专利名称：一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，更具体地说涉及一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法。
核酸是生物物种的遗传物质，它包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本组成是四种核苷酸(或碱基)，在DNA中它们分别由A、C、G、T代表，在RNA中它们分别由A、C、G、U代表。核苷酸(碱基)在核酸中以串联的方式组成链状结构，DNA一般为双链结构，RNA为单链结构；DNA的双链结构可以在适当的条件下分解成单链，单链的DNA也可以与单链的RNA形成双链结构。在一核酸结构中，一部分可以是单链另一部分可以是双链。在双链的核酸结构中碱基A与另一链的T(U)通过氢键形成碱基对，同理G与另一链的C形成碱基对，能形成碱基对的碱基为互补碱基。如一核酸链与另一核酸链有完全互补的碱基序列，则这两条核酸链称为互补核酸链，互补的核酸链可形成稳定的双链结构，由互补的两单链分子结构形成双链分子结构的过程称为分子杂交。非完全互补的核酸链(部分互补)在特定条件下也会形成双链分子结构。在生物体及试管中，单链的核酸链可在酶的作用下复制出互补的核酸链，在复制过程中，被复制的核酸链称为模板分子，所需的酶为聚合酶，聚合酶可分为DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA互补链，RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA互补链，逆转录酶以RNA为模板合成DNA互补链。引物为核酸片段，它与模板分子互补并杂交形成双链结构。核酸聚合酶反应的始点决定于引物的位置，DNA的聚合反应从引物的3’末端开始(DNA及cDNA聚合反应)。RNA聚合酶反应需要有双链的被RNA聚合酶识别的结构，称为驱动子。引物核酸片段可以由几个或几十个碱基(核苷酸)组成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通过降解自然核酸而取得的片段，也可以通过人工化学合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的组成单位(结构)，非自然的组成单位(结构)包括在自然界中不是核酸组分的结构，也包括不存在于自然界的化学结构。通过引物与模板分子的杂交，可以控制模板分子的复制以及模板分子的扩增。核酸序列在进化过程中和外界条件的影响下会发生变化，最常见的变化为一碱基被另一碱基所取代，在同一物种中，同一核酸序列的同一位置(单碱基位置)在不同的个体之间如有不同的碱基成分，则这一种现象称为单碱基(核苷酸)多态性(SNP)。在特定个体中，多态性位点的一种碱基组成为这一位点的一种基因型(基因为核酸的功能性区域)，一个单倍体生物个体在一个多态点上只能有一个基因型，在双倍体的生物个体中如二同源基因具有相同的基因型，这一个体为纯合子，如有不同的基因型，则这一个体为杂合子。基因型测定对遗传诊断、物种鉴定、药物筛选等具有重大意义。DNA可以在聚合酶等的作用下被复制，即由模板链复制出互补链，DNA的复制需要有一引物，引物一般为一含有几个或几十个碱基的核酸链，核酸链具有方向性分别用5’端和3’端表示，接近5’端的序列称为5’端部分，接近3’端的称为3’端部分，核酸复制前引物与模板在3’端有特异性地根据碱基配对原理结合成双链结构(这一过程称为分子杂交)，此后聚合酶可从引物的3’端开始沿5’→3’方向合成与模板相互补的新链，新形成的双链可在高温下(＞90℃)分离成独立的单链，当温度下降时余下的引物分子可再与相应的模板核酸分子杂交，并可在聚合酶的作用下复制出新的核酸链，反复如上过程，一个核酸片段可被扩增出千万个同样的分子片段，如上过程即为聚合酶链反应过程(PCR)。一核酸样品需扩增的部分为靶片段，进行PCR反应一般在靶片段两端要有相应的引物，对一多态位点附近的序列专一的引物为多态性引物，对一多态性位点的特定基因型有专一性的为基因型引物，多态性引物可和基因型引物结合使用对靶片段进行PCR扩增，并测定基因型。用化学的方法可以人工合成核酸片段作为引物，引物的碱基序列与靶片段序列相互补，另外引物序列中可具有与核酸样品中的序列非互补的序列，这种与样品不具互补性的序列称为外源序列，外源序列可作为引物的部分结构。