干燥工艺的制作方法

专利名称：干燥工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物样品和其它不稳定样品的保存、如此保存的样品以及保存所述样品的新工艺。所述新工艺包括将包含活性剂和稳定剂的样品加入容器中，使所述样品经受一定的温度和压力条件以使得通过蒸发丧失溶剂，而不需要冷冻样品或使样品起泡以形成泡沫。接下来，在第二干燥阶段，维持或者调整所述压力和温度条件，从而除去溶剂并干燥所述的保存样品以形成高度粘性的液体。本发明进一步提供通过本发明工艺保存的组合物，尤其是经保存的疫苗组合物。
不稳定样品，尤其是生物样品需要延长其稳定性并由此延长其保存期限。传统上采用冻干工艺达到上述目的，在该工艺中，制备所述物质的溶液，并且冷冻所述样品。在初级干燥阶段，在减压条件下，通过升华除去冰中大部分水份，形成多孔的“饼”。通常之后进行第二干燥阶段，此时改变压力和温度，并将水份从所述固体“饼”中蒸发掉。与液体制剂相比，所得到的冻干样品的稳定性提高了。然而，所述冻干工艺非常耗时且昂贵，而成为生产过程中的限速步骤。
冻干还可以导致某些活性剂的活性或抗原性的丧失。对于特定生物材料，例如活病毒，在所述冻干工艺中其活性可能显著丧失(Pikal(1994)ACS Symposium 567120-133)。在环境温度下，许多经冻干的物质仍然是不稳定的(Carpenter等(1994)ACS Symposium567134-147)。
采用稳定剂，例如多羟基化合物可以在某种程度上避免由冷冻工艺造成的损害。在工艺中避免冷冻样品并通过沸腾除去水份(WO96/40077；US6306345)，可以对所述冻干工艺作出进一步的改进。该方法涉及制备在适当溶剂中的玻璃基质形成材料和待保存样品的混合物，从混合物中蒸发掉大部分溶剂以得到浆液，将所述浆液暴露于足以使所述浆液沸腾的压力和温度下，除去剩余的溶剂。类似于上述的方法可以被称为泡沫干燥法。在“沸腾”阶段，通过气泡的形成和破裂，所述方法将待保存的样品暴露于应力下。尤其是在保存不稳定的物质的情况下，其可能导致活性的丧失。
US5,766,520中描述了类似的方法，其中所述工艺涉及部分地除去水份以形成粘性流体，进一步地将所述浆液经真空处理使其“沸腾”，在基本低于100℃的温度下进行进一步的干燥。该方法仍然具有常规冻干工艺的某些问题。当所述工艺在大的冻干机中进行时，样品根据将其在架子上的不同位置而以不同的速率干燥，这导致在所述干燥过程中不同样品损失不同量的活性。其导致在同一批次内缺乏一致性。
由于其具有稳定化的性能，海藻糖是一种受到人们青睐的多羟基化合物。海藻糖是天然存在的、惰性的、非还原性和无毒性的、可以形成玻璃状物质的双糖，最初发现其与防止某些植物和动物中的干燥损伤有关。海藻糖有助于在干燥过程和之后的存储阶段中防止大量物质，包括蛋白质、病毒以及食品的变性，其部分原因是海藻糖具有相对较高的玻璃转化温度(在无水状态下为大约120℃)(US4891319；US5149653；US5026566)。海藻糖还使酶保持稳定(Argall和Smith(1993)Biochem.Mol.Bio.Int.30；491)。还发现，海藻糖以及大量的稳定化多羟基化合物有助于改善冻干样品的保存，尤其是在所述样品在冻干工艺中易于丧失活性的情况下。其它在冻干工艺中有用的糖类包括蔗糖和乳糖。
本发明涉及一种改进的保存活性剂的方法，尤其是如果所述活性剂为不稳定的并且在更常规的干燥工艺中易于丧失活性的情况。所述工艺包括以下步骤，将活性剂溶解/悬浮于稳定剂溶液中来制备保存样品；将所述保存样品放置于一定温度和压力条件下，通过蒸发除去所述保存样品的溶剂，而不需使样品冷冻或者起泡以形成泡沫；除去溶剂，直至所述的保存样品干燥形成高度粘性的液体。
所述工艺极为温和，并且活性剂并不经过冷冻或沸腾，因此比常规的冻干和泡沫干燥方法更有利，在所述的冻干和泡沫干燥方法中，样品需要暴露于所述的一个或两个应力中。当待保存的活性剂不稳定时，采用本发明的方法增加了活性和/或抗原性的保存时间。其可如下进行测量在溶剂中使干燥的活性剂重新复原，所述溶剂优选为水或水溶液，通过标准检测方法(例如通过ELISA)测量其活性或抗原性，并将所述结果与未干燥的样品或通过冻干或泡沫干燥方法干燥然后复原的样品所得到的结果进行比较。
采用本发明的工艺干燥IPV(灭活的脊髓灰质炎病毒，其为可注射的脊髓灰质炎疫苗中的免疫原)是特别有利的。IPV存在于作为液体制剂的已知疫苗中(WO99/48525)。由于标准冻干工艺导致IPV抗原性丧失，因此试图在疫苗中采用固体IPV制剂存在一定的问题。部分由于本发明工艺所需要的时间缩短了，因此本发明的工艺使脊髓灰质炎病毒抗原的保持力大大增加了。
本发明的工艺比常见的冻干工艺更加有利，这是因为其运行周期较短，对冷冻的要求较低，而使其更有能效。由于所述干燥过程通常为工艺中的限速步骤，所以采用本发明的方法在减少费用的同时提高了生产水平。
附图描述

图1为位于倒置瓶(inverted vial)中的高粘度液体的照片。
详细描述本发明的方法用于保存活性剂，其包括以下步骤-将活性剂悬浮或溶解于稳定剂溶液中以制备保存样品；-使所述的保存样品经受一定的温度和压力条件，所述的温度和压力使该保存样品通过蒸发丧失溶剂，而不进行冷冻或起泡以形成泡沫，从而形成粘性液体；以及任选地进一步包括以下步骤-除去溶剂，直至所述粘性液体干燥形成高度粘性液体。
一种保存活性剂的方法生产出能够延长存储时间的活性剂形式，并且，在存储期间保持所述活性剂的活性和/或抗原性和/或免疫原性。优选地，所述活性剂在4℃存储至少3、6、9、12、24个月时能够保持其原始活性的至少40％、50％、60％、70％、优选80％、90％、95％。可以通过以下描述的标准检测方法测定抗原性或免疫原性。
该方法特别适合用于延长不稳定产品的保存期限，所述不稳定产品当存储在溶液中或者发生冷冻或起泡形成泡沫时，很快就丧失活性。
不稳定产品存储于溶液和/或冷冻和/或经受应力，例如泡沫形成过程中有关起泡的应力之后，易于丧失活性和/或丧失抗原性和/或丧失免疫原性。
其特别适用于以下情况，即形成玻璃的多羟基化合物的较低浓度(例如3％-15％w/v)是有利的，以及优选时间较短的干燥过程(少于4、6、8、10或12小时)。
粘性液体的定义为除去溶剂的初始阶段的产物，当所述初始阶段结束时，从样品中除去大部分溶剂。可以识别出该点，因为蒸发的速率变慢，使得由于大量蒸发的吸热效应消失，样品的温度返回至环境温度。
在干燥的初始阶段之后，将干燥初始阶段结束时得到的粘性液体暴露于减压下另一段时间之后，得到高度粘性的液体。高度粘性液体的溶剂含量低于或等于15、12、10、8、5、4、3、2或1％(w/w)，优选通过Karl Fischer库仑湿度分析仪(Eur.J.Pharm.Biopharm.(2000)50；277-284)进行测定。溶剂含量的优选范围为1-3％，3-5％，5-10％或10-15％(w/w)。所述的高度粘性液体具有足够低的溶剂含量，从而所述活性剂在4℃保存至少3、6、9、12或24个月时仍处于稳定状态，容许所述活性剂在该时间内保持至少40％、50％、60％，优选70％、80％、90％、95％的活性和/或抗原性和/或免疫原性。优选地，所述的高度粘性液体具有固体外观，但是为橡胶状或玻璃状，优选为玻璃状，其能够在2、4或6天，优选1、2、3或4周，更优选2、4、6、8、10或12个月内极缓慢地流动。可以将含有所述高度粘性液体的容器倒置并放置于室温下直至观察到所述高度粘性液体的流动，从而测定所述极慢的流动。在优选的实施方案中，在2、4或6天，优选1、2、3或4周，更优选2、4、6、8、10或12个月之后，位于倒置位置的所述高度粘性的液体不表现出流动。优选地，所述高度粘性的液体具有清澈、透明的外观。
