专利名称：一种开放式蛋白消减杂交方法
技术领域：
本发明涉及蛋白表达差异的分析方法，特别是直接在蛋白质水平上分析蛋白表达差异的方法。
背景技术：
研究正常细胞与病理细胞之间蛋白质表达的差异是目前进行疾病的发生发展机理研究的重要手段。现有技术中进行蛋白表达差异分析的方法有两大类。一种是在RNA水平上的差异分析；另一种是在蛋白质水平上的差异分析。
RNA水平的差异分析方法主要有差异显示PCR技术(differentialdisplay PCR，DD-PCR)和消减杂交技术(subtractive hybridization)和抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)。
DD-PCR技术由Liang等[1]于1992年首先建立。该技术的主要流程为首先提取组织标本的mRNA，然后以3’端的12对锚定引物进行逆转录反应；以锚定引物和5’端的20种随机引物进行PCR扩增，并在反应体系中加入同位素标记的d-ATP探针；PCR扩增产物电泳分析后回收差异条带，再以之为模板进行第二轮扩增；对第二轮扩增产物进行杂交鉴定、测序，获得差异显示表达序列标签(expression sequence tag，EST)。DD-PCR技术可快速地对多个样本进行比较，同其他差异显示技术方法相比，非常适合用于对处于疾病不同发展阶段或处于不同发育阶段的生物样本进行比较研究。该技术存在的主要问题是假阳性率高，且对高拷贝数的mRNA倾向性较强[2]；另一方面，用该技术获得的片段多为非翻译区的序列，而这部分序列往往不包括在基因库已知序列里面，由此出发寻找全基因序列往往效果不佳。改进的方法主要包括简化锚定引物、调整PCR反应条件以及设立适当的对照[3，4]。消减杂交技术(subtractive hybridization)和抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)最早用于寻找由于缺失而导致遗传性疾病的相关基因。其后Liang等[5]将其应用于两个不同的cDNA文库，将两者变性后复性再进行杂交；然后，采用亲和素-生物素结合或羟基磷灰石层析技术分离未杂交的部分，由此获得呈差异表达的基因片段。该技术的主要缺陷在于无法对低丰度表达的基因进行克隆，一些改良后的消减杂交技术如代表性差异分析法(representiationaldifference analysis，RDA)、酶降解消减技术(enzymatic degradingsubtraction，EDS)等依然存在上述问题。抑制性消减杂交技术则是一种简便有效、以抑制PCR和消减杂交为基础的分离差异表达基因的新技术。该技术的操作流程包括两轮杂交和两轮PCR扩增，可以有效扩增目的cDNA片段。抑制性杂交技术克服了消减杂交技术无法克隆低丰度表达基因的缺陷，并且降低了假阳性率，相对于其它差异显示技术具有很大的优越性[6]。
至于在蛋白水平上的差异显示的研究，由于蛋白操作的困难，现在多半是用抗体芯片的方法，只能寻找已知蛋白的表达差异变化，无法寻找到新的蛋白，而且目前抗体芯片成本极高，其使用要求精密仪器，普通科研院所买不起，并且抗体芯片所含抗体数量有限，远远不如基因芯片的数量，并不能真正达到高通量筛选的目的另一方面，现有技术中也提供了蛋白水平上开放式的差异显示分析方法，如二维电泳加上质谱分析的大型仪器，但价格高昂，不适宜中小实验室。在蛋白水平上直接进行一种简易开放式的消减杂交已越来越迫切。而本方法恰好解决了这些问题，从而即使是中小型实验室也可以普及蛋白水平上的差异显示方法。
Aptamer，按全国生命科学技术名词审定委员会发布的试用新词，翻译为适体。曾译作“契合寡聚物”。其特性是能与核酸，多肽，蛋白质，小分子专一、高效结合的RNA或DNA片段。适体可按要求设计和合成，目前，全世界对适体的研究方兴未艾，已有超过300篇研究文献报道，和成百上千的适体。适体誉为新一代的基因治疗及药物设计的工具。[7]发明内容本发明通过构建DNA或RNA随机序列库〔aptamer库〕，使之进入细胞体内结合相应特异性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表达数量差异，那么其结合的特异性DNA、RNA序列或aptamer也会表现出相应的数量变化来，从而把在蛋白水平上的消减杂交转移到对DNA序列的消减杂交上来。也就是直接用DNA、RNA(APTAMER)的消减杂交来反映蛋白水平的变化。
本发明的技术方案是1、构建适体DNA或RNA随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞和病理细胞〔活体〕在一致条件下孵化，然后洗去未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列库。
2、抽提上述细胞的蛋白质，用苯酚氯仿分离沉淀蛋白质，取上清〔含DNA或RNA序列〕，用真空干燥机浓缩DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库。
3、对上步中得到的靶细胞和对照细胞的随机DNA或RNA序列库进行消减杂交后；PCR克隆消减序列以得到差异显示文库并测序，选取几个到几十个克隆，用标记引物扩增制备相应类型的DNA或RNAaptamer。筛选确定具有表达差异和功能差异的特异性蛋白。
本发明的另一技术方案是1)预杂交准备好对照细胞和病理细胞〔细胞数量和其他处理条件一致〕，加以固定处理。用化学合成方法构建适体DNA或RNA随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞在一定条件下孵化，然后洗出并收集预杂交后未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列；2)杂交所收集的洗下的DNA或RNA随机序列库与病理细胞孵育，在一定条件下洗去未结合或非特异结合的DNA或RNA随机序列；3)获取差异显示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的细胞，并抽提蛋白质，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥机浓缩DNA或酒精沉淀DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库；4)重复以上三步骤PCR扩增Aptamer库，胶纯化扩增后的特异结合细胞分子的DNA或RNA随机序列，以此DNA或RNA随机序列同上继续筛选5-15轮；5)获取差异显示的蛋白随后克隆并测序，找到几个到十几个DNA或RNA Aptamers后，利用该DNA或RNA aptamer筛选确定具有表达差异和功能差异的特异性蛋白并进行分析。
