通过导入干扰rna在体内下调靶基因表达的方法

专利名称：通过导入干扰rna在体内下调靶基因表达的方法
技术领域：
本发明提供了用于通过例如，使用siRNA双链体而体内送递核酸，从而导入RNA干扰，以便在受试者体内下调靶基因表达的方法和组合物。所述方法可用于基于基因的药物开发的靶发现和验证。本发明还提供了将siRNA治疗剂用于治疗受试者的疾病，例如治疗癌症，感染性疾病和/或炎性疾病的临床应用的方法和组合物。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是转录后过程，其中，双链RNA能以序列特异性方式抑制基因表达。所述RNAi过程至少是用两个步骤完成的在第一个步骤中，通过内源核糖核酸酶将较长的dsRNA裂解成较短的，长度为21-或23个核苷酸的dsRNAs，它被称为″小的干扰RNAs″或siRNAs。在第二个步骤中，所述较小的siRNAs介导靶mRNA分子的降解。这种RNAi作用可以通过将较长的双链RNA(dsRNA)或较短的小的干扰RNA(siRNA)导入细胞内的靶序列中实现。最近，证实了RNAi还可以通过将能产生互补于靶基因的dsRNA导入质粒而实现。
RNAi方法业已成功地应用于用果蝇(20，22，23，25)，秀丽新杆线虫(14， 15，16)以及斑马鱼(20)行的基因功能确定实验中。在所述模型生物中，业已报道了化学合成的较短的siRNA或体外转录的较长的dsRNA都能有效地抑制靶基因表达。业已报道了能够在非人哺乳动物和人类细胞培养物中成功地获得RNAi作用的方法(39-56)。不过，RNAi作用在成年动物模型中是难以观察到的(57)。这至少是由于两种原因造成的首先，将长的双链RNA导入哺乳动物细胞，通过上调干扰素基因表达启动了抗病毒反应，导致细胞凋亡和死亡，以及；其次，dsRNA向所述细胞中的送递效率太低，特别是在动物疾病模型中的送递效率太低。尽管RNAi在基因靶验证和核酸治疗两方面都具有潜在的用途，由于将RNAi分子送递到动物疾病模型中的效率较低，妨碍了该技术的发展。因此，显而易见的是，非常需要体内送递RNAi分子的改进方法。
发明概述因此，本发明的目的是提供用于抑制哺乳动物体内一个或多个特定基因表达的方法。
本发明的另一个目的是提供通过抑制哺乳动物体内一种或多种特定基因的表达而治疗哺乳动物疾病的方法。
为了实现上述目的，提供了用于在哺乳动物体内下调预先选定的内源基因的方法，包括给所述哺乳动物组织施用包括双链RNA分子的组合物，其中，所述RNA分子能特异性地减少或抑制所述内源基因的表达。内源基因的这种下调作用可用于治疗哺乳动物的疾病，所述疾病是通过所述基因的表达导致或加剧的。所述哺乳动物可以是人。
还提供用于治疗与预先选定的内源基因的不希望的表达相关的哺乳动物疾病的方法，包括给所述哺乳动物的组织施用核酸组合物，并且基本上同时对所述组织施加脉冲电场，其中，所述核酸组合物能够减少所述内源基因在所述组织中的表达。所述疾病可以是癌症或癌前生长，并且，所述组织可以是，例如，乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，肺组织或卵巢组织。
所述RNA分子可以是小的干扰RNA或长的双链RNA。所述小的干扰RNA分子可以具有大约21-23bp的长度。所述长的双链RNA可以具有大约100-800bp的长度。所述RNA可以具有大约100个碱基对或更小的长度。
所述组合物可以直接给所述哺乳动物的组织施用，例如，通过直接注射到所述哺乳动物的肿瘤或关节中。
所述组合物还可以包括聚合物载体，它能够增强所述RNA分子向所述哺乳动物组织中的送递。所述聚合物载体可以包括能够结合所述RNA分子的阳离子聚合物。所述阳离子聚合物可以是氨基酸共聚物，包括，例如，组氨酸和赖氨酸残基。所述聚合物可以是支化聚合物。
所述组合物可以包括导向的合成载体，它能增强所述RNA分子向所述哺乳动物组织中的送递。所述合成载体可以包括阳离子聚合物，亲水性聚合物，和导向配体。所述聚合物可以是聚乙烯亚胺，所述亲水性聚合物可以是聚乙二醇，和/或所述导向配体可以是包括RGD序列的肽。
在上述任何方法中，可以在基本上与使用所述组合物的同时对所述组织施加脉冲电场。可以基本上同时对所述组织施加第二种电脉冲，以便增强送递。
所述内源基因可以是突变的内源基因，并且，所述突变基因中的至少一个突变可以在该基因的编码区或调控区。
所述组合物可以是载体组合物，其中，所述载体编码可操作地与调控序列连接的RNA转录物，所述调控序列控制所述转录物的转录。并且，其中，所述转录物可以在组织中形成双链RNA分子，它能特异性地减少或抑制所述内源基因的表达。所述载体可以是病毒载体或质粒，粘粒或噬菌体载体。所述调控序列可以包括启动子，例如，组织选择性启动子，如皮肤选择性启动子或肿瘤选择性启动子。所述启动子可选自下组CMV，RSV LTR，MPSV LTR，SV4 AFP，ALA，OC和角蛋白特异性启动子。
