCR片段；“？”代表无测试。
“Lb.helveticus DSM 13137”描述在WO01/32836(Valio Ltd)。
表2的正片段是在表1所给予的预期大小内，其皆为DNA序列，且确定包含一个与一预期的DNA序列一致的DNA序列。
根据本发明，具有参考编号5951的特殊菌包含有prtH200、orfF3与orfF4基因序列。
实施例4ACE活性在实施例3介绍的菌种培养菌按照实施例2中所述进行ACE活性试验，其试验结果如表3所示。
表3.

实施例5抗高血压特性的体内(in vivo)试验材料与方法菌种与培养(Strains and cultivation)将菌种涂布在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MBS agar)上，并在厌氧性、37℃的环境下培养48小时，选择一菌落(colony)，再接种至MRS培养液中，并于37℃下过夜培养。准备来自隔夜的贮存培养菌，将其贮存在-80℃的20％甘油中；再将这一菌种1％(v/v)置于新鲜牛奶中作为发酵之用，并放置于牛奶中培养一整夜。
样品的制备浓缩发酵牛奶将含有单一或混合菌落菌种的牛奶利用一1％(v/v)接种层级发酵16小时，全部发酵产物经冷冻干燥。第二次发酵，在与第一次发酵的相同条件下进行发酵，经离心后取得乳浆部分，其颗粒状物已去除，并将乳浆通过0.45mm滤膜进行过滤并冷冻。在喂食大鼠之前，此乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并利用因素5(factor 5)使之浓缩。
自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertensive Rats)自发性高血压大鼠(SHR)来自于IFFA CRED0(a Charles River company)，里昂，法国。
每一次治疗在9:00至9:15之间以胃管灌食法实施，且每一只动物接受总体积为2毫升的剂量。
实验设计共分成三组别第1组(n＝16)接受治疗1(牛奶；n＝16)第2组(n＝12)接受连续治疗2-7，每一次实施间隔3天的空窗期第3组(n＝12)接受连续治疗8-12，每一次实施间隔3天的空窗期研究参数(Investiga ted parameters)在喂食5及24小时后，利用体积变化描记器(plethysmography)测定清醒的SHR在不同时间点的心脏收缩压。
在所有SHR进行实验之前，先使其适应动物场合9星期，此外，在进行第一次灌食之前，所有动物需先习惯胃管灌食法，并测量3天的心脏收缩压。
第1组的心脏收缩压的测定与第2组及第3组相平行，作为对照组。
在喂食前6小时及喂食后24小时之间，定期测定其心脏收缩压。
结果在表4显示在服用不同物质用量后，5及24小时的心脏收缩压的变动情形。
表4

牛奶样品为未发酵的牛奶，9.5％再生脱脂乳。
Enalapril通常用于治疗高血压患者的药物。以20mg/kg的高浓度添加到牛奶中，以测试大鼠对抗高血压组合物反应的能力。
Calpis商业产品Calpis食品公司(Calpis Food Industry)的商业产品，该产品名称为Calpis，其是Lb.Helveticus和Saccharomyces cerevisiae菌种混合物的液态发酵牛奶。
CHCC 4080CHCC 4080发酵的浓缩牛奶CHCC 5951CHCC 5951发酵的浓缩牛奶CHCC 637CHCC 637发酵的浓缩牛奶上述结果证明，CHCC 5951为乳酸菌种，其具有制造最好的高血压特性的肽的能力。表2(上述)显示此菌种包含在此描述的prtH200、orfF3与orfF4，在24小时，使用CHCC 5951菌种产生的肽具有的效用可与药剂Enalapril相比。
CHCC 4080没有包含任何基因。CHCC 637包含有orfF3与orfF4基因而没有prtH200基因。
如上所述，Calpis Food Industry的商业产品是藉由使用CP790乳酸菌制造的，且此菌种并不包含有prtH200[Yamamoto等(2000)]。
实施例6使用CHCC5951菌种的体内试验菌种与培养与SHR大鼠与实施例5相同样品的制备发酵牛奶将含有单一或混合菌落菌种的牛奶利用一1％(v/v)接种层级发酵16小时，全部发酵产品经冷冻干燥。第二次发酵，在与第一次发酵的相同条件下进行发酵，经离心后取得乳浆部分，其颗粒状物已去除，并将乳浆通过0.45mm滤膜进行过滤并冷冻。在喂食大鼠之前，此乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并利用不同因素使之浓缩。
实验设计动物自发性高血压大鼠(22周大)组别(1)安慰剂(牛奶)(2)样品1(在3不同乳浆浓缩3剂量的发酵牛奶；剂量1因素1，剂量2因素2.5，剂量3因素5)(3)样品2(悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶)(4)样品3(只是发酵牛奶产品)(5)样品4(在发酵后经过加热处理的发酵牛奶)(5)样品5(未经过发酵，但具有活乳酸菌的牛奶)所有大鼠均在10:00h与10:05h之间给予喂食，喂食剂量为2ml产品。
研究参数(Investigated parameters)在喂食24小时后，利用自动测量仪(Data Sciences Int.)检测清醒的SHR在不同时间点的心脏收缩压。在施药前24小时和施药后48小时每15分钟记录心脏收缩、心脏舒张压的平均值(1分钟内)。
藉由这些追踪记录，计算每一组别的心脏收缩压与心脏舒张压的24小时平均值。再者，心脏收缩压与心脏舒张压的变动是由本体相较于未经治疗数值经计算产生，其是计算喂食24小时，且在喂食后的时间3至6、12至15及21至24小时周期。
在所有SHR进行实验之前，先使其适应动物场合9星期，此外，在进行第一次灌食之前，所有动物需先习惯胃管灌食法，并测量3天的心脏收缩压。
统计资料(Statistics)所有结果皆以平均值±平均标准误差来表示。
结果表表1.经胃管喂食后的心脏收缩压

*p＜0.05vs.安慰剂(placebo)安慰剂1及安慰剂2分别作为研究编号1与研究编号2的对照组。
表2.胃管喂食后的心脏舒张压

*p＜0.05vs.未经治疗未经治疗1及未经治疗2分别作为研究编号1与研究编号2的对照组结果显示没有必要向上浓缩(up-concentrate)发酵牛奶产品。样品3只是发酵牛奶产品，其与冷冻干燥浓缩发酵样品1(剂量1，2，3)和样品2具有相当的降血压作用。
样品2为悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶，其可降低血压。证明在此描述的发酵产品具有广泛的应用，这是由于其可溶解在不同液体中，以得到一必须最终的适当使用。不同pH值的特性不一定影响产品的血压还原活性。
经发酵后加热处理的样品4也可降低血压，大体上，所有在此样品内的细菌皆被杀死，因此，即证明在最终产品中并不需要活的细菌。
样品5没有经过发酵，但其含有活的细菌，其无法降低血压，故证明发酵步骤为必要的。
实施例7脉冲式凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析鉴定纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)种CHCC5951(寄存编号为DSM 14998)在37℃标准MRS培养基中过夜培养，并使用Qiagen试剂盒来分离出染色体DNA。此分离出的染色体DNA使用限制酶SmaI做完全消化(根据操作说明进行)。
消化DNA的电泳条件为CHEF Mapper XA系统，在5.3V/cm下，脉冲时间2至30秒线性跳跃超过24小时，1.1％琼脂糖，1/2×TBE，14℃。
用来跑凝胶的程序为参数PFGE程序标号1 2 3 4 5 6起始打开时间/秒2 3 2 2 3 1最终关闭时间/秒30 80 6040 18 10跳跃因素 线性 -1.53 -1.24 线性 线性 线性跑时间/小时24 24 2424 24 21使用Gel Compar II程序在计算机上比较这些频带。
频带大小是藉由测量在三个独立PFGE上的频带移动距离，以及与这些距离相关联的具已知频带大小的标准移动来决定。此频带大小为三个量测值的平均值±5kbp。
琼脂的实验结果如图1所示，所示的12个频带的大小为频带编号1283kbp频带编号2259kbp频带编号3219kbp频带编号4138kbp频带编号5127kbp频带编号6119kbp频带编号7106kbp频带编号888kbp频带编号971kbp频带编号1059kbp频带编号1154kbp频带编号1246kbp参考文献以下是被认为与本发明相关的参考文献。
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cct agc gaa gat aag gaa tta gct aag gct aag gaa aat ctt cag4824Pro Ser Glu Asp Lys Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asn Leu Gln1595 1600 1605gct aag gtt gat gcc ggt gaa aag aag gat ctt gat aag tac act4869Ala Lys Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys Asp Leu Asp Lys Tyr Thr1610 1615 1620gct gac tcc aag aag gac ttc aat gat gcc ttg aag aag gct aag4914Ala Asp Ser Lys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Leu Lys Lys Ala Lys1625 1630 1635gat gtt tta gct gac aag aat gct aaa tta gct gac ctt caa gat4959Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp1640 1645 1650gct gct aag gct ctt gat aag gca gag caa gct tta act gaa aag5004Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys1655 1660 1665cct gct gaa cca act atc cca ctg cta caa ggg aac aat aat gct5049Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala1670 1675 1680gta tcg aat att aat act tcc tct gat aac caa gtt gca gct cct5094Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro1685 1690 1695gtg cat gct gaa aaa gac acc aag aat gat aac aag aat aca aca5139Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr1700 1705 1710gaa gaa ggt aag gac act aag gta atg ttc aag tca gtt ctt tac5184Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr1715 1720 1725act aaa gac ctt aaa aag aca agg agc act gcc caa gcc tac agt5229Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser1730 1735 1740tca ctc aaa ctt gta acc gaa aaa gga aag ctt aag gtt tac aca5274Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr1745 1750 1755ttc aaa ggt cac tac ttc tac aag gtt gtt gat cgg aat gca tat5319Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr1760 1765 1770gtt cgt gta aga aat gtg act ggt act aag gca acg tta aag aga5364Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg1775 1780 1785aat tca ttt gtc tac caa tca aat ggt aag aaa gca tca cgt aaa5409Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys1790 1795 1800
