专利名称：通过法夫酵母生产角黄素的制作方法
技术领域：
本发明涉及叶黄素类胡萝卜素的生产，尤其涉及通过法夫酵母(Phaffia)属的微生物来生产角黄素和海胆烯酮。
更特别的，本发明提供了一种生产叶黄素类胡萝卜素的方法，尤其是通过遗传修饰的法夫酵母属的重组微生物来生产角黄素和海胆烯酮的方法。
采用本发明的方法，可以在法夫酵母属的重组微生物中生产除了虾青素之外的其他有用的叶黄素类胡萝卜素，如作为主要叶黄素类胡萝卜素的角黄素和海胆烯酮。
任何能生产β-胡萝卜素的菌株都可作为合适的宿主菌株。当选择的宿主菌株是能从β-胡萝卜素中生产虾青素的常规法夫酵母菌株时，在编码β-胡萝卜素酮酶的基因被导入和表达后，可产生虾青素和其他叶黄素类胡萝卜素的混合物。另一方面，当不能产生虾青素和可积累β-胡萝卜素的菌株被选择作为所述的宿主菌株时，可以预期产生最高水平的叶黄素类胡萝卜素如角黄素和海胆烯酮，并且无虾青素的积累。可通过诱变累积虾青素的红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)获得累积β-胡萝卜素的宿主菌株。可选的，还可通过失活虾青素合成酶来获得累积β-胡萝卜素的宿主菌株，虾青素合成酶是一种涉及从β-胡萝卜素中合成虾青素的生物合成过程的酶，其公开于美国专利US 6,365,386中。虾青素合成酶基因的破坏是酶失活最常规的方法之一。
此外，还可通过公共典型培养物保存中心获得这类累积β-胡萝卜素的宿主菌株。例如，可从美国典型培养物保存中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)购买累积β-胡萝卜素的红法夫酵母P.rhodozyma ATCC96815菌株。分离一种新的β-胡萝卜素累积红法夫酵母菌株，它可以是从自然环境中产生虾青素基因的菌株之衍生物或自发突变体，这将是制备本发明宿主菌株的另一种途径。
一方面，本发明涉及一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括培养表达β-胡萝卜素酮酶的重组法夫酵母菌株。
所述的β-胡萝卜素酮酶催化β-胡萝卜素中的β-紫罗兰酮环上的4和4′位置上的亚甲基转化为酮基基团，从而经海胆烯酮产生叶黄素、角黄素。已从许多物种中分离得到编码该酶的基因，例如从海洋细菌中分离的crtW(橙黄琼脂杆菌(Agrobacterium aurantiacum)和产碱菌属(Alcaligenessp.))，从Paracoccus marcusii中分离的crtW(GenBank登记号No.Y15112)，从Paracoccus carotinifaciens sp.nov.中分离的crtW，和从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中分离的bkt基因(GenBank登记号No.D45881)。
在本发明中，编码具有β-胡萝卜素酮酶活性的蛋白的任何基因均可采用。
优选的，所述β-胡萝卜素酮酶基因可从选自如下属微生物组的微生物中获得土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱菌属、副球菌属(Paracoccus)、和具有β-胡萝卜素酮酶基因的红球藻(Haematococcus)。
更优选，所述β-胡萝卜素酮酶基因可从选自如下组的微生物中获得橙黄琼脂杆菌(GenBank登记号No.D58420)、产碱菌PC-1(GenBank登记号No.D58422)、Paracoccus marcusii MH1(GenBank登记号No.Y15112)、格兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)(日本专利JP-A昭和10-155497的说明书中记载了来源于该微生物的β-胡萝卜素酮酶基因的DNA序列)、和携带β-胡萝卜素酮酶基因的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(GenBank登记号No.D45881)，其中GenBank登记号表示来源于不同微生物的各自的β-胡萝卜素酮酶基因的DNA序列。
更优选，所述的β-胡萝卜素酮酶基因可来源于产碱菌PC-1，或者其基本上同源的DNA序列。
术语“基本上同源的DNA序列”是指所述编码β-胡萝卜素酮酶的DNA序列为编码氨基酸序列的DNA序列，其中该氨基酸序列与产碱菌PC-1的crtW氨基酸序列相比具有超过60％，优选超过70％，更优选超过80％，和最优选超过90％的同源性，并且该多肽的氨基酸序列与产碱菌PC-1的crtW编码的酶具有相同类型的酶活性。