在上述任意一种方法中，所述内源基因可选自下组致癌基因，生长因子基因，血管发生因子基因，蛋白酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受体基因，基质蛋白基因，细胞因子基因，生长激素基因，和转录因子基因。所述基因可选自下组VEGF，VEGF-R，VEGF-R2，VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206。
在涉及施加电脉冲的方法中，所述脉冲可以包括至少50V的矩形波脉冲，可以通过大约10-大约20分钟将它施加在所述组织上。所述脉冲可以是单极，双极，或多极性的。所述脉冲可以包括120V的指数式衰减脉冲，它可以用大约10-大约20分钟时间施加在所述组织上。在上述每一种方法中，所述脉冲可以通过选自下组的电极施加卡规电极(caliper electrode)，弯曲电极(meander electrode)，针电极，微型针阵列电极，微型膜片电极(micropatch electrode)，环形电极，以及它们的组合。
所述卡规电极可以具有大约1cm2的面积。所述卡规电极可以施加在厚度大约为1mm-大约6mm的皮肤皱褶上。
通过以下详细说明可以了解本发明的其他目的，特征和优点。不过，应当理解的是，所述详细说明和具体实施例尽管指明了本发明的优选实施方案，但是它们仅仅是以说明的方式提供的，因为通过该详细说明，对于本领域技术人员来说，属于本发明构思和范围的各种改变和改进是显而易见的。
附图简述

图1表示在动物疾病模型上进行的电穿孔介导的RNAi送递。步骤I在宿主组织中局部送递能表达双链RNA的裸露的质粒DNA，该步骤使用双链RNA的盐溶液(大型片段-700bp，或21-23nt的寡聚体)，以及这两者；步骤II用合适的装置和探针进行脉冲电场处理；步骤III生物学读数，用于检测导向的蛋白的RNAi抑制效率和治疗效力。
图2表示在异种移植肿瘤模型中RNAi介导的荧光素酶表达的抑制作用。在三种浓度下将荧光素酶表达载体(pCI-Luc)与特异性dsRNA(Luc-dsRNA)和非特异性dsRNA(LacZ-dsRNA)直接共同送递到肿瘤内。在0.5μg，荧光素酶表达受到了载体表达的特异性dsRNA的显著抑制，但是没有受到LacZ-dsRNA的抑制。当特异性和非特异性dsRNAs的浓度都达到5μg的剂量时，所述抑制作用成为非特异性的。
图3表示通过电穿孔介导的VEGF特异性RNAi送递进行的血管发生因子VEGF的下调导致了肿瘤生长的抑制。在用VEGF165对MCF7进行永久性转导时，它变成非常具有侵袭性的肿瘤细胞系。用10μg RNAi分子进行两次电穿孔，均延迟了肿瘤的生长。
图4表示使用siRNA或dsRNA的不同的抑制动力学。尽管使用了相同的电穿孔参数、相同的送递途径以及相同数量的每一种形式的RNAi，所述肿瘤生长的抑制作用是不同的。DsRNA表现出早期的强的作用和由siRNA介导的延迟的作用。与LacZRNAi相比，对VEGF特异的dsRNA和siRNA都明确表现出序列特异性抑制。
图5表示肿瘤生长的VEGFR2特异性抑制作用。小鼠VEGFR2基因业已被认为在肿瘤血管发生和与肿瘤细胞的基质通讯中发挥重要作用。用mVEGFR2特异性RNAi进行两次肿瘤内送递然后进行电穿孔之后，与送递表达Luc的质粒和非特异性RNAi相比，肿瘤生长明显延迟。
图6表示在通过电穿孔增强将siRNA双链体(荧光标记过的)送递到肿瘤内时，它们均匀地分布在所述肿瘤中。这一结果表明，siRNA的送递与质粒不同，质粒通常仅仅局限于肿瘤内的小的区域内。
图7表示将LacZ-特异性siRNA送递到由MCF-7/VEGF165细胞形成的肿瘤内，所述细胞业已进行过工程改造，以便能内源表达LacZ。结果表明，在送递LacZ-siRNA之后24小时，20μg的siRNA获得了β-Gal表达的＞70％的减少。
图8.表示用VEGF-siRNA和LacZ-siRNA处理过的肿瘤组织的免疫组织化学染色。H&E染色证实了VEGF-siRNA处理过的肿瘤与LacZ-siRNA处理过的肿瘤具有明显不同的图像(A-B)。在用VEGF-siRNA(D)处理肿瘤时，VEGF染色(C)消失。在VEGF-siRNA处理过的肿瘤中，凋亡活性显著上调。
图9表示在体外的mRNA水平上的VEGF-siRNA剔除VEGF表达(左侧图片)导致了MDA-MB-435乳腺肿瘤生长抑制。
图10.将荧光素酶表达质粒和Luc-siRNA共同送递到MDA-MB-435肿瘤中，证实了Luc-siRNA获得了荧光素酶表达的显著剔除。
图11.在将VEGF-siRNA送递到肿瘤模型中时，所述肿瘤组织中VEGF的mRNA水平被下调。