保存样品的制备任何稳定剂均适合用于本发明的第一步骤。适当的材料包括但不限于所有的多烃基化合物，包括烃类和非烃类多羟基化合物。优选地，所述稳定化多烃基化合物能够使活性剂基本上不通过变性、聚集或其它方式丧失活性而被储存。特别适合的材料包括糖类、糖醇和烃类衍生物。优选地，所述形成玻璃状物的多烃基化合物为烃类或其衍生物，包括葡萄糖、麦芽酮糖(maltulose)、异麦芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇、palatinit、海藻糖、蜜三糖、水苏糖、松三糖或葡聚糖，更优选为海藻糖、蔗糖、山梨醇、蜜三糖、甘露醇、乳糖、乳糖醇或palatinit，最优选为蔗糖、山梨醇、乳糖或海藻糖。
细菌多糖是特别有利地用作免疫组合物中的稳定剂的，因为其可以同时作为稳定剂和免疫原。
烃类包括但不限于单糖、双糖、三糖、寡糖及其相应的糖醇、例如烃类衍生物和化学改性的烃类的多羟基化合物、羟乙基淀粉和糖类共聚物。天然和合成的烃类均适合采用。合成烃类包括但不限于其中糖苷键被硫醇键(thiol bond)或碳键取代的烃类。可以采用D和L形式的烃类。所述烃类可以是非还原性或还原性的。采用还原性烃类时，优选加入Maillard反应的抑制剂。
适合用于本发明的还原性烃类是本领域已知的烃类，包括但不限于，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖和乳果糖。非还原性烃类包括但不限于，选自糖醇和其它直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。其它有用的烃类包括密三糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、蔗糖、纤维二糖、甘露二糖以及糖醇。所述糖醇糖苷优选为单糖苷，尤其是通过还原二糖，例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖而得到的化合物。
特别优选的烃类为海藻糖、蔗糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、palatinit以及吡喃葡糖基-1→6-甘露醇。
氨基酸可以作为稳定剂并可以自身使用，也优选与多羟基化合物组合使用。优选的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺，尽管任何氨基酸或氨基酸、肽、水解蛋白或例如血清白蛋白的蛋白质的组合均可以作为稳定剂。
本发明工艺中采用的稳定剂的浓度可以为1％至50％重量/体积，优选1-5％、5-10％、15-20％、20-25％或25-50％，最优选低于或等于15％或10％(w/v)。所需要的稳定剂的量与所存在的盐的量成比例。因此，尽管稳定剂含量优选为2％至10％，但是可能需要10％至25％的更高浓度，来干燥具有高盐含量(高于100mM、200mM、300mM、400mM或500mM)的样品。
优选地，所述的保存样品含有能够抑制本发明高度粘性液体形成晶体的组分。盐和包括氨基酸和酚红的其它分子抑制晶体的形成。
容器可以同时处理不同的混合物和各种容器形状及大小。理想地，所使用的容器大小足够容纳初始混合物和所形成的其固体的体积。一般地，其由玻璃状形成材料的质量、容器的表面积和玻璃状形成条件决定。所述玻璃状形成材料的质量必须足够产生实际转化为每单位面积容器表面上的最小质量的。这个比例值不同的混合物和所用容器而变化，但是本领域技术人员根据本文所述的步骤可以根据经验非常容易地确定所述比例。可以使用任意上述小瓶，包括Wheaton模制并截管的小瓶。
本发明的工艺优选采用具有防溶剂，优选防水内表面的容器。通过在容器内表面涂覆疏水组合物，例如通过硅氧烷化而达到上述目的。通过本领域技术人员公知的工艺实现硅氧烷化。在一个方法中，用硅氧烷乳液漂洗容器的内部，然后在高温下通常为350℃，通过烘箱进行处理，从而对容器进行硅氧烷化。备选地，用防水组合物制成容器，以得到防水内表面。
容器的防水内表面使该工艺得到的干燥产品更易于复原，因为容器侧壁上聚集更少的水份。
尽管本文中可采用单数形式，但是可以存在多于一种的玻璃状基质形成材料、多于一种的添加剂、以及多于一种的物质。本领域技术人员很容易确定这些组分的有效量。
溶液稳定剂和活性剂溶于其中的溶剂可以是含水的、有机的或其混合物。可以采用足够量的含水溶剂以溶解所述玻璃状基质形成材料和采用足够量的有机溶剂以溶解疏水物质，从而形成掺有玻璃状物质的疏水物质。
溶剂的选择取决于所选形成玻璃状基质的材料的性质，以及将要掺入的任意添加剂和/或物质的性质。所述溶剂的性质和足够量体积应使玻璃状基质形成材料以及任意的添加剂和/或物质充分地增溶。如果所述物质为亲水材料，则所述液体优选为含水的，以避免由于不利的溶剂相互作用而导致任何可能的活性丧失。优选地，所述含水溶剂包括本领域公知的任何适当的含水溶剂，其包括但不限于水和生物缓冲溶液。优选地，所述含水溶剂的体积百分比为5％至98％，更优选为80-98％，最优选为85-98％。
溶剂的体积可以改变，其取决于玻璃状基质形成材料以及将要混合的物质和任意添加剂。所需要的最小体积为溶解各种组分所需的量。然而，还可以采用均匀分散的所述物质的悬浮液。特定实施方案中各组分的适当量很容易由本领域技术人员根据本文提供的实施例来确定。
可以将不同添加剂加入所述的保存样品中。优选的添加剂为Maillard反应抑制剂。优选地，如果所述物质和/或玻璃状基质形成材料含有羰基和氨基、亚氨基或胍基，则所述组合物进一步含有至少一种生理上可接受的、基本防止组合物中氨基基团和反应性的羰基基团缩合的有效量的Maillard反应抑制剂。Maillard反应抑制剂是本领域公知的。所述抑制剂的量应足以防止或基本防止氨基基团和反应性羰基基团的缩合。一般所述氨基基团存在于所述物质上，羰基基团存在于所述玻璃状基质形成材料上，或相反。然而，所述氨基酸和羰基基团可以在所述物质或烃类的分子内。
已知不同种类的化合物具有抑制Maillard反应的效应，因此可以用于本文所述的组合物中。这些化合物通常为Maillard反应的竞争性或非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂包括但不限于氨基酸残基(D和L)，氨基酸残基和肽的组合物。特别优选地为赖氨酸、精氨酸、组氨酸和色氨酸。赖氨酸和精氨酸为最有效的。存在许多公知的非竞争性抑制剂。包括但不限于，氨基胍及其衍生物以及两性霉素B。EP-A-0433679中还描述了适当的Maillard抑制剂，其包括4-羟基-5，8-二氧代喹啉衍生物。
将着色染料掺入保存样品中是有利的，其目的是使经本发明方法所干燥的产品更加易于观察。这在复原过程中尤其重要，从而确保在使用之前，将高度粘性的液体彻底还原。优选地，所述着色染料在中性pH时保持其颜色，并且适合注射入病人体内。最优选的着色染料为酚红。
通过蒸发丧失溶剂(蒸发干燥-步骤b)