ctt ctc aag aaa ggt act acc att acc gtc tac ggc gat caa tac5454Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr1805 1810 1815aaa gct ctt aag cat tac aag aag tat gct tac aga atc ggt gaa5499Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu1820 1825 1830ggt aga tac ata aag agt gtc aat gtt aac aga gtt gat ctt gta5544Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val1835 1840 1845aaa taa 5550Lys<210>2<211>1849<212>PRT<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)<400>2Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu1 5 10 15Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser20 25 30Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu35 40 45Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala50 55 60Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp65 70 75 80Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr85 90 95Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala100 105 110Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys115 120 125Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn130 135 140Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn145 150 155 160Ile Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Tyr Tyr Ala Asn165 170 175
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<400>3atg ata aga cta ctg gga aga tgg ttg tgc tcc aga tgg tca ata cac 48Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His1 5 10 15tta ccg ctt tgt tgc ccc ttg tac aac aat ggt gaa aac aaa gtt caa 96Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln20 25 30act aat gac act cca gtt atc att gat act act gct cct gtt ttg aac144Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn35 40 45aat gtg aaa tat gat aca tct tct ttc aca ttg tca ggt gat tac gct192Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala50 55 60gat gca ggt gca ggc ttt act gac tac tca tat gca act gta act gtt240Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val65 70 75 80aac gat cat gtc ttt ggc ttt aag tta aac gaa ggc gat aag tca aac288Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn85 90 95ttt gat aat gct aat aaa acc aag gga cac ttt gtc ttt gtt ttg act336Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr100 105 110ccg gaa gaa caa gct gct tta act agc gct gct aac aag gtt acc gtt384Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val115 120 125gcc ttt agt gat gtc gca gat aac act gca acg caa aca ttt aat gtt432Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val130 135 140gca cct gta gca ggt cat aaa aag att gca gtt tgg aat gca att aat480Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn145 150 155 160
ggg tta cca ttc aat gaa aat tcc gat gat tat aat gtt ggt cgc aaa 528Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys165 170 175gta ttt atg ctt cgt ggt ggt gct gaa cat gat ttc tat gtc aat ggt 576Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly180 185 190aag tgg gtt cag gtt gat caa ggt caa ttt gta ttg cca gtt agt gtt 624Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val195 200 205gat gaa cag aat ttt gtt ttc agt tca gat caa gcg ggt aaa aat att 672Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile210 215 220tta ggt aag ttc act act ttt act cct aaa gct caa ttc gca tgg caa 720Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln225 230 235 240cat gtt gat ggt gaa gaa aga tca ttt ggt gtc agt gtt tac tca gta 768His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val245 250 255gaa ggc aag gat cca caa gat att gtt gtt caa gca tca gta ccc aag 816Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys260 265 270ggt gac aat gtt aaa gct ttt gcg aag gac tac ttc act cat gaa gtt 864Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val275 280 285tat acc ggt gag gtt cat gac ggt gta gct act ttc cac att cat acc 912Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr290 295 300agt gtc aat aaa gac gct gca act ggc att aat tta aga gcc ctt ctt 960Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu305 310 315 320caa ggt tgg gtt gaa att gat gga cca aca ttt aat gct aaa caa gta1008Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val325 330 335acg gat cca tcg cca att aat gat gct aac tac ttg ggt gtg tac tac1056Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr340 345 350aat cca aat gct gaa gag aga aag aat tat gat aat cgc gat gat ctt1104Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu355 360 365ggc gta gac ttt gaa gat gaa gca gct gac aca aac aca ttt ggc cca1152Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro370 375 380
ggg aat tat tca agt gcg aaa gat gac gct aaa att cat ttc gac tac1200Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr385 390 395 400ttg aat aat aat ggt att tct act ttg ggt aat aaa gca gta gaa aag1248Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys405 410 415ggt tat tac aat cca gca act cat aaa ttt act ttg act ggt cgg gtt1296Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val420 425 430aat cca gaa gtt att agc tta aca ttc tta gct gat agt ccg tat gaa1344Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu435 440 445gtc gat cca gaa aat caa gct gat att cat gat aat ggt aaa ttc tct1392Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser450 455 460gta aca ttc aca att gat aat cca gca aca cgt caa tta tca tat ttc1440Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe465 470 475 480ttt aag acg aat gat ggc aaa aca aca aga ggc tct ttg act tta att1488Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile485 490 495ctt gac act gtt gat cca act ctt act gta gat caa