基因芯片是一种把不同核酸分子分别排列于特定位置，并用于核酸分子杂交的装置，固定于基因芯片上的核酸分子为探针分子，与探针分子进行特异性杂交的为靶分子，探针分子可通过在芯片的位置或所带的标记进行靶分子识别，标记可有多种形式，如放射性标记、荧光标记、纳米颗粒标记、酶标记、色素标记等，用以区别不同基因型的具标记的核酸探针分子为基因型探针。由引物引发的聚合反应或扩增反应常用于分子生物学的基础研究，基因工程，以及遗传诊断和与分子生物学相关的检测。要检测一种或多种食品样品时，所需筛选和扩增的靶分子种数可达数百以上，进行分子检测时如用常规的PCR方法，需要合成大量的引物，并用大量的反应分别对靶分子进行筛选和扩增。这种做法所需的人力和物力、费用都很大。如果把多个引物组合在一个PCR反应中，这些引物之间的相互作用会产生副产物。已有的食品微生物病毒检测还是沿续传统的培养、分离、鉴定(形态鉴定、生化鉴定、血清学鉴定)程序，这种工艺操作周期长，各项累计费用高，很难对食品的安全卫生形成有效的监督。已有的食品安全(卫生)检测一般是依照国家食品卫生标准，根据食品卫生类型比如酱卤肉类、烤鱼片、糕点面包、肉松、干果等等，标准众多，但其中最主要的是不得检出致病菌，但已有技术却往往很难一项一项检测致病菌。
本发明的目的是提供一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法，它能克服现有技术的上述不足。
一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法，包括食品样品的采样、培养、分离、鉴定，其特征是在一块基因芯片上设计有27种菌种的分子探针，同时进行定性与定性定量分析，根据基因型探针在基因芯片上的信号判断多态性位点的基因型，根据检测数据再比照食品类型以判断食品合格的方法。
本发明的优点是大大缩短了食品卫生(安全)检测的周期，扩大了检测范围，减少了检测费用，缩小了检测误差，增强了食品安全指数，能对食品市场的安全卫生形成有效的监督。
下面通过实施例说明本发明。
对某种食品的样品进行微生物(致病菌、病毒)检验。制作检测食品的基因芯片，基因芯片上的分子探针是与多态性引物的外源序列相互补的核酸分子，包括沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、疯牛病病原；大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌的核酸片段(分子)。其长度由10-50个核苷酸组成，每一种探针分别用已知的方法固定于芯片的表面，配制一个试剂盒，试剂盒包括用于对多态性靶片段进行扩增的引物，扩增一多态性靶片段的引物包括专一的多态性引物和二个专一的基因型引物，试剂盒还包括核酸提纯的试剂、PCR反应的酶、此外试剂盒包括二个或多个分别有不同标记的基因型探针，标记为荧光色素或其它的可用化学或物理方法识别的纳米范围的结构，试剂盒还包括用于分子杂交的缓冲液。在进行基因型测定时采用如下操作程序①从这种食品的样品中提取微生物的DNA，提取的DNA溶于水或适当的缓冲液；②用PCR反应试剂对提取的DNA核酸进行PCR扩增，用一多态性引物和二个专一的基因型引物对一多态性靶片段进行扩增，多组引物可以在同一试管中使用(复合PCR反应)，复合的程度可为二组或二组以上的引物，扩增后的产物具有单链的多态性外源序列和单链的基因型外源序列，反应的体积一般在10-100微升；③多个PCR的反应产物可合并，并进行适当的纯化、浓缩等处理(必要时可除去未反应的引物)，然后与杂交用的缓冲液结合，最终体积在0.1-1毫升范围内。杂交液中包含具有不同标记的基因型探针；④用已知的方法和仪器进行基因芯片杂交和清洗，并用激光扫描仪或其它相应的仪器采集芯片上的信号；⑤根据信号在芯片上的位置、特征和信号的强度的比例，可测定多态性位点的基因型。根据以上检测结果可以得出这种食品是否存在有以上探针设计的(27种)菌(属)种，即进行了菌(属)种的定性检测，对于致病菌沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、疯牛病病原只做定性检测，即这种食品检测中只要存在以上一种致病菌，即宣布这种食品为不合格品。如果这种食品没有检测出以上致病菌，对于大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌再进行定量分析，定量分析用已知技术进行。通过以上方法得出这种食品中微生物的定性定量检验结果(检测数据)。将所有食品卫生检验标准输入到计算机中，建立一个分类别、分层次、分等级的标准库，根据这种食品定性定量检验结果(检测数据)再比照食品标准进行判断得出这种食品检验的结论。