通过利用β-胡萝卜素酮酶基因，可以使法夫酵母属的微生物具有生产角黄素和海胆烯酮的能力。可采用公知的重组技术来制备表达β-胡萝卜素酮酶基因的法夫酵母重组微生物。
用于分离和克隆编码本发明β-胡萝卜素酮酶DNA的技术为本领域的常规技术，其包括从基因组DNA中的分离。可通过聚合酶链反应(下文中称作PCR)来实现由这种基因组DNA来克隆本发明的DNA序列。
分离或克隆的编码β-胡萝卜素酮酶的DNA在克隆至适当的表达载体后可优选的用于在宿主微生物法夫酵母中表达所述酶。
“表达载体”包括能表达所含的DNA序列的载体，其中所述的序列可操纵的与其他序列，如能影响所述DNA序列在法夫酵母属的微生物中表达的调控序列相连接。术语“可操纵的连接”是指一种并列方式，其中所述的元件间呈以允许其按照其预期的方式行使功能的关系。术语“调控序列”包括，最小程度，是指感兴趣基因表达所需的元件；并且还可包括其他的有用元件。一般而言，调控序列包括启动子、终止子，和在某些情况下包括增强子、反式激活蛋白、或转录因子。组成型启动子，如来源于红法夫酵母(P.rhodozyma)(WO 97/23,633)的甘油醛-3-脱氢酶(GAP)基因启动子可用于实现组成型表达。诱导型启动子还可被用于实现精确调控表达。诱导型启动子的实施例之一为编码热休克蛋白或淀粉酶基因及其类似物的启动子。
本领域技术人员公知的方法可被用于构建所述的表达载体。
它的含义是，虽然没有清楚的阐述，即所述表达载体必须以游离基因的方式或作为整合至染色体DNA的一部分的方式在宿主有机体中进行复制。通常，在后一种情况下可以预计所述基因具有更高的稳定性。为了通过同源重组的方式将表达载体整合至宿主微生物染色体上，制备含有与宿主基因组DNA同源的DNA片段的至少一部分的载体。基于此，在法夫酵母属的微生物中可有效的采用rDNA基因片段。所述的rDNA为一种在基因组中以多拷贝方式存在的卫星DNAs。通过采用rDNA片段作为表达载体上的靶DNA，所述载体上的待表达目的DNA可被整合至宿主基因组上，并且也可以多拷贝的形式存在。这可提高基因用量效果，从而有助于目标酶的超表达。在本发明实施例中，所述的rDNA片段可以方便的用于该目的。本发明试图包括那些具有等效功能，并在以后公开的其他形式的表达载体。
可采用各种方式来操纵编码β-胡萝卜素酮酶的分离的DNA序列以实现多肽表达。根据表达载体的需要，在插入表达载体之前，可取的或必须的可对编码所述β-胡萝卜素酮酶的核酸序列进行操作。修饰用于克隆方法的核酸序列的技术是本领域已知的。
克隆于表达载体中的含有所述β-胡萝卜素酮酶的重组DNA可被导入宿主微生物中。将外源DNA导入真菌细胞(包括法夫酵母属的微生物)中的方法是本领域公知的。其包括，例如，通过LiCl方法转化，原生质体融合，电穿孔，通过采用DNAs包裹的粒子进行轰击的粒子枪方法。在本发明的实施例中，采用粒子枪方法作为红法夫酵母的转化方法。本领域技术人员公知粒子枪方法的操作步骤。
从而获得的重组有机体可超表达编码β-胡萝卜素酮酶的DNA序列。因此，本发明的重组有机体可用于叶黄素类胡萝卜素，尤其是角黄素和海胆烯酮的生产过程。
本发明的另一方面涉及一种生产角黄素和海胆烯酮的生物方法，其包括在需氧条件下，在含有生产类胡萝卜素底物的水溶液营养培养基中培养法夫酵母重组微生物，并从所述重组微生物或从培养基中分离获得的类胡萝卜素。
包括叶黄素的类胡萝卜素通常通过在培养基中培养法夫酵母菌株来生产，其中所述培养基含有细胞所需的适量的大量和微量营养元素，如作为细胞生长所需的碳源和生产类胡萝卜素的底物的糖蜜、蔗糖或葡萄糖，以及氮源如玉米浸出液、酵母提取物、硫酸氢二铵、磷酸铵、氢氧化铵或尿素，以及磷源如磷酸铵和磷酸，和添加的微量营养元素或无机盐，如硫酸镁、硫酸锌和生物素或脱硫生物素。
培养的优选条件为4至8的pH范围，温度为15至26℃，培养24至500小时。更优选的培养条件为5至7的pH范围，温度为18至22℃，培养48至350小时。
在培养过程中，通气和搅拌通常有助于获得更好的类胡萝卜素生产效果。
当采用本发明的方法，通过培养重组法夫酵母菌株生产得到类胡萝卜素后，当其分泌至培养基中时，可从培养基中分离类胡萝卜素，或从微生物细胞中分离；并且当只需要一种特定类胡萝卜素时，如果需要，可采用本领域公知的方法将其与其他类胡萝卜素分离开。
按照本发明方法生产得到的类胡萝卜素可用于食品或饲料的加工。本领域普通技术人员熟知该过程。这类复合食品或饲料可进一步包括常规用于该目的、且本领域公知的添加剂或组分。
如下实施例用于进一步举例说明本发明，且其不用于限制本发明的范围。