图12.在对ICT1031或April基因表达进行RNAi剔除时，抑制了肿瘤生长。基于细胞的分析没有显示凋亡活性的显著改变。
图13.在对ICT1027或GRB2基因表达进行RNAi剔除时，抑制了肿瘤生长，并且显著提高了细胞凋亡活性。
图14.在对ICT1024或EGF-AP基因表达进行RNAi剔除时，抑制了肿瘤生长，并且显著提高了细胞凋亡活性。
图15.在对ICT1030基因表达进行RNAi剔除时，加速了肿瘤生长。
图16.与GFP-siRNA处理的肿瘤相比，PolyTran(HK聚合物)载体介导的ICT1003-siRNA送递，导致了肿瘤抑制。
图17.通过被称为口腔气管送递的方法将荧光素酶表达质粒和luc-siRNA共同送递到小鼠呼吸道中，导致了在小鼠肺中的siRNA-介导的荧光素酶抑制。测定了来自不同样品的荧光素酶活性，包括首先收获肺组织，然后在发光计中测定。
图18.通过电穿孔将荧光素酶表达质粒和luc-siRNA共同送递到小鼠肌肉中，在小鼠腿肌肉中导致了siRNA-介导的荧光素酶抑制。
图19.通过电穿孔将荧光素酶表达质粒和luc-siRNA共同送递到小鼠关节中，在小鼠腿关节中导致了siRNA-介导的荧光素酶抑制。
图20.通过IV注射进行siRNA送递的系统方法证实了肿瘤导向作用。肿瘤组织用两个圆圈标记。
图21.通过IV系统送递使用小鼠VEGF a.mVEGFR1和mVEGFR2特异性siRNA双链体，显著减少眼前部的新生血管面积。
图22.使用与图21相同的方法，在RNAi-处理过的组中红色新生血管的减少明显比对对照组的多。
详细说明提供了在体内进行有效的RNAi送递的方法。在一种实施方案中，通过使用脉冲电场(电穿孔)，局部和系统将RNAi送递到受试者体内，例如，送递到人类或其他动物体内。所述方法可以使用(1)所有形式的RNAi，例如s iRNA，dsRNA和DNA-RNA双链体；(2)所有形式的RNAi有效负荷，例如合成，体外转录的和载体表达的RNAi；和(3)可以进行电穿孔的所有类型的组织和器官。在其他方法中，使用聚合物载体并且通过静脉内(IV)送递送递所述RNAi。
本发明还提供了用于送递RNAi的介质；)被选择用于有效送递的途径，以及适用于体内电穿孔的参数。业已将本发明的方法用于实现与相应的RNAi共同送递的报道基因的下调。同样业已将所述方法成功地用于证实在送递不同的有效负荷形式的相应的RNAi之后的抗肿瘤效力，例如，通过下调血管发生因子，例如VEGF和VEGFR2的表达。
本发明业已鉴定了不同形式的RNAi的某些特性，例如，动物疾病模型中的小的干扰RNA(21-23nt)和双链RNA(大约700bp)。本发明提供了在体内获得RNAi作用的有效工具，并且拥有应用于功能性基因组研究和核酸治疗中的各种用途的巨大潜力。
业已迅速开发了RNA干扰(RNAi)在细胞培养物以及在诸如果蝇，秀丽新杆线虫，和斑马鱼的模型生物中的用途。对RNAi的研究业已发现了长的dsRNA是通过Dicer，一种细胞核糖核酸酶III加工的，以便产生具有3′突出端的大约21nt的双链体，它被称为短的干扰RNA(siRNA)，它介导了序列特异性mRNA降解(5)。对RNAi机制的理解及其迅速的发展应用，代表了在过去十年中在生物医学领域的重大突破。使用siRNA双链体干扰特定基因的表达，需要了解靶可接触性，siRNA向靶细胞中的有效送递，以及对于某些生物学用途来说，需要了解siRNA在细胞中的长期活性。
与siRNA作为功能性基因组工具的文献快速增长的同时，出现了将siRNA分子用作新型治疗剂的兴趣。成功的治疗用途，取决于局部和系统性送递方法的成功开发。将siRNA用作治疗剂的优点是由于它的特异性(3，4)，稳定性(18)以及作用机制(5，6)。
在癌症中，肿瘤发生过程被认为是致癌基因，血管发生因子，生长因子，以及突变型肿瘤阻遏物的异常的超量表达的结果，尽管其他蛋白的表达不足同样发挥着重要作用。逐渐增加的证据支持了siRNA双链体能够在体外和体内″剔除″致瘤基因的观点，导致了显著的抗肿瘤作用(6)。本发明人业已证实了在MCF-7细胞，MDA-MB-435细胞和1483细胞诱导的异种移植肿瘤模型中人类VEGF的显著降低，获得了肿瘤生长的40-80％的抑制作用。预计，VEGF-siRNA诱导的抗血管发生作用能够改变肿瘤内的微血管，并且导致肿瘤细胞凋亡的激活，并且另一方面，还能够增强细胞毒性化疗药物的效力。不过，为了实现抗血管发生剂和化疗药物的抗肿瘤效力的显著提高，需要一种高度有效的送递方法，以便在局部肿瘤组织中积累较高浓度的药物。
本发明人业已披露了验证药物靶的方法，该方法能确定哪些靶控制肿瘤疾病，并因此判断抗肿瘤药物发现(参见PCT/US02/31554)。该方法通过转基因超量表达直接在动物肿瘤模型中验证靶，并且消除缺乏疾病控制的靶。该方法减少了对蛋白生成，抗体，和/或转基因动物的需要，同时提供了靶实际控制所述疾病的明确的和确切的证据。另外，所述方法提供了有价值的信息，这些信息在使用仅仅依靠细胞培养物而缺少导致疾病病理学的多种细胞类型的复杂的相互作用的方法时可能会丢失。