本方法用于食品的检测，包括所有食品卫生检验标准集合的计算机软件，所有食品卫生检验标准包括常用食品的国际标准、国家标准、行业标准、以及相关的企业标准，将这些标准集合成一个分类别、分层次、分等级的食品卫生检验标准软件。食品卫生检验标准软件是用以比照食品检验结果的，做出结论性判断。
本方法用于食品的检验是通用的可适用于所有食品。基因芯片的设计、使用只是对所检验的食品的样品负责，不考虑食品的种类、标准，食品取样后用生物芯片(基因芯片)进行检测，检测结果出来后再比较某类食品的标准进行判断。
根据本方法可以生产试剂盒，试剂盒内有用于对多态性靶片段进行扩增的引物，包括专一的多态性引物和基因型引物，以及核酸提纯的试剂、PCR反应的酶、缓冲液等。
用此方法具体检测的微生物菌种、病毒种类因时间的推移及标准的变化可增添新的致病菌、病原微生物和病毒。
用此方法进行的聚合酶反应是在PCR进行，定量PCR仪能在PCR反应过程中通过光学系统观测反应的进行程度。
此方法可用于RNA靶分子，进行逆转录反应然后进行聚合酶链反应，用反应结果判断基因表达或测定RNA病毒(微生物)的种类和数量。
此方法可用于DNA靶分子进行聚合酶链反应，或由逆转录反应、DNA聚合反应、RNA聚合反应等组成的恒温扩增反应。通过扩增的结果判定靶片段的存在或判断靶片段的基因型，以及判断相关物种的数量。
此方法可对病毒和微生物进行检测，用于食品卫生、商检、环保、医疗等。
权利要求
1.一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法，包括食品样品的采样、培养、分离、鉴定，其特征是在一块基因芯片上设计有27种菌种的分子探针，同时进行定性与定性定量分析，根据基因型探针在基因芯片上的信号判断多态性位点的基因型，根据检测数据再比照食品类型以判断食品合格的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是生物芯片探针有沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、疯牛病病原；大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌的核酸片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是定性与定性定量分析是在一块基因芯片上完成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是根据基因型探针在生物芯片上的信号判断多态性位点的基因型，多态性引物和基因型引物的5’端部分分别具有专一的外源序列，多态性引物和基因型引物的3’端部分分别具有与靶序列相互补的序列，外源序列和互补序列之间有非自然性结构。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是试剂盒有用于对多态性靶片段进行扩增的引物，包括专一的多态性引物和基因型引物，以及核酸提纯的试剂、PCR反应的酶、缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是对于致病菌沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、疯牛病病原只做定性检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是对于大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌进行定性定量分析。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是一种通用的食品检测生物芯片，将所有食品卫生检验标准输入到计算机中，根据检测数据再比较某类食品的标准进行判断。
全文摘要
一种通用型食品安全快速检测的基因芯片及检测方法，其特征是在一块基因芯片上设计有27种菌种的分子探针，同时进行定性与定性定量分析，根据基因型探针在基因芯片上的信号判断多态性位点的基因型，根据检测数据再比照食品类型以判断食品合格的方法。本发明的优点是大大缩短了食品卫生(安全)检测的周期，扩大了检测范围，减少了检测费用，缩小了检测误差，增强了食品安全指数，能对食品市场的安全卫生形成有效的监督。
文档编号C12Q1/04GK1546684SQ20031010575
公开日2004年11月17日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者刘树青, 江晓路 申请人:中国海洋大学