本发明的工艺涉及将保存样品经受一定压力和温度条件，从而使所述保存样品通过蒸发丢失溶剂，而不对样品进行冷冻或起泡以形成泡沫。
由于所述蒸发工艺的吸热性质，所述保存样品内的温度经常不同于所述样品的外界温度。所提及的温度为所述保存样品外界的条件，例如，在采用大的工业冻干机的情况下，是指架子的温度。其通常对应于冻干机的温度设置。
任选地，在本发明的方法中具有对保存样品进行脱气的初始步骤。在将压力进一步降低之前，将压力降低至或低于200mBar，优选200至35mBar，并持续至少5分钟。
本发明的优选实施方案通过降低压力并控制温度条件来实现蒸发干燥。所述压力调整至或低于30、25、20，优选15、12，最优选10、8、7、6、5、4、3、2或1mbar，同时保持将温度设置在0℃以上，优选5℃至37℃、4℃至10℃、10℃至15℃；15℃至20℃；20℃至25℃；25℃至30℃；30℃至37℃或37℃至45℃。将这些条件保持至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小时，优选2-4小时、4-6小时、6-8小时、8-12小时或12-18小时。在一特别优选的实施方案中，所述压力维持在大于2mbar，其中温度设置为15℃，从而防止样品冷冻。在优选实施方案中，所述温度维持在15℃，而且压力设置为5-10mBar，更优选6-9mBar，最优选大约8mBar。当采用更高的温度设置时，可以采用略低的压力而不冷冻样品，当采用较低的温度设置时，所述压力应保持在较高水平以防止冷冻。优选地，维持所述条件一段充足的时间，以使得所述蒸发速率减慢，而使样品的温度近似于样品外界的温度。
优选地，所述保存样品不冷冻或不起泡/沸腾以形成泡沫，其丧失溶剂以形成粘性液体或高度粘性的液体。
除去溶剂以形成高度粘性的液体本发明方法接下来的阶段涉及除去溶剂，直至所述保存的样品干燥以形成高度粘性的液体。在所述第二干燥阶段，所述样品既不冷冻也不起泡以形成泡沫。
将高度粘性液体定义为溶剂含量低于或等于15、12、10，更优选8、5、4、3、2或1％(w/w)的材料，优选通过Karl Fischer库仑湿度分析仪进行测量。所述高度粘性的液体具有足够低的溶剂含量，从而所述活性剂在4℃存储至少3，6，9，12或24个月时保持稳定状态，使所述活性剂在该时间内保持至少40％、50％、60％，优选70％、80％、90％、95％的活性和/或抗原性和/或免疫原性。优选地，所述高度粘性的液体具有固体和/或清澈的外观，但是为玻璃状，其能够在2，4或6天，优选2、3或4周，更优选2、4、6、8、10或12个月内缓慢地流动。可以将含有所述高度粘性液体的容器倒置并放置于室温下直至观察到所述液体的流动，从而测定所述的极慢流动。在优选实施方案中，在2、4或6天，优选2、3或4周，更优选2、4、6、8、10或12个月之后，位于倒置位置的所述高度粘性液体不表现出流动。
在本发明的一个实施方案中，将压力和温度条件保持在第一蒸发干燥阶段所采用的条件可以达到这一点。例如，所述压力维持在或低于30、25、20，优选15、12，最优选10、8、7、6、5、4、3、2或1mbar，同时保持温度设置在高于0℃，优选5℃至37℃、5℃至10℃、10℃至15℃；15℃至20℃；20℃至25℃；25℃至30℃；或30℃至37℃。对于温度设置为15℃，压力维持在5-10mBar，优选6-9mBar，最优选大约8mBar，并保持4-24小时，优选1-4、4-8、8-12或12-16小时。这些温度和压力条件维持1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小时或更长时间，以得到高度粘性的液体，其溶剂含量小于或等于15、12，优选10、8、5、4、3、2或1％(w/w)，其优选通过Karl Fischer库仑湿度分析仪进行测量。
本发明的另一实施方案将溶剂除去过程中的温度设置增加至高于该工艺较早时所维持的温度设置。其使溶剂以更快的速率离开样品，从而可以在更短的时间内完成本发明的方法。例如，所述温度设置增加至高于0℃，更优选高于20℃，优选5℃至37℃、5℃至10℃、10℃至20℃；20℃至30℃；更优选30℃至40℃；更优选40℃至50℃；最优选50℃至60℃，同时压力维持在或低于30、25、20，优选15、12，最优选10、8、7、6、5、4、3、2或1mbar。这些温度和压力条件维持1、2、3、4、5、6、8、10、12或18小时或更长时间，以得到固体，所述固体中的溶剂含量小于或等于15、12、10、8、5、4、3、2或1％(w/w)，其优选通过Karl Fischer库仑湿度分析仪进行测量。该实施方案要求所述活性剂在所述方法采用的温度下为热稳定性的，从而成功实施所述的方法。
本发明的优选实施方案将溶剂去除过程(步骤c)中的压力设置降低至低于该工艺之前所采用的压力设置(步骤b)。其使溶剂以更快的速率离开样品，从而可以在更短的时间内完成本发明的方法。其还可以使更高比例的溶剂丧失。例如，所述压力设置为或低于7、6，优选5、4、3，更优选2、1.5、1，最优选0.8、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01或0.005mBar，同时温度维持在或高于0℃，优选10℃至20℃；20℃至30℃；30℃至35℃或高于40℃。这些温度和压力条件保持1、2、3、4、5、6、8、10、12或18小时或更长时间，以得到固体，所述固体中的溶剂含量小于或等于15、12，优选10、8、5、4、3、2或1％(w/w)，其优选通过Karl Fischer库仑湿度分析仪进行测量(Eur.J.Pharm.Biopharm.(2000)50；277-284)。
优选地，步骤b)和c)(或仅仅b))应在等于或少于18小时，优选16、12、10小时，最优选8、6、5或4小时的时间内完成。
活性剂本发明的方法可用于保存任何活性剂，但是其在保存在其它保存工艺中丧失活性和/或抗原性和/或免疫原性的不稳定活性剂中特别有用。
采用本发明方法保存的活性剂可以包括选自以下的生物系统细胞、亚细胞组合物、细菌、外膜囊泡制剂和病毒、病毒组分或病毒样颗粒。其还可以包括分子，例如蛋白质、肽、氨基酸、多核酸、低聚核苷酸、多糖、寡糖、多糖-蛋白质结合物(conjugate)、寡糖-蛋白质结合物。
可以采用本发明方法进行保存的活性剂的例子包括任何具有生物活性的物质，例如具有药效的物质，包括但不限于抗炎药物、镇痛药、镇静剂、抗焦虑药物、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗精神病药、镇定剂、抗焦虑药物、抗麻醉剂、抗帕金森病药物、胆碱能拮抗剂、化疗药物、免疫抑制剂、抗病毒药物、抗微生物剂、食欲抑制剂、抗胆碱能药物、antimetrics、抗组胺药、抗偏头痛药，冠状动脉、脑或外周的血管舒张剂、激素类药物、避孕药、抗血栓药、利尿剂，抗高血压药物、心血管药物、类鸦片等。
适当的试剂还包括治疗和预防性的药物。包括但不限于任何在治疗上有效的生物修饰剂。所述物质包括但不限于亚细胞组合物、细胞、细菌、外膜囊泡制剂、病毒以及分子，所述分子包括但不限于脂质、有机物、蛋白质和肽(合成的以及天然的)、肽模拟物、激素(肽、类固醇和皮质类固醇)、D和L型氨基酸聚合物、寡糖、多糖、核苷酸、低聚核苷酸和核酸，所述核酸包括DNA和RNA、蛋白核酸杂合物、小分子物质及其生理活性类似物。进一步地，所述修饰剂可以衍生自天然来源或通过重组或合成方式制备，包括类似物、拮抗剂和同系物。