上述步骤中，进行循环扩增后，如果为单链DNA或RNA，则需再做一个单引物PCR〔94C 15s，55C 15s，72C 15s〕或体外转录。
在第2种方法中，用正常细胞与适体DNA或RNA随机序列库做预杂交后，再用所收集的洗下的DNA或RNA随机序列库与病理细胞孵育杂交，这一步骤可以改为，用病理细胞预杂交，再用所收集的洗下的DNA或RNA随机序列库与正常细胞孵育杂交。
筛选具有表达差异和功能差异的特异性蛋白的方法有1、靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交联DNA或RNA分子和抗原分子，较严格条件裂解细胞从而分离膜蛋白，跑PAGE胶分离纯化已标记DNA-蛋白复合物，切下条带，纯化测序。或并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
2、靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交联复合物的效率低下，可温和裂解，并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，亦可跑胶分离纯化，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
3、也可用aptamer筛选相关细胞的cDNA表达文库从而直接获得差异显示蛋白的基因信息。
综上所述，本方法把在蛋白水平上的表达差异，通过aptamer转移至DNA或RNA水平上的差异显示，从而达到了简捷快速地高通量筛选表达差异蛋白的目的，为蛋白相互关系的系统研究和基因功能的系统探索提供了一条捷径，而且该技术普遍适用于各大中小科研院所及公司。
除了在蛋白质和基因功能研究方面的显著优势外，本方法还可用于aptamer靶药物的高效筛选，有可能为生物制药带来一片全新的空间。
具体的实施方法如下第1种方法1、用化学合成方法构建适体随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞和病理细胞〔活体〕〔细胞数量以及其他条件一致〕孵化，在一定条件下该适体随机序列库将进入细胞并特异性结合其对应分子，然后在一定条件下洗去未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列库。
2、用化学裂解法等裂解细胞并苯酚氯仿抽提蛋白质，取上清〔含适体的DNA或RNA序列〕，用真空干燥机浓缩适体DNA或RNA或酒精沉淀适体DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库。
3、对靶细胞和对照细胞的随机DNA或RNA序列库进行消减杂交〔用试剂盒〕后，注意在消减之前加一已标记内对照序列以检测消减杂交效果；PCR克隆消减序列以得到差异显示文库并测序，选取几个到几十个克隆，用标记引物扩增制备相应类型的DNA或RNA aptamer。
如下筛选具有表达差异和功能差异的特异性蛋白。
4、如靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交联DNA或RNA分子和抗原分子，较严格条件裂解细胞从而分离膜蛋白，跑PAGE胶分离纯化已标记DNA-蛋白复合物，切下条带，纯化测序。或并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
5、如靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交联复合物的效率低下，可温和裂解，并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，亦可跑胶分离纯化，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
6、也可用aptamer筛选相关细胞的cDNA表达文库从而直接获得差异显示蛋白的基因信息。
第2种方法1)预杂交准备好对照细胞和病理细胞〔细胞数量和其他处理条件一致〕，加以固定处理。用化学合成方法构建适体DNA或RNA随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞在一定条件下孵化，然后洗出并收集预杂交后未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列；2)杂交所收集的洗下的DNA或RNA随机序列库与病理细胞孵育，在一定条件下洗去未结合或非特异结合的DNA或RNA随机序列；3)获取差异显示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的细胞，并抽提蛋白质，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥机浓缩DNA或酒精沉淀DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库；4)重复以上三步骤PCR扩增Aptamer库，胶纯化扩增后的特异结合细胞分子的DNA或RNA随机序列，以此DNA或RNA随机序列同上继续筛选5-15轮；5)取差异显示的蛋白随后克隆并测序，找到几个到十几个DNA或RNA Aptamers后，利用该DNA或RNA aptamer筛选确定具有表达差异和功能差异的特异性蛋白并进行分析。
如下筛选具有表达差异和功能差异的特异性蛋白。
6)如靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交联DNA或RNA分子和抗原分子，较严格条件裂解细胞从而分离膜蛋白，跑PAGE胶分离纯化已标记DNA-蛋白复合物，切下条带，纯化测序。或并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
7)如靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交联复合物的效率低下，可温和裂解，并用相应的引物-cellulose进行亲和层析来分离纯化DNA或RNA-蛋白复合物，亦可跑胶分离纯化，送测序获得蛋白序列或质普分析；如用biotin标记的aptamer，可用亲和素层析柱来分离纯化。
8)也可用aptamer筛选相关细胞的cDNA表达文库从而直接获得差异显示蛋白的基因信息。
参考文献1、Liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by meansof the polymerase chain reaction.Science，1992，257(5072)967-971.