在下述实施例中采用如下材料和方法菌株红法夫酵母ATCC96594菌株(按照布达佩斯条约于1998年4月8日进行再保藏，保藏号No.ATCC 74438)红法夫酵母ATCC96815菌株(按照布达佩斯条约于1999年2月18日进行再保藏，保藏号No.ATCC 74486)E.coli TOP10F-，mcrA，δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，δ(lacZ M15)，δ(lacX74)，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)pGEM-T(Promega公司，USA)方法限制性内切酶和T4DNA连接酶购于Takara Shuzo(Ohtsu，JP)。利用Perkin Elmer2400型热循环仪进行聚合酶链反应(PCR)。每个PCR条件均在实施例中记载。从商业提供商处购得PCR引物。用于DNA测序的荧光DNA引物购于Pharmacia。采用自动荧光DNA测序仪(ALFred，Pharmacia)进行DNA测序。
β-胡萝卜素的标准样品购于WAKO(Osaka，日本)。叶黄素和海胆烯酮购于Roche Vitamins AG(Basle，瑞士)。
实施例1表达载体元件的制备制备了表达载体元件G418抗性基因，红法夫酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(下称GAP)的启动子和终止子区域，和P.rhodozyma的rDNA片段。
按如下方法制备G418抗性基因盒。将Sac I-接头连接至携带有G418抗性基因盒的pUC-G418(US专利No.6,365,386 B1)载体的特定Hind III位点，将得到的载体命名为pG418Sa512。
将从pG418Sa512上切下的1.7kb KpnI/Sac I片段用作G418抗性基因盒。
利用红法夫酵母ATCC 96594的基因组DNA作为模板，通过PCR得到GAP基因的每一启动子和终止子以及rDNA片段。为了获得基因组DNA，使用了QIAGEN血液&细胞培养DNA中型试剂盒(QIAGEN，德国)和通过在YPD(Difco实验室)培养基中过夜培养得到的P.rhodozyma ATCC 96594细胞。
采用制备的基因组DNA作为模板，利用Advantage-HF PCR试剂盒(CLONTECH实验室，Inc.，USA)和热循环仪(Perkin Elmer 2400，USA)进行PCR反应。
用于扩增GAP启动子序列的合成引物为GAP#1(SEQ ID NO1)(具有Not I位点GCGGCCGC)和GAP#5(SEQ ID NO2)(具有Sma I位点CCCGGGG)。
开始的模板变性步骤包括94℃5分钟。重复25个扩增循环94℃30秒，55℃30秒，和72℃1分钟。在72℃下反应另外10分钟后，将反应混合物在4℃下保存。通过该反应，扩增得到了含GAP启动子(398bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司，USA)将该扩增的GAP启动子与pCR2.1-TOPO载体连接并导入E.coli TOP 10细胞中。挑选了几个克隆子用于测序分析。检查了每一候选克隆子的克隆的GAP启动子序列。将显示出具有与红法夫酵母GAP启动子序列(GenBank登记号No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名为pTOPO-pGAP2#1。从pTOPO-pGAP2#1上切下的一398bp NotI/Sma I片段被用作GAP启动子表达盒。
用于扩增GAP终止子的两条合成引物为GAP#33(SEQ ID NO3)(具有BamH I-Sal I位点GGATCCGTCGAC)和GAP#4(SEQ ID NO4)(具有Kpn I位点GGTACC)。
其PCR反应条件与上述GAP启动子的反应条件相同。通过该反应，扩增获得了含GAP终止子(302bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆试剂盒将扩增的GAP终止子与pCR2.1-TOPO载体连接并导入E.coli TOP 10细胞中。挑选了几个克隆子用于测序分析。检查了每一候选克隆子的克隆的GAP终止子序列。将显示出具有与红法夫酵母GAP终止子序列(GenBank登记号No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名为pTOPO-tGAP#1。从pTOPO-tGAP#1上切下的一302bp BamHI/Kpn I片段被用作GAP终止子表达盒。
用于扩增rDNA片段的的两条合成引物为R#1(SEQ ID NO5)(具有Sac I位点GAGCTC)和R#2(SEQ ID NO6)(具有NotI-Sac I位点GCGGCCGCGAGCTC)。