tta ggc gac aag1536Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys500 505 510gat gag gct gaa att act act aat aag cca acc ttt aag tta tcc ggt1584Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly515 520 525gag gcc aac gat aac att gat ggt tac aat gta ttt atc aat ggt gat1632Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp530 535 540aat gtt ttt ggg caa ttt ggt aat tcg ggt tat gat ttt ctg cca gga1680Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly545 550 555 560atc tac aat gat tta aat caa aat act cca aat ttg tac gga tct tac1728Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr565 570 575aag ttt gat caa gaa gag caa ttg gat gat cag aat ggg caa cca aca1776Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr580 585 590acc cat gtc ttt act att gca gta gag gac caa gct ggt aac aga gtt1824Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val595 600 605
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Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly180 185 190Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val195 200 205Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile210 215 220Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln225 230 235 240His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val245 250 255Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys260 265 270Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val275 280 285Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr290 295 300Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu305 310 315 320Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val325 330 335Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr340 345 350Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu355 360 365Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro370 375 380Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr385 390 395 400Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys405 410 415Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val420 425 430Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu435 440 445Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser450 455 460
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Phe Lys Thr Lys Lys Glu Thr Leu Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Leu755 760 765Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Lys His770 775 780Gly Lys Lys Leu Leu Phe Lys Lys Gly Lys Thr Val Leu Val Trp Asn785 790 795 800Asn Ser Arg Val Val Thr Ile Lys Gly Gln Lys Tyr Tyr Arg Ala Thr805 810 815Lys Asn Val Phe Val Lys Val Ser Thr Ile Lys Gln Val Lys Asp Leu820 825 830Lys Leu Val Leu Thr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Asn Lys Leu Gly Lys835 840 845Arg Val Lys Tyr Lys Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Gly Lys His Leu850 855 860Ser Thr His Asn Asn Gly Lys Val Val Thr Ile Lys Asn Ile His Phe865 870 875 880Phe Asn Ile Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Phe Gln Gln Arg885 890<210>5<211>4881<212>DNA<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)<220>
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gtt tca aat tct gat tct gcc aag aca cag act aat gca acg gac cag240Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln65 70 75 80aca caa aat tca act gtg gtt tct ggt gat tcc acg act gcg aat tct288Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser85 90 95aag acc tca cag act tct aat gca caa act aca agt aca aca aca aat336Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn100 105 110agt gta gat cca aac cag gaa caa caa cct gct aat caa gct gat cat384Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His115 120 125gtt aaa gga aat gtg cag tct gca tgg gat caa gga tat agg gga caa432Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln130 135 140gga aca gtt gtt gca gtc atc gat tcc ggt gca gat cca act cat aaa480Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys145 150 155 160gat ttt aaa acc atg cca gaa gat cct aag ctg tcc gag gat gat atg528Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met165 170 175caa gct aag atc gcc aag caa ggc tat ggt aaa tat gtg aat gaa aag576Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys180 185 190ttc cca tat gtt tat aat tat gcc gat cgt gat aat gac tat att act624Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr195 200 205tcg gat gac acc aat gct aat gat tct cca cac ggt caa cac gtt tca672Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser210 215 220gga atc att gca gct gat ggt aag cca gat gga aat aaa gaa tat gtc720Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val225 230 235 240gtt ggt gtt gct cct gaa gct caa ttg atg cag ctg aga gtt ttt gga768Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly245 250 255caa ttt tca gat gaa aaa act gat gat gtg gca aaa gca atc tac gat816Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp260 265 270gct acc aat tta ggt gcg gat gtc atc caa atg tca tta gga caa ggt864Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly275 280 285
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<223>PCR引物<400>18actctagcac cagctaattg aacatcatg29<210>19<211>5358<212>DNA<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(5358)<223>