本发明还披露了适合向动物肿瘤模型中进行高通量送递的基因送递技术。参见WO 01/47496，该专利的内容被以整体形式收作本文参考。所述方法能够进行质粒的定向肿瘤使用，并且与″金标准″核苷酸送递试剂相比获得了效率的显著提高(例如，提高7倍)。因此，所述方法提供了候选靶蛋白在肿瘤中的强的肿瘤表达和活性。
该平台是用于验证在肿瘤组织中表达不足的基因的有效工具。不过，用于验证在肿瘤组织中超量表达的基因的实现基因沉默的方法是高度优选的。最近，业已证实双链RNA能通过被称为RNA干扰(RNAi)的现象诱导基因特异性沉默。尽管RNAi的机制尚不完全了解，早期结果表明，这种RNAi作用可以在包括哺乳动物细胞的各种类型的细胞中在体外获得。
导向于靶mRNA的双链RNA导致了所述靶的降解，从而导致了相应基因的沉默。通过涉及酶Dicer的RNase III样活性将大的双链RNA裂解成21-23个核苷酸的较小的片段。这些被称为siRNA(小的干扰RNA)的较短的片段被认为介导了mRNA的裂解。尽管最近业已用秀丽新杆线虫和其他低等生物研究了通过RNAi机制进行的基因下调，它在培养中的哺乳动物细胞中的作用只是到最近才得到证实。最近使用萤火虫荧光素酶基因报道系统(57)在小鼠中证实了RNAi作用。
为了开发用于体内基因功能验证和用于治疗人类疾病的核酸治疗的潜在临床用途的RNAi技术平台，本发明人用携带肿瘤的小鼠模型进行了若干种体内研究。在这些实验中，将导向于肿瘤相关配体(人VEGF)或受体(小鼠VEGFR2)的siRNA或dsRNA通过肿瘤内途径送递到携带异种移植的MCF-7衍生的肿瘤或人MDA-MB-435肿瘤的裸鼠体内。我们第一次能够证实RNAi能够在体内，在肿瘤细胞中有效地使靶基因沉默，并且，其结果是抑制了肿瘤生长。
通过结合下面的实施例能够更好地理解进行了上述一般性说明的本发明，这些实施例是以说明的形式提供的，而不是要限制本发明的范围。
实施例1.通过共转染的dsRNA介导的荧光素酶报道基因在异种移植肿瘤中的沉默为了研究干扰RNAs是否能在小鼠肿瘤模型中抑制基因表达，我们使用了直接肿瘤内注射，随后进行电穿孔，以便将裸露的dsRNA和荧光素酶表达质粒DNA共同送递到裸鼠体内的异种移植的人MDA-MB-435肿瘤。简单地讲，对来自萤火虫荧光素酶基因的700bp的DNA片段进行PCR扩增，并且在PCR反应中将T7启动子序列添加到所述DNA片段的两端。然后将所述DNA片段用作DNA模板进行体外转录。所述体外转录是用购自New England BioLab的dsRNA制备试剂盒，按照生产商的说明进行的。将2μg的荧光素酶表达质粒pCILuc，与来自荧光素酶基因或LacZ基因的0.5，2，和5μg dsRNA在30μl最终体积的生理盐水中混合。用精密注射器(Stepper，Tridake)将存在于该盐溶液中的DNA/dsRNA混合物直接注射到Ncr Nu/Nu异种移植到小鼠体内的人MDA-MB-435肿瘤中。
在注射之后，立即进行脉冲电场程序(图1)。将一薄层导电性凝胶(KY Jelly)覆盖在肿瘤表面上，以便确保平板电极和肿瘤之间的良好接触，使用电穿孔仪(BTX ECM830，San Diego)通过放置在肿瘤每一侧的两个外部平板电极送递电脉冲。进行电穿孔的参数如下电压与电极距离的比例(电场强度)为200-V/cm；每一次脉冲的时间为20ms；两次脉冲之间的间隔时间为1秒(1Hz)。脉冲次数为6。在DNA注射24小时之后，在处死所述动物之后将所述肿瘤切除。在匀浆试管(LysingMatrix D，Q-BIOgene)中用800μl的1×裂解缓冲液(Promega)对每一个肿瘤进行匀浆，在4℃下使用Fastprep(Q-BIOgene)以4挡的速度匀浆40秒。在冰上孵育30分钟，然后以14,000rpm的速度对匀浆物进行离心2分钟。将上清液转移到新的试管中，并且使用荧光素酶分析试剂盒(Promega)和发光计(Monolight 2010，AnalyticLuminescence Lab.)，将10μl样品用于荧光素酶活性分析。
如图2所示，共同送递的来自荧光素酶基因的dsRNA能够在异种移植的肿瘤中使荧光素酶表达沉默。少到0.5μg的dsRNA就足以获得针对2μg的共同送递的pCILuc质粒DNA的显著的基因沉默。在将来自LacZ基因的5μg dsRNA与2μg的pCILuc质粒DNA共同送递时，观察到了非特异性dsRNA干扰作用。在较低剂量的dsRNA(0.5μg和2μg)下，没有观察到非特异性作用。只是在成年小鼠体内的异种移植的肿瘤中首次观察到dsRNA介导的特异性基因沉默。