本文中“蛋白质”也指肽和多肽。所述蛋白质包括但不限于酶、生物药剂、生长激素、生长因子、胰岛素、包括单克隆和多克隆的抗体及其片段、干扰素、白介素以及细胞因子。
通过本文所述方法制备的基于核酸的治疗性制剂也包括在本发明内。在本文中，“核酸”包括本领域公知的任何在治疗上有效的核酸，包括但不限于，DNA、RNA、及其生理活性类似物。所述核苷酸可以编码基因或可以是本领域公知的重组DNA的任何媒介物，包括但不限于质粒、逆转录病毒和腺伴随病毒。
本发明进一步包括具有预防活性的物质及其载体的保存。优选组合物包括免疫原，例如疫苗。在复原之后，疫苗可以口服或者可以注射。适当的疫苗包括但不限于活的和减活的病毒、编码抗原的核苷酸媒介物、活的和减活的细菌、蛋白质、多糖、寡糖和/或脂多糖抗原、抗原加佐剂、以及耦合于载体的抗原和/或辅抗原。特别优选针对以下有效的疫苗白喉、破伤风、百日咳、肉毒杆菌、霍乱、登革热、甲型、乙型、丙型和戊型肝炎、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、B族链球菌、A族链球菌、疱疹病毒、幽门螺杆菌、流感、日本脑炎、脑膜炎球菌A、B、C、Y、W，麻疹、腮腺炎、乳头状瘤病毒、肺炎双球菌、脊髓灰质炎病毒、灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV-优选包括1、2、3型，如疫苗领域的标准疫苗一样，最优选为Salk脊髓灰质炎疫苗)、风疹、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、志贺氏菌、结核病、水痘-带状疱疹病毒、黄热病及其组合。疫苗的抗原组分还可以通过分子生物学方法制成，以得到含有源自致病原的蛋白质的一个或多个部分的重组肽或融合蛋白。例如，已经显示，含有抗原和霍乱毒素B亚基的融合蛋白可以诱导针对所述抗原的免疫反应。Sanches等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86481-485。疫苗特别适合掺入单剂量的组合物中。它们在外周环境中是无限期稳定的，可以在免疫接种之前即刻重新溶解于无菌稀释剂中。
在优选实施方案中，所述的免疫原性组合物可以包括荚膜多糖，其衍生自脑膜炎奈瑟菌的一个或多个血清组A、C、W-135和Y。另一优选实施方案中可以包括衍生自肺炎链球菌的荚膜多糖。所述的肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F以及33F(最优选选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一优选实施方案可以含有流感嗜血杆菌b型的PRP荚膜多糖。另一优选实施方案可以含有金黄色葡萄球菌的5型、8型、336或PNAG荚膜多糖。另一优选实施方案中含有表皮葡萄球菌的I型、II型、III型或PLA荚膜多糖。另一优选实施方案含有B族链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一优选实施方案含有A族链球菌的荚膜多糖，优选进一步包括至少一种M蛋白质，更优选含有多种类型的M蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，所述细菌多糖为全长的、经纯化的天然多糖。在本发明的备选实施方案中，所述多糖打小(size)2至20倍重复，优选2-5倍、5-10倍、10-15倍或15-20倍，从而所述多糖较小使其更加易于处理。在优选实施方案中采用寡糖。寡糖通常含有2至20个重复单元。
多糖和寡糖可以如下文所述为未结合的或结合的。
采用本发明的保存方法可以保存两种或多种上述活性剂的组合物。采用本发明的保存方法可以保存部分或全部的疫苗。
采用本发明的工艺保存的优选活性剂包括IPV(灭活的脊髓灰质炎病毒株的混合物)。IPV，尤其是3型组分对常规的冻干和泡沫干燥方法敏感，其表现为，在冻干或泡沫干燥以及随后的复原之后丧失抗原性。
IPV的定义为灭活的脊髓灰质炎病毒(优选包括1、2、3型，如疫苗领域的标准疫苗一样，最优选为Salk脊髓灰质炎疫苗)。IPV的疫苗剂量含有20-80、优选40或80个D-抗原单位的1型(Mahoney)、4-16、优选8或16个D-抗原单位的2型(MEF-1)，以及20-64、优选32或64个D-抗原单位的3型(Saukett)。
当采用本发明的方法干燥时，优选保留1、2和3型脊髓灰质炎病毒的1种、2种或者全部3种抗原性；更优选地，保留1型；2型；3型；1型和2型；1型和3型；2型和3型；或1型、2型和3型的抗原性水平为参照样品抗原性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％，所述参照样品没有经过所述干燥工艺的处理。在将所述高度粘性的液体在水溶液中复原之后，这可以通过任何适当的方法进行测量，所述方法包括采用针对1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒的多克隆和/或单克隆抗体的ELISA。
当采用本发明的方法进行干燥时，优选保留1、2或3型脊髓灰质炎病毒的1种、2种或全部3种的免疫原性；更优选地，保留1型；2型；3型；1型和2型；1型和3型；2型和3型；或1型、2型和3型的免疫原性水平为参照样品免疫原性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％，所述参照样品没有经过所述干燥工艺的处理。在将所述高度粘性的液体在水溶液中复原之后，可以通过任意适当的方法进行测量。在优选方法中，所述高度粘性的液体在水溶液中复原，并免疫接种到动物体内，优选鼠。在一段适当的时间之后，从接种动物中采集抗血清，检测血清转化。优选地，与未经干燥的参照样品相比，可以得到至少0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的相对效价。
优选地，IPV可以与Hib(流感嗜血杆菌b型)PRP多糖或寡糖和/或脑膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖或寡糖和/或肺炎球菌多糖或寡糖中的一种或多种组合。最优选地，所述活性剂包括IPV和Hib；IPV和MenC；IPV，Hib和MenC；Hib和MenC；IPV和MenA及C；Hib和Men A及C；IPV，Hib，MenA和C；Hib，Men C和Y；或IPV，Hib，Men C和Y。
上述逐一列举的活性剂还可以包括一种或多种如下所述的肺炎球菌荚膜多糖。
在上述采用多糖的组合物中，还可以采用寡糖(如下文所定义)。
尽管所述组合物可以加入佐剂(如下文所述)，但是它们优选是未加入佐剂的或优选不包括铝盐。
优选地，所述多糖或寡糖可以与包括T-辅助细胞表位(如下所述)的肽或载体蛋白结合。