其PCR反应条件与上述GAP启动子的反应条件相同。通过该反应，扩增获得了含rDNA(3126bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆试剂盒将扩增的rDNA片段与pCR2.1-TOPO载体连接并导入E.coli TOP 10细胞中。挑选了几个克隆子用于测序分析。检查了每一候选克隆子的克隆的rDNA序列。将显示出具有与红法夫酵母rDNA序列(GenBank登记号No.D31656,AF139632)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名为pTOPO-rDNA#1。从pTOPO-rDNA#1上切下的一1960bp SacII/Not I片段被用作rDNA表达盒。
实施例2携带β-胡萝卜素酮酶基因(crtW)的表达载体的构建及其在角黄素和海胆烯酮的生产中的用途通过逆向翻译氨基酸序列(GenBank登记号D58422)，采用基于PCR的基因合成方法获得了编码产碱菌株PC-1的β-胡萝卜素酮酶的人工crtW基因。详细的方法记载于US 6,124,113专利的实施例中。在该情况下，设计了两条末端引物用于分别向crtW基因的5′-末端和3′-末端导入限制性酶切位点Sma I和BamH I。
采用pGEM-T做为主链，按顺序连接rDNA表达盒和GAP启动子表达盒(实施例1中获得的)，以及上述构建的crtW基因，和GAP终止子表达盒和G418抗性基因表达盒(实施例1中获得的)，从而构建携带crtW基因的表达载体。
采用如EP 1,158,051中所述的粒子枪方法将获得的表达载体导入红法夫酵母ATCC 96815中。
将获得的P.rhodozyma ATCC 96815的crtW-重组菌株首先在盛有7ml种子培养基的试管(直径21mm)中在20℃下震荡培养3天，然后将其接种至盛有50ml生产培养基的500ml锥形瓶中在20℃下震荡培养7天。取适量体积的培养物用于细胞生长分析和类胡萝卜素生产。
培养基组分如下种子培养基葡萄糖30.0g/l，NH4Cl 4.83g/l，KH2PO41.0g/l，MgSO4-7H2O 0.88g/l，NaCl 0.06g/l，CaCl2-2H2O 0.2g/l，KH phtalate 20.0g/l，FeSO4-7H2O 28mg/l，微量元素溶液0.3ml，维生素贮存液1.5ml，(调节pH5.4-5.6)微量元素溶液4NH2SO4100ml/l，柠檬酸-H2O 50.0g/l，ZnSO4-7H2O16.7g/l，CuSO4-5H2O 2.5g/l，MnSO4-4，5H2O 2.0g/l，H3BO32.0g/l，Na2MoO42.0g/l，KI 0.5g/l，用于种子培养基的维生素贮存液4N-H2SO417.5ml/l，肌醇40.0g/l，烟酸2.0g/l，D-泛酸钙(Ca-D-Pantothenate)2.0g/l，维生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-对氨基苯甲酸1.2g/l，维生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素贮存液8.0ml生物素贮存液通过向50ml乙醇中添加4N-H2SO4至总体积100ml来制备。然后，加入400mg的D-生物素。
生产培养基葡萄糖22.0g/l，KH2PO414.25g/l，MgSO4-7H2O 2.1g/l，CaCl2-2H2O 0.865g/l，(NH4)2SO43.7g/l，FeSO4-7H2O 0.28g/l，微量元素溶液4.2ml，维生素贮存溶液9.35ml，(调节pH至5.5)用于生产培养基的维生素贮存溶液4N H2SO417.5ml/l，烟酸2.0g/l，D-泛酸钙3.0g/l，维生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-对氨基苯甲酸1.2g/l，维生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素贮存液30.0ml一部分种子培养物(2.5ml)被转移至盛有47.5ml生产培养基的500ml的锥形瓶中。然后在20℃下以200rpm的速度旋转震荡培养。在发酵后第二天，向培养基中加入50％葡萄糖溶液5ml并继续发酵。在发酵的第四天，取2ml培养物并再次向培养基中加入5ml 50％葡萄糖溶液，并继续培养3天。在第七天，取部分培养物用于类胡萝卜素产量和细胞生长的分析。
为了进行细胞生长分析，采用UV-1200光度计(Shimadzu Corp.，Kyoto，日本)测量660nm处的光密度。