<400>19atg aat aaa tct gat tta aaa gaa gcg aat cag ttt aaa tat gtc tac 48Met Asn Lys Ser Asp Leu Lys Glu Ala Asn Gln Phe Lys Tyr Val Tyr1 5 10 15caa agt gga caa aag ctg aac gca gtc cac aat caa aaa agt tca cgc 96Gln Ser Gly Gln Lys Leu Asn Ala Val His Asn Gln Lys Ser Ser Arg20 25 30ttt tta agt aag tta cat aag aaa tgg gct gga gca aca att gtt gcc144Phe Leu Ser Lys Leu His Lys Lys Trp Ala Gly Ala Thr Ile Val Ala35 40 45tta gct tca agt acc gtt ctc ttg ttc tca agt cat aat gtt aaa gct192Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu Leu Phe Ser Ser His Asn Val Lys Ala50 55 60gat gct caa gca cca agc gat gat aag caa cca gat cct gtt gta caa240Asp Ala Gln Ala Pro Ser Asp Asp Lys Gln Pro Asp Pro Val Val Gln65 70 75 80aag agt gaa caa agt caa ggt caa act ttg caa gct gtt caa cgt aaa288Lys Ser Glu Gln Ser Gln Gly Gln Thr Leu Gln Ala Val Gln Arg Lys85 90 95gac gat gca gta cca tct gat gca tac caa caa tct gca gct gta caa336Asp Asp Ala yal Pro Ser Asp Ala Tyr Gln Gln Ser Ala Ala Val Gln100 105110gct aat aac aat aat gat caa caa gct caa gac aat aaa caa gct agt384Ala Asn Asn Asn Asn Asp Gln Gln Ala Gln Asp Asn Lys Gln Ala Ser115 120 125caa cca act agt cca gtg gca caa gct caa ccg gct caa caa caa aaa432Gln Pro Thr Ser Pro Val Ala Gln Ala Gln Pro Ala Gln Gln Gln Lys130 135 140gca aag gat gtt gtt cca agt aag cca caa cct caa cca caa ccg gct480Ala Lys Asp Val Val Pro Ser Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ala145 150 155 160aag caa act act aat ggt caa act gaa gat gaa gat ggt caa aag gat528Lys Gln Thr Thr Asn Gly Gln Thr Glu Asp Glu Asp Gly Gln Lys Asp165 170 175aag aat ggt gtt caa tta cca gct aat aat caa gac cat gta aaa ggt576Lys Asn Gly Val Gln Leu Pro Ala Asn Asn Gln Asp His Val Lys Gly180 185 190aat gtt caa tcc gct tgg gat caa ggc tac cgc ggt gaa cat act gtt624Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Glu His Thr Val195 200 205gta gca gtt att gac tct ggg gta gat gtt cat cat aaa gat ttc tta672Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Val Asp Val His His Lys Asp Phe Leu210 215 220
acc atg cct aag aat cct aaa tta act gct gat caa atg aaa cgt ttg 720Thr Met Pro Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Asp Gln Met Lys Arg Leu225 230 235 240att aag aga tta ggt tat ggt cgt tat gta aat gaa aaa ttc cca ttt 768Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Gly Arg Tyr Val Asn Glu Lys Phe Pro Phe245 250 255gct tat aat tat gtt gat aat gaa aat gat cat tta aag gct cca aat 816Ala Tyr Asn Tyr Val Asp Asn Glu Asn Asp His Leu Lys Ala Pro Asn260 265 270ggt gag cct cac gga caa cac gtt tcc ggt att att gct gct gat ggt 864Gly Glu Pro His Gly Gln His Val Ser Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly275 280 285cat cca gat ggt gat aat act tat gtt gtg ggt gtt gct cct gaa gca 912His Pro Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala290 295 300caa tta atg caa ttg aaa gta ttt ggc gat aac tca act tct ctt gat 960Gln Leu Met Gln Leu Lys Val Phe Gly Asp Asn Ser Thr Ser Leu Asp305 310 315 320atg gcc aaa gaa att tgc gat gct gtt aac ttg ggt gcc gat gtt atc1008Met Ala Lys Glu Ile Cys Asp Ala Val Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile325 330 335aat atg tca tta ggt ggt ggt gtt tct gct gct gac ctc aac att cag1056Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Val Ser Ala Ala Asp Leu Asn Ile Gln340 345 350gat caa aga gca gtt caa tat gct gtt gat cat ggg gtt gtc gtt gtc1104Asp Gln Arg Ala Val Gln Tyr Ala Val Asp His Gly Val Val Val Val355 360 365att tca gct gct aat aat ggt aat gca gct tct gtt gat aat cca act1152Ile Ser Ala Ala Asn Asn Gly Asn Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro Thr370 375 380cac tta aca gat tta gat aac tac caa gca ggt ggt aac gct ggt aac1200His Leu Thr Asp Leu Asp Asn Tyr Gln Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn385 390 395 400tat aat cca ttt agt tca agt act gta gct aac cca ggt gct gcc aga1248Tyr Asn Pro Phe Ser Ser Ser Thr Val Ala Asn Pro Gly Ala Ala Arg405 410 415agt gcg atc aca gta gca gct gaa act tct ggt act ggt aaa gat agc1296Ser Ala Ile Thr Val Ala Ala Glu Thr Ser Gly Thr Gly Lys Asp Ser420 425 430gat atg gcc ttc ttt agt tct tgg ggt cca tta cct gat ttc act tta1344Asp Met Ala Phe Phe Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu435 440 445
aag cca gat gtt tcg gcc cca ggt tat gat gtc att tca acc gct aac1392Lys Pro Asp Val Ser Ala Pro Gly Tyr Asp Val Ile Ser Thr Ala Asn450 455 460ggc aat tca tac acg caa atg agc ggt act tca atg gct agt cca ttc1440Gly Asn Ser Tyr Thr Gln Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro Phe465 470 475 480gtg gct ggt gct gca gct ctt gtg aga gaa aga tta tta aag acc aat1488Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Arg Glu Arg Leu Leu Lys Thr Asn485 490 495cct aag tta aag ggt gct gct tta gtt gaa gcc atc aaa gct ttg tta1536Pro Lys Leu Lys Gly Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Lys Ala Leu Leu500 505 510act aat acg gct gat cca caa gtt caa aat ggc tac aac act ttg gtc1584Thr Asn Thr Ala Asp Pro Gln Val Gln Asn Gly Tyr Asn Thr Leu Val515 520 525tca cca aga aga caa ggt gct ggt caa att aat gtt ggt gcc gca act1632Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly Gln Ile Asn Val Gly Ala Ala Thr530 535 540aaa tct ccg gtt tat gtt act act gct gac gga act ggt gcc tta agc1680Lys Ser Pro Val Tyr Val Thr Thr Ala Asp Gly Thr Gly Ala Leu Ser545 550 555 560tta cgc caa gtt ggc aat tcg acc act ttt gtc ttg aac ttg cat aac1728Leu Arg Gln Val Gly Asn Ser Thr Thr Phe Val Leu Asn Leu His Asn565 570 575tta tca aat gaa gaa caa gaa tat aat ttt gat gac ttc ggc ggt ggc1776Leu Ser Asn Glu Glu Gln Glu Tyr Asn Phe Asp Asp Phe Gly Gly Gly580 585 590ttt act gaa ctt agg aat aag gct aac ggt gtc ttc cat gat gtt caa1824Phe Thr Glu Leu Arg Asn Lys Ala Asn Gly Val Phe His Asp Val Gln595 600 605tta gct ggt gct aga gtt aac ggt gac aat gtt gtt gtc tta aag cca1872Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly Asp Asn Val Val Val Leu Lys Pro610 615 620aat gaa act aaa caa gtt acc tat act ttg aat tta act agc att aaa1920Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Tyr Thr Leu Asn Leu Thr Ser Ile Lys625 630 635 640aag aat caa tta gtt gaa ggt ttc ttg aga ttt act aac tcc aag gat1968Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe Leu Arg Phe Thr Asn Ser Lys Asp645 650 655aaa tca acc tta gtt gta cct tac ttg tca tac tat ggc gat atg act2016Lys Ser Thr Leu Val Val Pro Tyr Leu Ser Tyr Tyr Gly Asp Met Thr660 665 670