附加组分经本发明工艺干燥的优选组合物可以与组合疫苗中的其它抗原组合，所述组合疫苗为经干燥的或者优选为可以用于复原所述干燥组分的液体制剂。与上述活性剂组合的优选抗原包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳(Pw)、无细胞百日咳(Pa)(如下所述)、乙肝病毒表面抗原、甲肝病毒、流感嗜血杆菌b多糖、淋球菌多糖、脑膜炎奈瑟菌血清型B蛋白质、肺炎球菌多糖、肺炎球菌蛋白质或以下所列的任一抗原中的一种或多种。细菌多糖可以与载体蛋白质结合，所述载体蛋白质例如如下所述的破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素以及蛋白质D(US6342224)。
采用本发明工艺保存的活性剂可以与荚膜多糖一起配制，所述多糖衍生自以下的一种或多种脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A族链球菌、B族链球菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在优选实施方案中，所述免疫原性组合物可以包括衍生自脑膜炎奈瑟菌属的血清型A、C、W-135和Y中的一种或多种的荚膜多糖。另一优选实施方案包括衍生自肺炎链球菌的荚膜多糖。所述肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F以及33F(最优选选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一优选实施方案包括流感嗜血杆菌b型的PRP荚膜多糖。另一优选实施方案包括金黄色葡萄球菌的5型、8型、336或PNAG荚膜多糖。另一优选实施方案含有表皮葡萄球菌的I型、II型、III型或PLA荚膜多糖。另一优选实施方案含有B族链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一优选实施方案含有A族链球菌的荚膜多糖，优选进一步包括至少一种M蛋白质，更优选含有多种类型的M蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，所述细菌多糖为全长的、经纯化的天然多糖。在本发明的另一实施方案中，所述多糖打小2至20倍，优选2-5倍、5-10倍、10-15倍或15-20倍，从而所述多糖较小使其更加易于处理。在优选实施方案中采用寡糖。寡糖通常含有2至20个重复单元。
所述荚膜多糖可以是未结合的或者结合至载体蛋白质，例如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白质D(US6342224)。通过基因突变和/或优选通过化学处理对破伤风毒素、白喉毒素以及肺炎球菌溶血素进行去毒。
所述多糖结合物可以通过任意公知的偶联方法制备得到。例如，所述多糖可以通过硫醚键偶联。该结合方法依赖于用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)对多糖进行活化而形成氰酸酯。这样，所述经活化的多糖可以直接或通过间隔基团偶联至载体蛋白质上的氨基。优选地，所述氰酸酯与己二胺偶联，采用异带化学方法(heteroligation chemistry)将所述氨基化衍生的多糖结合于载体蛋白，所述化学方法涉及硫醚键的形成。Uniformed Services大学的PCT公开申请WO93/15760中描述了这种结合物。
所述结合物还可以，通过直接还原氨基化法制备得到，如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)所述。EP0161188、EP208375和EP0477508中描述了其它方法。
另一方法涉及用己二酸酰肼(ADH)衍生的经溴化氰活化的多糖通过碳化二亚胺缩合反应偶联至蛋白质载体上(Chu C等Infect.Immunity，1983，245-256)。
优选的肺炎球菌蛋白抗原为暴露于肺炎球菌外表面的肺炎球菌蛋白质(在所述肺炎球菌的至少部分生命周期内能够被宿主免疫系统识别)，或者是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白质。最优选地，所述蛋白质为毒素、粘合素、2-组分信号转换子、肺炎链球菌的脂蛋白、或其片段。特别优选的蛋白质包括但不限于肺炎球菌溶血素(优选通过化学处理或突变去除毒性)[Mitchell等，Nucleic Acids Res.1990年7月11日；18(13)4010“Comparison of pneumolysin genes and proteinsfrom Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等BiochimBiophy Acta 1989年1月23日；1007(1)67-72“Expression of thepneumolysin gene in Escherichia colirapid purification and biologicalproperties”，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO90/06951(Paton等)，WO99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(US5804193-Briles等)；PspC及其跨膜缺失变体(WO97/09994-Briles等)；PsaA及其跨膜缺失变体(Berry&Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)5255-62“Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putativeadhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.1996643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等，FEMSMicrobiol Lett 1998，164207-14)；M样蛋白质，(EP0837130)以及粘合素18627，(EP0834568)。其它优选肺炎球菌蛋白质抗原公开在WO98/18931中，特别是WO98/18930以及PCT/US99/30390中所选择的抗原。
与本发明的免疫原性组合物一起配制的优选奈瑟菌蛋白质包括TbpA(WO93/0681；EP586266；WO92/03467；US5912336)、TbpB(WO93/06861；EP586266)、Hsf(WO99/31132)、NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也称为D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)，FrpB(WO96/31618，见SEQ ID NO38)、FrpA或FrpC或两者共有至少30、50、100、500、750个氨基酸的保存部分(WO92/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117；Schryvers等Med.Microbiol.1999321117)、FhaB(WO98/02547)、HasR(PCT/EP99/05989)，lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(WO99/57280)以及ctrA(PCT/EP00/00135)。优选加入奈瑟菌蛋白质作为外膜制剂一部分的纯化蛋白质。