为了进行β-胡萝卜素，角黄素和海胆烯酮含量的分析，将提取的培养基与溶剂混合物(乙基乙醇，己烷和乙基乙酸盐)混合，并通过加入玻璃珠剧烈震荡从P.Rhodozyma的细胞和培养物中提取类胡萝卜素。提取后，通过离心除去破裂的细胞和玻璃珠，取获得的上清液利用HPLC进行类胡萝卜素含量分析。
使用的HPLC条件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)；温度室温；洗脱液丙酮/己烷(18/82)加到1ml/l水用于洗脱；注射体积10μl；流速2.0ml/min；检测450nm UV。
序列表<110>Roche Vitamins AG<120>通过法夫酵母生产角黄素<130>NDR5224<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工的<400>1gcggccgctg gtgggtgcat gtatgtac 28<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<400>2cccggggatg gtaagagtgt tagaga 26<210>3<211>33<212>DNA<213>人工的<400>3gga tccgtcg actaaacggt tctctccaaa ccc 33<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<400>4ggtaccttga tcagataaag atagagat 28<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<400>5gagctctcga gtggacggtg 20
<210>6<211>28<212>DNA<213>人工的<400>6gcggccgcga gctcatcccg cttcactc 28
权利要求
1.一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括在需氧条件下，在含水营养培养基中培养Xanthophyllomyces(法夫酵母Phaffia)属的表达β-胡萝卜素酮酶基因的重组微生物，并从所述重组微生物细胞或从液体培养物中分离得到的类胡萝卜素。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物来源于Xanthophyllomyces dendrorhous(红法夫酵母Phaffia rhodozyma)ATCC96815，或其突变体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述β-胡萝卜素酮酶基因来源于选自如下的微生物土壤杆菌属、产碱菌属、副球菌属、和红球藻，其具有β-胡萝卜素酮酶基因。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述β-胡萝卜素酮酶基因来源于选自橙黄琼脂杆菌、产碱菌PC-1、Paracoccus marcusii MH1、革兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)、和雨生红球藻，其携带β-胡萝卜素酮酶基因的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述β-胡萝卜素酮酶基因来源于产碱菌PC-1或与其基本上同源的β-胡萝卜素酮酶基因的DNA序列。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的β-胡萝卜素酮酶基因在使用了调控序列的重组微生物中表达。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述培养在pH4至8的范围和15至26℃的温度范围中培养24至500小时。
8.如权利要求7所述的方法，其中培养在pH5至7的范围和18至22℃的温度范围中培养48至350小时。
全文摘要
本发明公开了一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括在需氧条件下，在水溶液营养培养基中培养一种来源于Xanthophyllomyces(法夫酵母)属的、表达β－胡萝卜素酮酶基因的重组微生物，并从所述的重组微生物细胞中或从培养基中分离得到类胡萝卜素。
文档编号C12N9/02GK1788091SQ03825474
公开日2006年6月14日 申请日期2003年9月16日 优先权日2002年9月27日
发明者星野达雄, 尾岛和之, 濑户口丰 申请人:Dsm Ip资产公司