aag gaa aat gtc ttt gac caa aat gct aat gat cct aag cct gat att2064Lys Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn Ala Asn Asp Pro Lys Pro Asp Ile675 680 685caa ggt aat cgt tta gtt aac gaa gat aat tat cct cgt ggt att gct2112Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu Asp Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala690 695 700gac gaa aat tca tta aaa gaa tta gtc aat gtt gac ggt aat tat aac2160Asp Glu Asn Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn705 710 715 720tgg caa gaa gtt gct aag tta tat gag agt ggt aaa gtt gcc ttc tca2208Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser725 730 735cca aat ggt gat cat aag agt gac tta att aag cca tac gct tac ttg2256Pro Asn Gly Asp His Lys Ser Asp Leu Ile Lys Pro Tyr Ala Tyr Leu740 745 750aaa caa aat gtc aag gac ttg aag gtt gag att ctt gat ggt tca ggt2304Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Ser Gly755 760 765aaa gtt gtt cgt gtc ctt gct gat tct cgt ggc gtt gaa aag tca tac2352Lys Val Val Arg Val Leu Ala Asp Ser Arg Gly Val Glu Lys Ser Tyr770 775 780cat tca gac ggt gat ggt gca aca gtt gac ctt gat aat ggt gca act2400His Ser Asp Gly Asp Gly Ala Thr Val Asp Leu Asp Asn Gly Ala Thr785 790 795 800aac tct gat gtc ttc gac tgg gat ggt aaa tta tat gat gct aag act2448Asn Ser Asp Val Phe Asp Trp Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Thr805 810 815ggt aag atg gtt gcc gct cca gat ggc aat tac act tac cgc ttc atc2496Gly Lys Met Val Ala Ala Pro Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Phe Ile820 825 830gca act ttg tat aac gat ggc cca caa aaa gtt caa act aat gat acc2544Ala Thr Leu Tyr Asn Asp Gly Pro Gln Lys Val Gln Thr Asn Asp Thr835 840 845cca gtt atc atc gat acc act gct cct gtt tta agc gat gtt cac tac2592Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Ser Asp Val His Tyr850 855 860aac cgc aga agt aat aca att act ggt agt tac gct gat aag ggt gct2640Asn Arg Arg Ser Asn Thr Ile Thr Gly Ser Tyr Ala Asp Lys Gly Ala865 870 875 880ggc ttt act gac tac tca tac gct aca gta act att aat gat cat gca2688Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Ile Asn Asp His Ala885 890 895
ttt ggt ttc aag ttg aat gat ggc aag aac tct ggt ttc gat gat gct 2736Phe Gly Phe Lys Leu Asn Asp Gly Lys Asn Ser Gly Phe Asp Asp Ala900 905 910aac aag aca aaa ggt cac ttc agt ttc aag tta act ggg gat gaa ctt 2784Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Ser Phe Lys Leu Thr Gly Asp Glu Leu915 920 925aaa gca tta act agt gca gat aac cta gtt tca gta gct ttc agt gac 2832Lys Ala Leu Thr Ser Ala Asp Asn Leu Val Ser Val Ala Phe Ser Asp930 935 940gtt gca gat aac aca gtt gta aag agc ttg aaa ctt gat ggt agt ttt 2880Val Ala Asp Asn Thr Val Val Lys Ser Leu Lys Leu Asp Gly Ser Phe945 950 955 960gat caa cca ggc gtt tca att tgg aat gca act aat ggt tta cca ttt 2928Asp Gln Pro Gly Val Ser Ile Trp Asn Ala Thr Asn Gly Leu Pro Phe965 970 975aat gaa aac tca gct gac tat gac aag gct gct aac acc ttc aac tta 2976Asn Glu Asn Ser Ala Asp Tyr Asp Lys Ala Ala Asn Thr Phe Asn Leu980 985 990cgt ggt agt gct agt gat gac ttc tac ctt aat ggt aag tgg gtt caa 3024Arg Gly Ser Ala Ser Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Trp Val Gln995 1000 1005ctt gat gac aat ggt caa ttc gtt gtc cca gtt agt gcg caa gga 3069Leu Asp Asp Asn Gly Gln Phe Val Val Pro Val Ser Ala Gln Gly1010 1015 1020gaa caa gat tta gtc ttc agt tct gat gat ggt ggt aaa gat gtc 3114Glu Gln Asp Leu Val Phe Ser Ser Asp Asp Gly Gly Lys Asp Val1025 1030 1035ctt act acc ttt aga aat tac aca cca aag gct aaa ttt gca tgg 3159Leu Thr Thr Phe Arg Asn Tyr Thr Pro Lys Ala Lys Phe Ala Trp1040 1045 1050caa cat gta gat ggt caa gat gaa cac ttt ggc cca gca att tac 3204Gln His Val Asp Gly Gln Asp Glu His Phe Gly Pro Ala Ile Tyr10551060 1065tca atc ttt ggt agt aac cca gat gat att gtt gtt caa gct gca 3249Ser Ile Phe Gly Ser Asn Pro Asp Asp Ile Val Val Gln Ala Ala1070 1075 1080gtt act aag ggt gat aac gtt aag gcc ttt gct aag gat tac ttc 3294Val Thr Lys Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe1085 1090 1095act ggt caa att tat act ggt gtt gta aaa gat ggg gtt gcc aca 3339Thr Gly Gln Ile Tyr Thr Gly Val Val Lys Asp Gly Val Ala Thr1100 1105 1110
ttc cac gtt aag aca agt att aac aaa gat cca aag act aat atc3384Phe His Val Lys Thr Ser Ile Asn Lys Asp Pro Lys Thr Asn Ile1115 1120 1125ttt gct cgt gcc tta tta caa ggt tgg act gaa gtt gat gga cca3429Phe Ala Arg Ala Leu Leu Gln Gly Trp Thr Glu Val Asp Gly Pro1130 1135 1140acc ttt aat gat aag caa aag act gat cca act gct att aag gat3474Thr Phe Asn Asp Lys Gln Lys Thr Asp Pro Thr Ala Ile Lys Asp1145 1150 1155gct aac tac atc ggt gtc tac tat gat aaa gat gct gta gct cat3519Ala Asn Tyr Ile Gly Val Tyr Tyr Asp Lys Asp Ala Val Ala His1160 1165 1170gta tac act aat cgt gat gat tta ggt gta gta atg acg gat gaa3564Val Tyr Thr Asn Arg Asp Asp Leu Gly Val Val Met Thr Asp Glu1175 1180 1185gtg gca gat cca aag gac ttc ggc cca ggt cta tat cca ggt cat3609Val Ala Asp Pro Lys Asp Phe Gly Pro Gly Leu Tyr Pro Gly His1190 1195 1200tct gct cca agt gca cat aat cca cat atc aag ttt gat tac ttg3654Ser Ala Pro Ser Ala His Asn Pro His Ile Lys Phe Asp Tyr Leu1205 1210 1215gat gat aat aat gta gct agt gtt ggt gca gaa gcc gtt aag aag3699Asp Asp Asn Asn Val Ala Ser Val Gly Ala Glu Ala Val Lys Lys1220 1225 1230ggc tac tac aac cca aga aca cat gag ttt acg cta act ggc caa3744Gly Tyr Tyr Asn Pro Arg Thr His Glu Phe Thr Leu Thr Gly Gln1235 1240 1245gtt gat gct aat gta atc agt tta acc ttc tta gca gct agt cca3789Val Asp Ala Asn Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Ala Ser Pro1250 1255 1260tat gaa gaa gct gca gaa aat caa gct gat att agc caa aat ggt3834Tyr Glu Glu Ala Ala Glu Asn Gln Ala Asp Ile Ser Gln Asn Gly1265 1270 1275aag ttt aag ttt agc ttc aag att cca aat gct ggt aca aga gaa3879Lys Phe Lys Phe Ser Phe Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr Arg Glu1280 1285 1290tta tca tac ttg tac atg act tct gac ggt aaa gta aca cgt ggt3924Leu Ser Tyr Leu Tyr Met Thr Ser Asp Gly Lys Val Thr Arg Gly1295 1300 1305tct ttg aca ctt atc tta gat act gtt ttg cct act tta cat gtt3969Ser Leu Thr Leu Ile Leu Asp Thr Val Leu Pro Thr Leu His Val1310 1315 1320