2、Bertioli DJ，Schlichter UH，Adams MJ，et al.An analysis of differentialdisplay shows a strong bias towards high copy number mRNAs.Nucleic Acids Res，1995，23(21)4520-4523.
3、Sun Y，Hegamyer G，Kim H，et al.Molecular cloning of mouse tissue inhibitorof metalloproteinases-3 and its promoter.Specific lack of expression inneoplastic JB6 cells may reflect altered gene methylation.J Biol Chem，1995，270(33)19312-19319。
4、Ledakis P，Tanimura H，Fojo T.Limitations of differential display.BiochemBiophys Res Commun，1998，251(2)653-656.
5、Liang P，Zhu W，Zhang X，et al.Differential display using one-base anchoredoligo-dT primers.Nucleic Acids Res，1994，22(25)5763-5764.
6、Diatchenko L，Lau YF，Campbell AP，et al.Suppression subtractivehybridizationa method for generating differentially regulated ortissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(12)6025-6030.
7、Dr.Charles Wilson，Technology，Archemix Corp Pre-Conference Tutorial RNAi Interference，Beyondgenome June 16-17，2003，San Diego.
权利要求
1.一种开放式蛋白消减杂交方法，包括如下步骤1)构建适体DNA或RNA随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞和病理细胞在一致条件下孵化，然后洗去未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列库；2)抽提上述细胞的蛋白质，用苯酚氯仿分离沉淀蛋白质，取含有DNA或RNA的上清液，用真空干燥机浓缩DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库；3)对上步中得到的靶细胞和对照细胞的随机DNA或RNA序列库进行消减杂交后；PCR克隆消减序列以得到差异显示文库并测序，选取几个到几十个克隆，用标记引物扩增制备相应类型的DNA或RNA aptamer。利用该DNA或RNA aptamer筛选确定具有表达差异和功能差异的特异性蛋白。
2.一种开放式蛋白消减杂交方法，包括如下步骤1)预杂交准备好对照细胞和病理细胞〔细胞数量和其他处理条件一致〕，加以固定处理。用化学合成方法构建适体DNA或RNA随机序列库，与经过处理固定了的对照细胞在一定条件下孵化，然后洗出并收集预杂交后未结合或非特异结合细胞蛋白的DNA或RNA随机序列；2)杂交所收集的洗下的DNA或RNA随机序列库与病理细胞孵育，在一定条件下洗去未结合或非特异结合的DNA或RNA随机序列；3)获取差异显示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的细胞，并抽提蛋白质，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥机浓缩DNA或酒精沉淀DNA或RNA从而得到可反应蛋白水平变化的DNA或RNA随机序列库；4)重复以上三步骤PCR扩增Aptamer库，胶纯化扩增后的特异结合细胞分子的DNA或RNA随机序列，以此DNA或RNA随机序列同上继续筛选5-15轮；5)获取差异显示的蛋白随后克隆并测序，找到几个到十几个DNA或RNA Aptamers后，利用该DNA或RNA aptamer筛选确定具有表达差异和功能差异的特异性蛋白并进行分析。
3.根据权利要求2所述的开放式蛋白消减杂交方法，其特征在于进行循环扩增后，如果为单链DNA或RNA，则需再做一个单引物PCR〔94C 15s，55C 15s，72C 15s〕或体外转录。
全文摘要
本发明涉及蛋白表达差异的分析方法，特别是直接在蛋白质水平上分析蛋白表达差异的方法。本发明通过构建DNA或RNA随机序列库(aptamer库)，使之进入细胞体内结合相应特异性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表达数量差异，那么其结合的特异性DNA、RNA序列或aptamer也会表现出相应的数量变化来，从而把在蛋白水平上的消减杂交转移到对DNA序列的消减杂交上来。从而达到了简捷快速的高通量筛选表达差异蛋白的目的。
文档编号C12Q1/68GK1609232SQ20031011045
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月24日 优先权日2003年10月24日
发明者文剑 申请人:文剑, 戴辉