实施例2RNAi介导的人VEGF基因沉默能在小鼠体内抑制人MCF-7衍生的肿瘤生长进行体内研究，以便证实导入的siRNA不仅能使共同送递的报道基因沉默，而且还能下调内源基因，例如VEGF的表达。当所述靶基因是肿瘤控制基因时，所述基因的下调导致了治疗效力肿瘤生长的抑制。人类VEGF能诱导血管发生和内皮细胞增殖，并且在调控血管发生方面发挥重要作用。存在若干种人VEGF的剪接变体，包括VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206，它们各自包括特定的外显子添加。VEGF165是最主要的蛋白，不过，VEGF121转录物的含量可能更丰富。VEGF165是肝素结合糖蛋白，它是作为45kDa的同二聚体分泌的。除了内皮细胞本身之外，大多数类型的细胞能分泌VEGF。由于最初发现的VEGF，即VEGF165能提高血管通透性，它又被称为血管通透性因子。另外，VEGF能导致血管扩张，在某种程度上是通过内皮细胞中一氧化氮合成酶的刺激造成的。VEGF还能刺激细胞转移并且抑制凋亡。
将两种动物模型用于比较研究。第一种肿瘤模型是用MCF-7乳腺肿瘤细胞系建立的，而第二种肿瘤模型是用来自肿瘤细胞系MCF-7/VEGF165的MCF-7建立的。在注射任何类型的RNAi之前，我们观察到了与通过MCF-7本身诱导的肿瘤相比，MCF-7/VEGF165诱导的肿瘤会导致更具侵袭性的肿瘤生长。业已报道了这种现象，并且体现了MCF-7/VEGF165通过血管发生促进活性作为肿瘤生长促进剂的作用。为了实现VEGF特异性下调，将10μg来自hVEGF基因的siRNA(21nt)或来自LacZ基因的siRNA直接注射到异种移植到裸鼠体内的过量表达人VEGF165的MCF-7、VEGF165肿瘤中。设计了两种siRNA(21nt)序列，以便导向人VEGF165基因。VEGFRNAi序列是5′-ucgagacccugguggacauuu-3′，VEGFRNAiB序列是5′-ggccagcacauaggagagauu-3′。两种siRNAs都是双链的，在两端具有两个UU突出端。为了进行肿瘤内注射，用两种siRNAs各5μg组成10μg的VEGF特异性siRNAs。另外，同样通过相同的送递方法导入相同数量的dsRNA(10μg)导向VEGF165基因。按上述方法，在siRNA注射之后，立即对肿瘤施加电脉冲。在第一次施用RNAi之后第7天第二次施用siRNA。测定肿瘤体积，作为hVEGF基因沉默的指标。
如图3所示，用非特异性LacZ siRNA处理的MCF-7/VEGF165诱导的肿瘤生长比MCF-7诱导的肿瘤快得多。施用VEGF特异性siRNA和dsRNA明确证实了肿瘤生长抑制作用。在第9天和第16天两次施用RNAi，获得了肿瘤生长的体内抑制作用。有趣的是，用VEGF特异性siRNA和dsRNA处理，得到了不同的抑制形式。用VEGF siRNAs处理，表现出延迟作用，它在23天之后表现出更强的抑制作用。另一方面，用VEGF dsRNA处理出现了更早的抑制作用，甚至是在第一次施用之后出现(图4)。以上结果证实了hVEGF siRNAs和hVEGF dsRNA在处理过的肿瘤中能使hVEGF基因特异性地沉默，因此，通过抗血管发生机制延缓了肿瘤生长。
实施例3RNAi介导的小鼠VEGFR2基因沉默，在小鼠中能抑制人MDA-MB-435肿瘤生长为了说明RNAi介导的基因沉默在通过导向内源肿瘤控制基因影响肿瘤生长方面的效力，进行了一项体内研究，以便使携带MCF-7衍生肿瘤的裸鼠中使小鼠VEGFR2基因沉默。设计了两种siRNAi，以便导向小鼠VEGFR2基因。VEGFR2RNAi序列是5′-gcucagcacacagaaagacuu-3′，VGFR2RNAiB序列是5′-ugcggcgguggugacaguauu-3′。两种siRNAs都是双链的，在两端具有两个UU突出端。由每一种siRNA各5μg构成了10μg用于送递。将10μg来自VEGFR2或LacZ基因的siRNAi或10μg的pCILuc质粒DNA直接注射到裸鼠体内的异种移植的人MCF-7衍生的肿瘤中。按上述方法，在siRNAs/DNA注射之后立即对肿瘤施加电脉冲。第二次施用siRNAs/DNA是在第一次施用之后第7天进行的。测定肿瘤体积，作为mVEGFR2基因沉默的指标。如图5所示，与用pCILuc质粒DNA或来自LacZ基因的siRNAs处理的肿瘤相比，用来自mVEGFR2的基因的siRNAs处理过的肿瘤明显生长更快。LacZ siRNAs处理不能抑制肿瘤生长，因此，证实了mVEGFR2 siRNAs能特异性地使处理过的肿瘤中的mVEGFR2基因沉默，因此能降低肿瘤生长速度。