疫苗优选与抗原一起配制，从而提供对白喉、破伤风以及百日咳博德特氏菌感染中的一种或多种的防护。所述的博德特氏菌组分可以是灭活的全细胞百日咳博德特氏菌(Pw)或无细胞百日咳(Pa)，其含有来自PT、FHA和69kDa pertacin的至少一种抗原(优选两种或全部三种)。某些其它非细胞疫苗还含有凝集原，例如Fim2和Fim3，这些疫苗也可以用于本发明。一般提供针对白喉和破伤风的防护的抗原为白喉类毒素和破伤风类毒素。所述类毒素为经化学灭活的毒素(例如，用甲醛处理后)或通过引入一个或多个点突变而灭活的毒素。
备选地本发明的高度粘性液体可以作为试剂盒提供，其中一个容器中含有所述高度粘性的玻璃状液体，另一容器中含有液体DTPa或DTPw。所述试剂盒例如可以包括双腔室注射器，经干燥的组分以及液体组分位于同一注射器中但是位于不同腔室中。在用作单个疫苗进行注射之前，立即用所述液体疫苗复原所述经干燥的组分。因此例如，本发明的高度粘性的液体组合物用液体DTPa或DTPw疫苗(优选临时配制)复原并作为单个疫苗进行给药。DTPa或DTPw疫苗一般至少部分地添加氢氧化铝作为佐剂(例如GlaxoSmithKline Biologicals s.a.的Infanrix以及Tritanrix疫苗)。
所述疫苗也可任选地包括一个或多个能够使宿主抵抗非分型的流感嗜血杆菌、RSV的抗原，和/或一个或多个能够使宿主抵抗流感病毒的抗原。
优选的非分型的流感嗜血杆菌蛋白抗原包括Fimbrin蛋白质(US5766608)以及包括由此而来的肽的融合体(例如LB1融合体)(US5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、蛋白质D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap和D15。
优选的流感病毒抗原包括生长于鸡蛋或MDCK细胞或Vero细胞的全病毒、活的或灭活的病毒、分裂的流感病毒、或全流感病毒颗粒(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或其纯化或重组蛋白质，例如HA、NP、NA或M蛋白质，及其组合。
优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
应注意到，本发明的抗原组合物可以包括来自单个细菌种属的一种或多种荚膜多糖。抗原性组合物还可以包括来自一个或多个细菌种属的荚膜多糖。
免疫原性组合物和疫苗本发明的另一方面包括含有本发明的高度粘性液体和药理上可接受的赋形剂的免疫原性组合物或疫苗。
优选地，所述免疫原性组合物或疫苗含有一定量的佐剂，其足以增加针对免疫原的免疫反应。适当的佐剂包括但不限于铝盐、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰基肽、皂角苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、单磷酰脂质A、分枝菌酸衍生物、非离子型嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈及其衍生物和免疫刺激复合物(ISCOM)，如Takahashi等(1990)Nature 344873-875中所述的那些。对于兽医方面的应用以及在动物中产生抗体，可以采用Freund佐剂的促有丝分裂的组分。
与所有免疫性组合物或疫苗一样，免疫原的免疫有效量必须通过经验确定。需要考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其它载体络合或者共价结合，给药途径、需要给予的免疫剂量的数目。上述因素是疫苗领域公知的，免疫学家不需要进行过度的试验就可以确定，这是免疫学家具备的技能。
本发明的高度粘性的液体或疫苗中可以含有不同浓度的活性剂。一般所述物质的最小浓度为达到其预期应用所需的量，而最大浓度为能够留在溶液中或者均匀悬浮于初始混合物中的最大量。例如，治疗剂的最小量优选为提供具有治疗效果的单个剂量。对于生物活性物质来说，最小浓度为复原时具有生物活性所必需的量，最大浓度为不能维持均匀悬浮液时的浓度。在单剂量单位的情况下，所述量为单个治疗应用的量。通常，每个剂量预计包括1-100μg蛋白抗原，优选5-50μg，最优选为5-25μg。细菌多糖的优选剂量为10-20μg、10-5μg、5-2.5μg或2.5-1μg。各种物质的优选量不同，但是本领域技术人员很容易确定。
包括活性剂的高度粘性液体本发明的另一方面为包括活性剂的、优选通过本发明方法可以获得或得到的高度粘性液体。采用本发明方法干燥并复原之后，所述活性剂优选保持其活性和/或抗原性和/或免疫原性。优选保持至少40、50、60、70、80、90或95％的活性剂的活性、抗原性或免疫原性。其可以例如如上文所述通过任意适当的方法确定。
本发明的高度粘性的液体优选包括形成玻璃状的多羟基化合物，其选自葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇、palatinit、海藻糖、密三糖、水苏四糖、松三糖以及葡聚糖。
本发明的高度粘性液体可以含有上文所述的任一活性剂。通过高度粘性液体保存的活性剂可以包括生物系统，例如细胞、亚细胞组合物、细菌、外膜囊泡制品以及病毒。其可以可选含有或者进一步包括分子，例如蛋白质、肽、氨基酸、多核酸、低聚核苷酸、多糖、寡糖、多糖-蛋白质结合物、寡糖-蛋白质结合物。其还可以包括含有两种或多种上述活性剂的组合物。
优选实施方案包括优选通过本发明方法制备或者可以由本发明方法制成的高度粘性的液体，其中所述活性剂是或者包括疫苗或疫苗组分。疫苗的优选组分如上所述且包括IPV，更优选IPV和细菌多糖、优选来自流感嗜血杆菌b和脑膜炎奈瑟菌属A、C、W和Y的多糖或寡糖。
优选疫苗组分包括IPV(脊髓灰质炎病毒株的灭活混合物)。优选地，IPV与以下的一种或多种组合Hib PRP多糖和/或脑膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖和/或肺炎球菌多糖(如上所述)，更优选为IPV和Hib；IPV和MenC；IPV，Hib和MenC；Hib和MenC；IPV和MenA以及C；Hib、MenA和C；IPV，Hib，MenA和C；Hib，MenC和Y；或IPV，Hib，MenC和Y。
在上述采用多糖的组合物中，还可以采用寡糖(如上所述)。
尽管这些组合物可以添加佐剂(如上所述)，但是它们优选不添加佐剂或者优选不包括铝盐。
优选地，所述多糖或寡糖与包括T辅助细胞表位的肽或载体蛋白质结合(如上所述)。
本发明的高度粘性液体优选与组合疫苗中的任选干燥的其它抗原组合或优选与液体制剂组合，所述液体制剂可以用于复原所述干燥的各组分。与本发明容器的内容物组合的优选抗原包括以下的一种或多种白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳(Pw)、无细胞百日咳(Pa)(如上所述)、乙肝病毒表面抗原、肺炎球菌多糖、肺炎球菌蛋白、奈瑟菌多糖、奈瑟菌蛋白质。细菌多糖可以与载体蛋白质结合，例如如上所述的破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白质D(US6342224)。