gat caa atg cca gca aat cgt gca gaa gtt gaa tac act acc agc4014Asp Gln Met Pro Ala Asn Arg Ala Glu Val Glu Tyr Thr Thr Ser1325 1330 1335aat cca acc ttt acc ctt tct ggt gta gct aat gat aac tta gat4059Asn Pro Thr Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala Asn Asp Asn Leu Asp1340 1345 1350gct tac agt gtc tac atc aat ggt gat aac gtc ttt agt caa ttt4104Ala Tyr Ser Val Tyr Ile Asn Gly Asp Asn Val Phe Ser Gln Phe1355 1360 1365ggc aat tct ggc tac aac ttc att cca ggt ttg tac aat gat cca4149Gly Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Gly Leu Tyr Asn Asp Pro1370 1375 1380aag caa aag aca cct aat act tat ggt cca tat aac ttt aat gtt4194Lys Gln Lys Thr Pro Asn Thr Tyr Gly Pro Tyr Asn Phe Asn Val1385 1390 1395aag gaa gct ttg gat gat gaa aat agt caa cca act act cac gtc4239Lys Glu Ala Leu Asp Asp Glu Asn Ser Gln Pro Thr Thr His Val1400 1405 1410ttt gtt gtt gca att gtt gat gct gta ggg aac cgc gtt gaa aag4284Phe Val Val Ala Ile Val Asp Ala Val Gly Asn Arg Val Glu Lys1415 1420 1425aga tta gtt gtt cac tat gat cca aac ttt ggt aag acc gca gct4329Arg Leu Val Val His Tyr Asp Pro Asn Phe Gly Lys Thr Ala Ala1430 1435 1440aaa cca gaa gat aat aaa ggc gag ggt aat aaa caa caa tct act4374Lys Pro Glu Asp Asn Lys Gly Glu Gly Asn Lys Gln Gln Ser Thr1445 1450 1455agt cct gct gaa cca gtg aag gta cca gct ggt caa tca agt cag4419Ser Pro Ala Glu Pro Val Lys Val Pro Ala Gly Gln Ser Ser Gln1460 1465 1470cca aaa caa cca act gct cca gtt caa tca tca act ggt aag aag4464Pro Lys Gln Pro Thr Ala Pro Val Gln Ser Ser Thr Gly Lys Lys1475 1480 1485gaa gag agt agc aag cca gct gca act cca act aag cca gaa gca4509Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala Ala Thr Pro Thr Lys Pro Glu Ala1490 1495 1500ggt aag gaa gta act cca gct aag cca agt aaa cca gaa aat gtt4554Gly Lys Glu Val Thr Pro Ala Lys Pro Ser Lys Pro Glu Asn Val1505 1510 1515gct caa cca aca act ggt aag aag gaa gag agt agc aag cca gct4599Ala Gln Pro Thr Thr Gly Lys Lys Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala1520 1525 1530
gta act cca act aag cca gaa gga ggc aag gaa gta gcc cca gct4644Val Thr Pro Thr Lys Pro Glu Gly Gly Lys Glu Val Ala Pro Ala1535 1540 1545aag cca agt aaa cca gcc agt gcc act caa cca aca act ggt aag4689Lys Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Thr Gln Pro Thr Thr Gly Lys1550 1555 1560aag gaa gaa agt ggc aag cca gcc gca act cca gct caa cca gct4734Lys Glu Glu Ser Gly Lys Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Pro Ala1565 1570 1575aag cca gca agt gaa aac aat caa gct agt caa gca act caa cct4779Lys Pro Ala Ser Glu Asn Asn Gln Ala Ser Gln Ala Thr Gln Pro1580 1585 1590tca caa cct gca ggt caa ccg gtc gct gct aag aaa gat gaa agt4824Ser Gln Pro Ala Gly Gln Pro Val Ala Ala Lys Lys Asp Glu Ser1595 1600 1605aac aaa caa gat act cct ctg aca aaa cca gct aat ggt tca caa4869Asn Lys Gln Asp Thr Pro Leu Thr Lys Pro Ala Asn Gly Ser Gln1610 1615 1620tca gaa act tca aca tta tca act gct cca act gaa tca act aaa4914Ser Glu Thr Ser Thr Leu Ser Thr Ala Pro Thr Glu Ser Thr Lys1625 1630 1635tca agt tca gaa aat aat aat tta cct tca tct cct gca caa agt4959Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Leu Pro Ser Ser Pro Ala Gln Ser1640 1645 1650aac gaa caa tca gtt gct ggt cct gtt aaa gct caa aag gtt gca5004Asn Glu Gln Ser Val Ala Gly Pro Val Lys Ala Gln Lys Val Ala1655 1660 1665aga aga gct aaa caa gtt aag tta acc cgt aat gca cgt gca tat5049Arg Arg Ala Lys Gln Val Lys Leu Thr Arg Asn Ala Arg Ala Tyr1670 1675 1680aat ctt aat ggg aaa tta gtc ctt aag aag ggt aaa gtt ctt act5094Asn Leu Asn Gly Lys Leu Val Leu Lys Lys Gly Lys Val Leu Thr1685 1690 1695ctt aga aat aat ggc cgt gta gta act att aaa tgt cat aaa tat5139Leu Arg Asn Asn Gly Arg Val Val Thr Ile Lys Cys His Lys Tyr1700 1705 1710tac cag gtt ggt aag aat gtt tac gtt gct gtt gcc aac act tta5184Tyr Gln Val Gly Lys Asn Val Tyr Val Ala Val Ala Asn Thr Leu1715 1720 1725aag caa aga aca ttt aaa cat aat gtt gct gtt tat aac cat aaa5229Lys Gln Arg Thr Phe Lys His Asn Val Ala Val Tyr Asn His Lys1730 1735 1740
ggc aag aaa gtt ggt gtt ctt aaa gct ggc aga aaa gtt gtt tta 5274Gly Lys Lys Val Gly Val Leu Lys Ala Gly Arg Lys Val Val Leu17451750 1755tta aac aat ggt aga acg aca act att cat ggt aag aag ttt tat 5319Leu Asn Asn Gly Arg Thr Thr Thr Ile His Gly Lys Lys Phe Tyr1760 1765 1770caa gtt ggt aag gat caa ttt gtt aag gct agt gat ctt 5358Gln Val Gly Lys Asp Gln Phe Val Lys Ala Ser Asp Leu1775 1780 1785<210>20<211>1786<212>PRT<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)<400>20Met Asn Lys Ser Asp Leu Lys Glu Ala Asn Gln Phe Lys Tyr Val Tyr1 5 10 15Gln Ser Gly Gln Lys Leu Asn Ala Val His Asn Gln Lys Ser Ser Arg20 25 30Phe Leu Ser Lys Leu His Lys Lys Trp Ala Gly Ala Thr Ile Val Ala35 40 45Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu Leu Phe Ser Ser His Asn Val Lys Ala50 55 60Asp Ala Gln Ala Pro Ser Asp Asp Lys Gln Pro Asp Pro Val Val Gln65 70 75 80Lys Ser Glu Gln Ser Gln Gly Gln Thr Leu Gln Ala Val Gln Arg Lys85 90 95Asp Asp Ala Val Pro Ser Asp Ala Tyr Gln Gln Ser Ala Ala Val Gln100 105 110Ala Asn Asn Asn Asn Asp Gln Gln Ala Gln Asp Asn Lys Gln Ala Ser115 120 125Gln Pro Thr Ser Pro Val Ala Gln Ala Gln Pro Ala Gln Gln Gln Lys130 135 140Ala Lys Asp Val Val Pro Ser Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ala145 150 155 160Lys Gln Thr Thr Asn Gly Gln Thr Glu Asp Glu Asp Gly Gln Lys Asp165 170 175Lys Asn Gly Val Gln Leu Pro Ala Asn Asn Gln Asp His Val Lys Gly180 185 190
Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Glu His Thr Val195 200 205Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Val Asp Val His His Lys Asp Phe Leu210 215 220Thr Met Pro Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Asp Gln Met Lys Arg Leu225 230 235 240Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Gly Arg Tyr Val Asn Glu Lys Phe Pro Phe245 250 255Ala Tyr Asn Tyr Val Asp Asn Glu Asn Asp His Leu Lys Ala Pro Asn260 265 270Gly Glu Pro His Gly Gln His Val Ser Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly275 280 285His Pro Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala290 295 300Gln Leu Met Gln Leu Lys Val Phe Gly Asp Asn Ser Thr Ser Leu Asp305 310 315 320Met Ala Lys Glu Ile Cys Asp Ala Val Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile325 330 335Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Val Ser Ala Ala Asp Leu Asn Ile Gln340 345 350Asp Gln Arg Ala Val Gln Tyr Ala Val Asp His Gly Val Val Val Val355 360 365Ile Ser Ala Ala Asn Asn Gly Asn Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro Thr370 375 380His Leu Thr Asp Leu Asp Asn Tyr Gln Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn385 390 395 400Tyr Asn Pro Phe Ser Ser Ser Thr Val Ala Asn Pro Gly Ala Ala Arg405 410 415Ser Ala Ile Thr Val Ala Ala Glu Thr Ser Gly Thr Gly Lys Asp Ser420 425 430Asp Met Ala Phe Phe Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu435 440 445Lys Pro Asp Val Ser Ala Pro Gly Tyr Asp Val Ile Ser Thr Ala Asn450 455 460Gly Asn Ser Tyr Thr Gln Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro Phe465 470 475 480
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Arg Glu Arg Leu Leu Lys Thr Asn485 490 495Pro Lys Leu Lys Gly Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Lys Ala Leu Leu500 505 510Thr Asn Thr Ala Asp Pro Gln Val Gln Asn Gly Tyr Asn Thr Leu Val515 520 525Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly Gln Ile Asn Val Gly Ala Ala Thr530 535 540Lys Ser Pro Val Tyr Val Thr Thr Ala Asp Gly Thr Gly Ala Leu Ser545 550 555 560Leu Arg Gln Val Gly Asn Ser Thr Thr Phe Val Leu Asn Leu His Asn565 570 575Leu Ser Asn Glu Glu Gln Glu Tyr Asn Phe Asp Asp Phe Gly Gly Gly580 585 590Phe Thr Glu Leu Arg Asn Lys Ala Asn Gly Val Phe His Asp Val Gln595 600 605Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly Asp Asn Val Val Val Leu Lys Pro610 615 620Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Tyr Thr Leu Asn Leu Thr Ser Ile Lys625 630 635 640Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe Leu Arg Phe Thr Asn Ser Lys Asp645 650 655Lys Ser Thr Leu Val Val Pro Tyr Leu Ser Tyr Tyr Gly Asp Met Thr660 665 670Lys Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn Ala Asn Asp Pro Lys Pro Asp Ile675 680 685Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu Asp Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala690 695 700Asp Glu Asn Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn705 710 715 720Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser725 730 735Pro Asn Gly Asp His Lys Ser Asp Leu Ile Lys Pro Tyr Ala Tyr Leu740 745 750Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Ser Gly755 760 765
Lys Val Val Arg Val Leu Ala Asp Ser Arg Gly Val Glu Lys Ser Tyr770 775 780His Ser Asp Gly Asp Gly Ala Thr Val Asp Leu Asp Asn Gly Ala Thr785 790 795 800Asn Ser Asp Val Phe Asp Trp Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Thr805 810 815Gly Lys Met Val Ala Ala Pro Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Phe Ile820 825 830Ala Thr Leu Tyr Asn Asp Gly Pro Gln Lys Val Gln Thr Asn Asp Thr835 840 845Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Ser Asp Val His Tyr850 855 860Asn Arg Arg Ser Asn Thr Ile Thr Gly Ser Tyr Ala Asp Lys Gly Ala865 870 875 880Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Ile Asn Asp His Ala885 890 895Phe Gly Phe Lys Leu Asn Asp Gly Lys Asn Ser Gly Phe Asp Asp Ala900 905 910Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Ser Phe Lys Leu Thr Gly Asp Glu Leu915 920 925Lys Ala Leu Thr Ser Ala Asp Asn Leu Val Ser Val Ala Phe Ser Asp930 935 940Val Ala Asp Asn Thr Val Val Lys Ser Leu Lys Leu Asp Gly Ser Phe945 950 955 960Asp Gln Pro Gly Val Ser Ile Trp Asn Ala Thr Asn Gly Leu Pro Phe965 970 975Asn Glu Asn Ser Ala Asp Tyr Asp Lys Ala Ala Asn Thr Phe Asn Leu980 985 990Arg Gly Ser Ala Ser Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Trp Val Gln995 1000 1005Leu Asp Asp Asn Gly Gln Phe Val Val Pro Val Ser Ala Gln Gly1010 1015 1020Glu Gln Asp Leu Val Phe Ser Ser Asp Asp Gly Gly Lys Asp Val1025 1030 1035Leu Thr Thr Phe Arg Asn Tyr Thr Pro Lys Ala Lys Phe Ala Trp1040 1045 1050