为了进一步说明RNAi介导的基因沉默在通过导向肿瘤控制基因影响肿瘤生长方面的效力，进行了另一种体内研究，以便在携带人MDA-MB-435肿瘤的裸鼠体内使小鼠VEGFR2基因沉默。除了上述来自mVEGFR2的siRNAs之外，将10μg来自小鼠VEGFR2基因的dsRNA(长度为700nt)或来自LacZ基因的siRNAs直接注射到裸鼠体内的人MDA-MB-435异种移植的肿瘤中。按上述方法，在dsRNA/siRNAs注射之后立即对肿瘤施加电脉冲。在第一次施用之后第3天，第二次施用dsRNA/siRNAi。将10μg特异性导向于小鼠VEGFR2的DNA酶用作下调mVEGFR2基因的阳性对照。测定肿瘤体积，作为mVEGFR2基因沉默的指标。
如图6所示，与用来自LacZ基因的siRNAs处理的肿瘤相比，用来自mVEGFR2基因的dsRNA处理的肿瘤生长的明显更慢。另外，与用mVEGFR2 DNA酶处理的肿瘤相比，用来自mVEGFR2基因的dsRNA处理的肿瘤生长得明显更慢。另一方面，用来自mVEGFR2的siRNAs处理的肿瘤与用mVEGFR2 DNA酶处理的肿瘤生长速度相当，不过，与用来自LacZ基因的siRNAs处理的肿瘤相比，生长速度仍然明显更慢(图6)。由于所述LacZ siRNAs处理不能抑制肿瘤生长，我们的结论是，mVEGFR2dsRNA和mVEGFR2 siRNAs在处理过的MDA-MB-435肿瘤中能特异性使mVEGFR2基因沉默，并因此降低肿瘤生长速度。现在进行了更多的生物化学分析，以便证实肿瘤组织中的mVEGFR2基因确实被来自mVEGFR2基因的dsRNA特异性沉默。
实施例4PolyTran-介导的RNAi送递能在小鼠体内抑制人MDA-MB-435肿瘤生长可以通过聚合物介导成功地送递针对靶的RNAi，如图16中的结果所示。使用PolyTran试剂(组氨酸-赖氨酸共聚物)将针对靶ICT1003的RNAi送递到肿瘤细胞中。简单地讲，使用在WO 01/47496(该文献的整个内容被收作本文参考)披露的方法和试剂将RNAi送递到上述肿瘤模型中。将GFP-siRNA用作对照。如图16所示，与对照相比，针对ICT1003的RNAi能抑制肿瘤生长。图16中所示出的结果是使用具有结构[(HK)4KGK(HK)4]4K3的支化试剂HK4 b(参见WO 01/47496)获得的。本领域技术人员可以理解的是，可以使用其他阳离子共聚物，并且还可以使用本领域所公知的其他阳离子聚合物。
实施例5使用导向的合成载体系统送递RNAi可以将在被以它的整体形式-收作本文参考的WO 01/49324中所披露类型的导向的合成载体用于系统性送递RNAi。简单地讲，制备PEI-PEG-RGD(聚乙烯亚胺-聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)合成载体，例如，参见WO 01/49324的实施例53和56。将该载体用于通过静脉内注射系统性送递RNAi。结果如图20-22所示，图中示出了，使用这种导向的合成载体方法能够成功地送递抗VEGF RNAi分子。技术人员可以理解的是，可以使用本领域所公知的其他导向的合成载体分子。例如，所述载体可以具有由核心复合物组成的内壳，该复合物包括所述RNAi和至少一种成复合物试剂。所述载体还可以包括致融合部分，该部分可以包括锚定在所述核心复合物上的壳，或者可以直接掺入所述核心复合物中。所述载体还可以具有外壳部分，它能稳定所述载体，并且减少与蛋白和细胞的非特异性结合。所述外壳部分可以包括亲水性聚合物，和/或可以锚定在所述致融合部分上。所述外壳部分可以锚定在所述核心复合物上。所述载体可以包括导向部分，它能增强所述载体与靶组织和细胞群体的结合。合适的导向部分为本领域所公知，并且详细披露于WO 01/49324中。
RNAi送递的其他方法对于某些用途来说，RNAi可以作为“裸露的”试剂直接使用，采用或不采用电穿孔方法。例如，可将其用于送递RNAi分子和编码RNAi分子的载体，例如，通过直接注射使它进入肿瘤组织，并且直接注射到关节中。所述RNAi可存在于合适的载体中，例如，盐溶液或缓冲的盐溶液。
靶验证药物靶验证的最终目标是证实候选靶确实能控制有关疾病。控制疾病的靶是判断药物发现的高价值靶。药物开发的目标是能选择性地导向于关键途径的产物，以及所述途径的关键控制因子，以便提供对有关疾病的有效的治疗控制。所述关键途径和因子的验证需要证实控制所述疾病的各个候选靶的添加或扣除，即导致病理学的明显的加重或减轻。体外基于细胞的方法业已提供了有助于鉴定和选择潜在靶的有用信息。不过，靶控制与疾病相关的体外细胞模型的能力通常不足以证实实际控制所述疾病过程的靶，即多种细胞类型的复杂的相互作用导致了疾病病理学。通过靶决定性地证实疾病控制，只能够通过在真实的疾病模型中研究所述靶而获得。