本发明的另一方面为制备疫苗的方法，其包括在水溶液中复原所述高度粘性液体的步骤。在优选实施方案中，所述水溶液包括白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳(非细胞或全细胞)抗原，以及任选地进一步包括乙肝病毒表面抗原。DTP疫苗任选地至少部分添加铝盐佐剂，优选氢氧化铝或磷酸铝。
本发明的另一实施方案为试剂盒，其中本发明的高度粘性液体放置于第一容器中，包括液体DTP(非细胞或全细胞)的疫苗放置于第二容器中。可以采用如上所述的双腔室注射器。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请均在此引入作为参考。
实施例采用标准方法实施以下实施例，除了特别详细描述之外，所述标准方法均是本领域技术人员所公知的并且是常规的。这些实施例为示例性的，并不限制本发明。
实施例1 冷冻条件的建立将蔗糖溶于水中得到1％、5％、10％和20％的溶液以制备样品。将样品放入Heto Drywinner 8-85冻干机，其中架子温度控制在1℃以内，冷凝器的最终温度为-85℃，通过排出阀调节压力，有6个热电偶用于测定产品温度。在整个过程中，所述架子温度设置维持在15℃。所述压力初始降低至200mBar，维持在该水平10分钟，然后将压力进一步降低至50mBar，5mBar，2.5mBar，0.75mBar，0.4mBar和0.2mBar。使每个压力水平维持20分钟，从而使温度达到平衡，用热电偶对样品的温度进行读数。将热电偶连接至具有不同蔗糖浓度的样品，表1中记录的温度为温度的平均值。
结果不论所存在的蔗糖的浓度，所有样品在1.66至1.11mBar之间冷冻。在不同压力情况下测定的温度非常接近于由所述三点曲线预测的温度。因此，蔗糖的存在对位于不同压力下的样品的温度不产生显著影响。
为了避免样品被冷冻，架子温度为15℃时，压力应维持在2mBar以上。在更低的温度下，所述压力应维持在更高的水平，而采用更高的温度可以使压力进一步降低，而样品不会冷冻。
表1
实施例2 不冷冻或不形成泡沫而进行干燥的方法制备含有5％、10％、15％和25％蔗糖的保存样品，并加入小瓶中。将样品放置于整个过程中温度设置在15℃的冻干机中。将所述压力初始降低至200mBar，维持在该水平10分钟以脱气，然后进一步降低压力。进一步将压力降低至8mbar并维持2-3小时，在此期间样品内的热电偶显示，由于蒸发冷却，所述样品的温度降低至4℃。2-3小时之后，所述样品的温度返回至15℃，其表明，在这些温度和压力条件下进行的蒸发将要结束。在所述工艺的该阶段，样品并不沸腾以形成泡沫或冷冻，从而使样品内的活性剂暴露于尽可能少的应力。所述样品具有粘性液体的外观。
将压力进一步降低至0.1mBar，同时将所述架子温度设置维持在15℃，从而使样品进一步干燥。再维持这些条件10-16小时。在该阶段，将样品温度保持在15℃，因为蒸发速率减慢。进一步进行干燥，所得到的样品具有固体外观。如果将样品沿一侧放置，在数天内，所述样品内容物流动非常缓慢，其显示，所述样品为具有高度粘性的液体玻璃。附图1显示了所述高度粘性液体的外观。
实施例3 在不冷冻或不形成泡沫而干燥之后，IPV保持免疫原性所述样品没有经受与伴随泡沫形成的起泡或冷冻有关的应力。进行实验，以确定当用于干燥IPV时该方法是否产生高水平的抗原保留性。
进行三个独立实验，其中将IPV重新悬浮于水溶液中，所述水溶液中含有作为稳定剂的10％蔗糖或10％海藻糖。将样品放入经硅氧烷化的小瓶中，将小瓶放置于Heto Drywinner8-85冻干机中，温度设置为15℃。将压力初始降低至35mBar以去除样品中的气体。10分钟之后，将压力进一步降低至8mBar，并维持该水平2小时。在该阶段，保持温度设置在15℃，并监测样品内的温度。当水从样品中蒸发出来时，温度降低至4℃，但是在所述两小时结束时，所述温度返回至15℃，这是因为蒸发的速率减慢了。在这些条件下没有起泡或形成泡沫。然后进一步将所述压力降低至0.1mBar，在前两个实验中继续维持这些条件16小时，在第三个实验中继续维持这些条件10小时。
在水中复原所述样品，采用ELISA评价三个脊髓灰质炎病毒株的抗原性保留情况。抗3型IPV的单克隆抗体用于ELISA中，以评价所述复原的、冻干样品的抗原保留情况，与没有冷冻的对照样品的抗原保留情况进行比较。所显示的结果为没有经受干燥过程的样品的读数的百分数。
结果所述干燥的样品具有固体外观，但是它们表现为高度粘性的液体/玻璃形式，这是因为，在数天内如果将所述容器倒置，所述经干燥的样品能够流动。
表2 采用单克隆抗体通过ELISA确定3型IPV抗原的保留情况(不形成泡沫或冷冻而进行干燥)
与以下所显示的冻干结果相比，3型IPV抗原保留水平是非常有利的，在以下结果中，显示了当采用抗3型单克隆抗体时，在相同ELISA表中通常发现非常低的值。
表3 采用单克隆和多克隆抗体通过ELISA确定1型、2型和3型IPV抗原的保留情况(冻干)
*重复进行5次含有3.15％蔗糖的冻干实验，所显示的结果来自一个代表性的实验。
实施例4 作为高度粘性液体/玻璃存储的干燥IPV的长期存储稳定性采用实施例3所述方法进行干燥的IPV在4℃下存储9个月。将样品在具有150mM NaCl的水中复原，采用ELISA评估三个脊髓灰质炎病毒株的抗原性保留情况。在各个ELISA中采用三个单克隆抗体以评价经复原的存储样品中的抗原保留程度，所述三个单克隆抗体分别针对不同的病毒株。在存储之前，对来自同一批次的复原样品进行类似的ELISA检测。所有结果均与没有干燥的对照样品比较。所显示的结果为没有经受干燥过程的样品读数的百分数。
结果表4 作为高度粘性的液体IPV抗原存储9个月之后的保留情况
因此，经实施例3所述方法干燥并在4℃下存储至少9个月的IPV没有丧失抗原性。
实施例5 与未干燥的IPV比较经干燥形成高度粘性液体并复原之后的IPV的体内免疫原性将10个一组的Wistar大鼠用不同稀释倍数的IPV免疫接种，所述IPV经实施例2所述的方法在10％蔗糖的存在下进行干燥以形成高度粘性的液体，并复原。将另外10个一组的Wistar大鼠用IPV对照样品免疫接种，用同样的方法制备所述IPV，但是不进行干燥。
21天后，从所有大鼠采集血清，并采用1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒在不同的免疫沉淀测定中对所述血清进行检测。
表5所示的结果包括a)对每个IPV稀释倍数有反应的大鼠数量，b)ED50，其为确保50％大鼠发生血清转化所需的剂量，其通过免疫沉淀测定方法进行评估，以及c)与未经干燥的参照IPV相比，所述干燥和经复原的IPV的相对效价。
表5 与未经干燥的参照IPV(JLE097)相比，在干燥形成高度粘性的液体(JLE017/05)和复原之后的IPV的免疫原性
JLEO17/05为经干燥形成高度粘性的液体并接下来进行复原的IPV批次。JLE097为未经干燥的参照物。
表5显示了，用每个稀释倍数的IPV进行免疫接种的产生应答的大鼠数量在经干燥而且复原的IPV以及未干燥的参照样品之间是类似的。大体上，1型IPV引发最强的免疫应答，2型在略少的大鼠中引发免疫反应，3型引发最弱的免疫应答。