Gln His Val Asp Gly Gln Asp Glu His Phe Gly Pro Ala Ile Tyr1055 1060 1065Ser Ile Phe Gly Ser Asn Pro Asp Asp Ile Val Val Gln Ala Ala10701075 1080Val Thr Lys Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe1085 1090 1095Thr Gly Gln Ile Tyr Thr Gly Val Val Lys Asp Gly Val Ala Thr1100 1105 1110Phe His Val Lys Thr Ser Ile Asn Lys Asp Pro Lys Thr Asn Ile1115 1120 1125Phe Ala Arg Ala Leu Leu Gln Gly Trp Thr Glu Val Asp Gly Pro1130 1135 1140Thr Phe Asn Asp Lys Gln Lys Thr Asp Pro Thr Ala Ile Lys Asp1145 1150 1155Ala Asn Tyr Ile Gly Val Tyr Tyr Asp Lys Asp Ala Val Ala His1160 1165 1170Val Tyr Thr Asn Arg Asp Asp Leu Gly Val Val Met Thr Asp Glu1175 1180 1185Val Ala Asp Pro Lys Asp Phe Gly Pro Gly Leu Tyr Pro Gly His1190 1195 1200Ser Ala Pro Ser Ala His Asn Pro His Ile Lys Phe Asp Tyr Leu1205 1210 1215Asp Asp Asn Asn Val Ala Ser Val Gly Ala Glu Ala Val Lys Lys1220 1225 1230Gly Tyr Tyr Asn Pro Arg Thr His Glu Phe Thr Leu Thr Gly Gln1235 1240 1245Val Asp Ala Asn Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Ala Ser Pro1250 1255 1260Tyr Glu Glu Ala Ala Glu Asn Gln Ala Asp Ile Ser Gln Asn Gly1265 1270 1275Lys Phe Lys Phe Ser Phe Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr Arg Glu1280 1285 1290Leu Ser Tyr Leu Tyr Met Thr Ser Asp Gly Lys Val Thr Arg Gly1295 13001305Ser Leu Thr Leu Ile Leu Asp Thr Val Leu Pro Thr Leu His Val1310 1315 1320
Asp Gln Met Pro Ala Asn Arg Ala Glu Val Glu Tyr Thr Thr Ser1325 1330 1335Asn Pro Thr Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala Asn Asp Asn Leu Asp1340 1345 1350Ala Tyr Ser Val Tyr Ile Asn Gly Asp Asn Val Phe Ser Gln Phe1355 1360 1365Gly Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Gly Leu Tyr Asn Asp Pro1370 1375 1380Lys Gln Lys Thr Pro Asn Thr Tyr Gly Pro Tyr Asn Phe Asn Val1385 1390 1395Lys Glu Ala Leu Asp Asp Glu Asn Ser Gln Pro Thr Thr His Val1400 1405 1410Phe Val Val Ala Ile Val Asp Ala Val Gly Asn Arg Val Glu Lys1415 1420 1425Arg Leu Val Val His Tyr Asp Pro Asn Phe Gly Lys Thr Ala Ala1430 1435 1440Lys Pro Glu Asp Asn Lys Gly Glu Gly Asn Lys Gln Gln Ser Thr1445 1450 1455Ser Pro Ala Glu Pro Val Lys Val Pro Ala Gly Gln Ser Ser Gln1460 1465 1470Pro Lys Gln Pro Thr Ala Pro Val Gln Ser Ser Thr Gly Lys Lys1475 1480 1485Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala Ala Thr Pro Thr Lys Pro Glu Ala1490 1495 1500Gly Lys Glu Val Thr Pro Ala Lys Pro Ser Lys Pro Glu Asn Val1505 1510 1515Ala Gln Pro Thr Thr Gly Lys Lys Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala1520 1525 1530Val Thr Pro Thr Lys Pro Glu Gly Gly Lys Glu Val Ala Pro Ala1535 1540 1545Lys Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Thr Gln Pro Thr Thr Gly Lys1550 1555 1560Lys Glu Glu Ser Gly Lys Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Pro Ala1565 1570 1575Lys Pro Ala Ser Glu Asn Asn Gln Ala Ser Gln Ala Thr Gln Pro1580 1585 1590
Ser Gln Pro Ala Gly Gln Pro Val Ala Ala Lys Lys Asp Glu Ser1595 1600 1605Asn Lys Gln Asp Thr Pro Leu Thr Lys Pro Ala Asn Gly Ser Gln1610 1615 1620Ser Glu Thr Ser Thr Leu Ser Thr Ala Pro Thr Glu Ser Thr Lys1625 1630 1635Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Leu Pro Ser Ser Pro Ala Gln Ser1640 1645 1650Asn Glu Gln Ser Val Ala Gly Pro Val Lys Ala Gln Lys Val Ala1655 1660 1665Arg Arg Ala Lys Gln Val Lys Leu Thr Arg Asn Ala Arg Ala Tyr1670 1675 1680Asn Leu Asn Gly Lys Leu Val Leu Lys Lys Gly Lys Val Leu Thr1685 1690 1695Leu Arg Asn Asn Gly Arg Val Val Thr Ile Lys Cys His Lys Tyr1700 1705 1710Tyr Gln Val Gly Lys Asn Val Tyr Val Ala Val Ala Asn Thr Leu1715 1720 1725Lys Gln Arg Thr Phe Lys His Asn Val Ala Val Tyr Asn His Lys1730 1735 1740Gly Lys Lys Val Gly Val Leu Lys Ala Gly Arg Lys Val Val Leu1745 1750 1755Leu Asn Asn Gly Arg Thr Thr Thr Ile His Gly Lys Lys Phe Tyr1760 1765 1770Gln Val Gly Lys Asp Gln Phe Val Lys Ala Ser Asp Leu1775 1780 178权利要求
1.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法，该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的食材，以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材，其特征在于该乳酸菌包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200)，其中该基因序列定义为该prtH200为一DNA序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性，且该DNA序列选自下列群组(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同一性；(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
2.如权利要求1所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述乳酸菌更包含一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3)，其中该基因序列定义为该orfF3为一DNA序列编码成一开放读码框，且该DNA序列选自下列群组(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列；(b)一DNA序列，包含一至少75碱基对(bp)的片段，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同一性；(c)一DNA序列，编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30％的同一性；(d)一DNA序列，与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交；以及(e)一DNA序列，其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
3.如权利要求1或2所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述乳酸菌包含有一结合二种PFGE分析鉴定频带对应至283kbp频带和219kbp频带PFGE分析鉴定的登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌，其中该PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案，并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA实施电泳。
4.如前述任一项权利要求所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述食材包括动物性牛奶蛋白。
5.如权利要求4所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述动物性牛奶蛋白为酪蛋白。
6.如权利要求4所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述食材为牛奶或牛奶制品。
7.如前述任一项权利要求所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述乳酸菌为杆菌门的细菌，优选为杆菌纲，最优选为乳酸杆菌目。
8.如权利要求7所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述乳酸杆菌目中的细菌为乳酸杆菌科，优选为乳酸杆菌属，且最优选为纤维二糖乳酸杆菌。
9.如权利要求8所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法，其中所述细菌是具有登记号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变体。
10.一种制备含有抗高血压特性的肽的功能性食品的方法，该方法包括下列步骤(iii)根据权利要求1至9任一项所述的方法制备一发酵食材；以及(iv)以适当方式包装该发酵食材，得到一功能性食品。
11.一种包含具抗高血压特性的肽的功能性食品，是通过权利要求10所述的制备功能性食品的方法而获得的。
12.权利要求11所述的包含具抗高血压特性的肽的功能性食品用于制造治疗高血压的药物。
13.一种具有登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
全文摘要
使用包含有约200kDa的细胞壁蛋白酶的乳酸菌制备具有抗高血压特性的肽以及得到此乳酸菌的方法。
文档编号C12N9/48GK1685058SQ03823517
公开日2005年10月19日 申请日期2003年8月5日 优先权日2002年8月9日
发明者班奈迪特·佛林巴尔德 申请人:科·汉森有限公司