通过基因组方法业已大大加速了靶发现过程，不过验证仍然是瓶颈。第一代基因组方法业已产生了在所述验证步骤中积累的大量的候选靶。有多种方法被用于研究所述基因靶的功能，并且用于验证它们在疾病过程中的作用。上述很多方法尽管具有高效和高通量的优点，但通常只能在确定与疾病过程的相关性或关系方面获得成功，而不是确定控制作用。业已证实了较新的基因剔除和正向或反向基因组方法是有用的，但是，这些方法鉴定了其抑制或突变可能具有基本作用的基因，缺少来自基因超量表达的具有潜在价值的信息。另外，它们还利用了最初的体外的基于细胞的表型，它不能体现大部分疾病的复杂的多细胞机制，如肿瘤血管发生，因此，存在缺少相邻的细胞途径中的重要靶或提供没有完整的生物学联系的不完全的疾病关系的危险。
快速确切地靶验证可以将本发明的方法用于验证癌相关的药物靶。所述方法可以通过在肿瘤组织中使内源基因沉默直接在动物肿瘤模型中验证靶，并且可以与涉及基因超量表达的方法先后使用。参见PCT/US 02/31554。所述方法减少了对确切验证的高成本的和缓慢的步骤的需要，如基因克隆和测序，蛋白和抗体或转基因动物的制备。这两种方法的组合大大加快了所述过程，并且，最重要的是，迅速消除了较弱的靶。另外，通过所述方法获得的结果提供了清楚并且确切的证据，即靶确实控制有关疾病，这是进行药物发现的有价值的步骤所需要的关键验证。可以将所述方法用于完成任何候选靶的验证，如用细胞培养物，模型生物，转基因动物等制备的靶。
靶发现捕捉在初步验证中缺少的靶不幸的是，另一个因素是，在采用体外或疾病相关的方法时，作为靶发现和验证的初次“过滤”，很多很有价值的疾病控制靶可能会丢失。很多疾病控制靶可能只能在完整的疾病模型环境中出现。例如，控制肿瘤血管发生的靶只能在肿瘤和血管的结合部分出现。对于肿瘤来说，某些有价值的靶可能只能通过研究包括肿瘤和周围组织的组合的体内生物学系统发现。
高处理量靶发现方案我们业已提出了挑战发现疾病控制靶的方案。该方案是通过用于以高通量操作而筛选大量的基因靶以放大所述基础方法。通过在动物肿瘤模型中放大加工多种候选基因的方法，这种方法能够提供跳过很多场合下的初步功能性验证方法的机会。
肿瘤靶消除本发明方法本身或者与PCT/US 02/31554中所披露的方法组合，可以迅速测试候选靶对肿瘤生长的控制能力。由于优选对肿瘤生长具有强的作用的候选物，可以将对肿瘤生长只具有弱的或微不足道的控制的候选物取消。所述肿瘤靶区别方法能快速将靶分成三种类型能促进肿瘤生长的靶，对肿瘤生长少有作用的靶，以及能抑制肿瘤生长的靶。
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权利要求
1.一种用于在哺乳动物体内下调预先选定的内源基因的方法，包括给所述动物的组织施用包括双链RNA分子的组合物，其中，所述RNA分子能特异性地减少或抑制所述内源基因的表达。
2.如权利要求1的方法，其中，所述RNA分子是小的干扰RNA。
3.如权利要求2的方法，其中，所述RNA分子是长度大约为21-23bp的小的干扰RNA分子或长的双链RNA。
4.如权利要求2的方法，其中，所述RNA分子是长度大约为100-800bp的长的双链RNA。
5.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述组合物是直接给所述哺乳动物的组织施用的。
6.如权利要求5的方法，其中，施用是通过注射到所述哺乳动物体内的肿瘤中或注射到所述哺乳动物的关节中进行的。
7.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述组合物还包括能增强所述RNA分子向所述哺乳动物的组织中送递的聚合物载体。
8.如权利要求7的方法，其中，所述聚合物载体包括能结合所述RNA分子的阳离子聚合物。
9.如权利要求8的方法，其中，所述阳离子聚合物是氨基酸共聚物。
10.如权利要求9的方法，其中，所述聚合物包括组氨酸和赖氨酸残基。
11.如权利要求10的方法，其中，所述聚合物是支化聚合物。
12.如权利要求1-5中任意一项的方法，其中，所述组合物包括导向的合成载体，它能增强所述RNA分子向所述哺乳动物组织中的送递。
13.如权利要求12的方法，其中，所述载体包括阳离子聚合物，亲水性聚合物，和导向配体。
14.如权利要求12的方法，其中，所述阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。
15.如权利要求12的方法，其中，所述亲水性聚合物是聚乙二醇。
16.如权利要求15的方法，其中，所述导向配体是包括RGD序列的肽。
17.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，基本上在施用所述组合物的同时，对所述组织施加脉冲电场。
18.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述内源基因是突变的内源基因。
19.如权利要求18的方法，其中，所述突变基因上的至少一个突变在所述基因的编码区或调控区上。