干燥以形成高度粘性液体的工艺不损害IPV引发体内免疫沉淀抗体的能力。相对效价(RP)读数为1.0时，其表示所述样品引发了与参照样品等同的应答。对所有三类脊髓灰质炎病毒两个干燥样品均产生近似1.0的RP读数，其表明所述干燥工艺对样品引发免疫应答的能力并不产生影响。
实施例6 采用蔗糖或海藻糖作为稳定剂进行干燥以形成高度粘性的液体对IPV引发体内免疫沉淀的免疫应答能力的影响对10个一组的Wistar大鼠用在10％蔗糖或10％海藻糖存在的情况下进行干燥、然后进行复原的IPV进行免疫接种，如实施例2所述。对另外10个一组的Wistar大鼠用未经干燥、作为参照样品的等量IPV进行免疫接种。
21天后，从所有大鼠采集血清，并采用如实施例5所述的免疫中和测定方法评价分别针对1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒产生的免疫中和抗体的量。
与所述未经干燥的参照样品所引发的免疫应答进行比较，计算每个样品的相对效价。
结果如表6所示。
表6 在蔗糖和海藻糖中进行干燥的比较
当采用蔗糖作为稳定剂时，样品中剩余的水份为大约5％，其低于采用海藻糖作为稳定剂时样品中剩余的大约10％的水份，所述水份通过Karl Fischer库仑湿度分析仪测量。
在干燥过程中，蔗糖和海藻糖在稳定IPV方面均是有效的，从而对于大多数不同类型的脊髓灰质炎病毒来说，所述经复原的IPV得到近似为1.0的相对效价读数。所述相对效价对于相对较为容易丧失免疫原性的3型脊髓灰质炎病毒尤其有利。
实施例7 通过Karl Fischer测量湿度采用Karl Fischer滴定测量仪(Aqua30.00-Elektrochemie Halle)进行分析。称重所述样品，并放入温度设置为80℃的烤箱内。用氮气吹扫样品，然后加入hydranal试剂(Riedel de Hahn)从而通过库仑法进行分析。
权利要求
1.一种保存活性剂的方法，包括以下步骤a)将活性剂溶解/悬浮于稳定剂溶液中，制备保存样品；b)将所述保存样品置于一定温度和压力条件下，从而使该保存样品通过蒸发损失溶剂以形成粘性液体，而不进行冷冻或涉及泡沫形成的起泡。
2.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤c)进一步将所述保存样品置于一定温度和压力条件下，从而使所述粘性液体干燥以形成高度粘性液体。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤b)中，将所述压力降低至20mbar或更低。
4.权利要求1-3的方法，其中在步骤b)中，所述保存样品的外界温度为5℃至37℃。
5.权利要求2-4的方法，其中在步骤c)中，所述保存样品的外界温度为5℃至37℃。
6.权利要求2-5的方法，其中步骤c)中所述保存样品的外界温度高于在步骤b)中的。
7.权利要求6的方法，其中在步骤c)中，所述保存样品的外界温度增加至20℃以上。
8.权利要求2-7的方法，其中相对于步骤b)中的压力，步骤c)中的压力降低了。
9.权利要求8的方法，其中在步骤c)中，所述压力降低至1mbar或更低。
10.权利要求1-9的方法，其中步骤b)在小于4小时的时间内完成。
11.权利要求2-10的方法，其中步骤b)和c)在小于12小时的时间内完成。
12.权利要求1-11的方法，其中所述稳定剂包括形成玻璃状物的多羟基化合物，其选自葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇、palatinit、海藻糖、蜜三糖、水苏糖、松三糖以及葡聚糖。
13.权利要求12的方法，其中所述稳定剂为蔗糖。
14.权利要求12-13的方法，其中所述稳定剂的浓度低于15％。
15.权利要求1-14的方法，其中所述保存样品中含有酚红。
16.权利要求1-15的方法，其中在具有防溶剂内表面的容器内干燥所述的保存样品。
17.权利要求1-16的方法，其中所述活性剂包括选自以下的分子蛋白质、肽、氨基酸、多核苷酸、低聚核苷酸、多糖、寡糖、多糖-蛋白质结合物以及寡糖-蛋白质结合物。
18.权利要求1-16的方法，其中所述活性剂包括选自以下的生物系统细胞、亚细胞成分、细菌、病毒、病毒组分以及病毒样颗粒。
19.权利要求18的方法，其中所述活性剂包括IPV(灭活的脊髓灰质炎病毒)。
20.权利要求18-19的方法，其中所述活性剂包括Hib(b型流感嗜血杆菌)多糖或寡糖。
21.权利要求18-20的方法，其中所述活性剂包括脑膜炎奈瑟菌C的多糖或寡糖。
22.权利要求1-21的方法，其中所述活性剂包括疫苗。
23.一种包括活性剂的高度粘性液体，其中保存了所述活性剂的抗原性或活性。
24.权利要求23的高度粘性液体，可以通过权利要求1-22的方法得到。
25.权利要求23或24的高度粘性液体，包括选自以下的形成玻璃状物的多羟基化合物葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇、palatinit、海藻糖、蜜三糖、水苏糖、松三糖以及葡聚糖。
26.权利要求25的高度粘性液体，其中所述形成玻璃状物的多羟基化合物为蔗糖。
27.权利要求23-26的高度粘性液体，其中所述活性剂包括选自以下的分子蛋白质、肽、氨基酸、多核苷酸、低聚核苷酸、多糖、寡糖、多糖-蛋白质结合物以及寡糖-蛋白质结合物。
28.权利要求23-27的高度粘性液体，其中所述活性剂包括选自以下的生物系统细胞、亚细胞成分、细菌、病毒、病毒组分以及病毒样颗粒。
29.权利要求23-28的高度粘性液体，其中所述活性剂包括疫苗。
30.权利要求23-29的高度粘性液体，其中所述活性剂包括IPV。
31.权利要求23-30的高度粘性液体，其中所述活性剂包括细菌多糖或寡糖。
32.权利要求31的高度粘性液体，其中所述活性剂包括Hib(b型流感嗜血杆菌)多糖或寡糖，优选其与载体蛋白质结合。
33.权利要求23-32的高度粘性液体，其中所述活性剂包括脑膜炎奈瑟菌血清群C的多糖或寡糖，优选其与载体蛋白质结合。
34.权利要求23-33的高度粘性液体，其置于具有防溶剂内表面的容器中。
35.一种免疫组合物或疫苗，其包括如权利要求23-24所述的高度粘性液体和药物学上可接受的赋形剂。
36.一种制备疫苗的方法，其包括在水溶液中复原如权利要求23-35所述的高度粘性液体的步骤。
37.权利要求36的方法，其中所述水溶液包括白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原(无细胞或全细胞的)。
38.权利要求37的方法，其中DTP疫苗至少部分地添加佐剂氢氧化铝。
39.一种试剂盒，其包括容纳于第一容器中的如权利要求23-34所述的高度粘性液体，和位于第二容器中的液体疫苗组分。
全文摘要
本发明涉及干燥生物样品和其它不稳定样品的方法，从而使所述样品可以作为高度粘性液体保存。该方法涉及以下步骤将活性剂溶解/悬浮于稳定剂溶液中以制备保存样品，将所述保存样品置于一定温度和压力条件下，从而使该保存样品通过蒸发损失溶剂，而不进行冷冻或起泡以形成泡沫，除去溶剂直至所述保存样品干燥形成高度粘性液体。
文档编号C12N1/04GK1732257SQ200380107869
公开日2006年2月8日 申请日期2003年10月30日 优先权日2002年11月1日
发明者Y·马耶尔斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司