20.如权利要求17的方法，还包括基本上同时对所述组织施加第二个电脉冲。
21.一种用于在哺乳动物中下调预先选定的内源基因的方法，包括给所述哺乳动物的组织施用载体组合物，其中，所述载体编码可操作地与调控序列偶联的RNA转录物，该调控序列调控所述转录物的转录，并且，其中，所述转录物能够在所述组织中形成双链RNA分子，它能特异性地减少或抑制所述内源基因的表达。
22.如权利要求21的方法，其中，所述载体是病毒载体或质粒，粘粒或噬菌体载体。
23.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述内源基因选自致癌基因，生长因子基因，血管发生因子基因，蛋白酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受体基因，基质蛋白基因，细胞因子基因，生长激素基因，和转录因子基因。
24.如权利要求21的方法，其中，所述调控序列包括启动子。
25.如权利要求24的方法，其中，所述启动子是组织选择性启动子。
26.如权利要求25的方法，其中，所述组织选择性启动子是皮肤选择性启动子或肿瘤选择性启动子。
27.如权利要求24的方法，其中，所述启动子选自CMV，RSV LTR，MPSV LTR，SV40，AFP，ALA，OC和角蛋白特异性启动子。
28.如权利要求17的方法，其中，所述电脉冲包括至少50V的矩形波脉冲，它是用大约10-大约20分钟时间施加到所述组织上的。
29.如权利要求28的方法，其中，所述电脉冲是单极，双极或多极性的。
30.如权利要求17的方法，其中，所述电脉冲包括120V的指数式衰减脉冲，它是用大约10-大约20分钟时间施加在所述组织上的。
31.如权利要求17的方法，其中，所述电脉冲是通过选自下组的电极施加的卡规电极，弯曲电极，针电极，微型针阵列电极，微型膜片电极，环形电极，以及它们的组合。
32.如权利要求31的方法，其中，所述电极是具有大约1cm2的面积的卡规电极。
33.如权利要求32的方法，其中，所述卡规电极被应用在厚度为大约1mm-大约6mm的皮肤皱褶上。
34.一种用于治疗与不希望的预先选定的内源基因表达相关的哺乳动物疾病的方法，包括给所述哺乳动物的组织施用核酸组合物，并且基本上同时对所述组织施加脉冲电场，其中，所述核酸组合物能够减少所述内源基因在所述组织中的表达。
35.如权利要求34的方法，其中，所述疾病是癌症或癌前生长。
36.如权利要求34的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，肺组织或卵巢组织。
37.如权利要求34的方法，其中，所述核酸组合物包括小的干扰RNA，长的双链RNA，或编码RNA转录物的多核苷酸分子，它能形成基本上为双链的RNA分子。
38.如权利要求37的方法，其中，所述RNA分子是长度大约为21-23bp的小的干扰RNA分子。
39.如权利要求37的方法，其中，所述RNA分子是长度大约为100-800bp的长的双链RNA。
40.如权利要求39的方法，其中，所述RNA的长度为大约100个碱基对或更少。
41.如权利要求34的方法，其中，所述核酸组合物是能够编码siRNA或RNAi的载体，并且，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒载体。
42.如权利要求41的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或腺病毒载体。
43.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述哺乳动物是人。
44.如权利要求34的方法，其中，所述预先选定的内源基因选自致癌基因，生长因子基因，血管发生因子基因，蛋白酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受体基因，基质蛋白基因，细胞因子基因，生长激素基因，和转录因子基因。
45.如权利要求34的方法，其中，所述基因选自VEGF，VEGF-R，VEGF-R2，VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206。
全文摘要
提供了通过RNA干扰在体内下调靶基因表达的方法和组合物。该方法可用于基于基因的药物开发的靶发现和验证，并且用于人类疾病的治疗。
文档编号C12P19/00GK1720257SQ03823860
公开日2006年1月11日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年8月6日
发明者P·V·斯卡里亚, M·C·沃德尔, P·Y·卢, Q·唐, J·徐, F·Y·谢 申请人:因特拉迪格姆公司