结晶人血清白蛋白的方法

专利名称：结晶人血清白蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及用于提供一种结晶人白蛋白的高度可靠的方法和商业上可行的方法的方法。更具体地说，本发明提供一种生产晶体人白蛋白的方法，所述人白蛋白纯化自各种白蛋白来源，具体包括自转基因动物或其它重组来源。
背景技术：
本发明涉及一种改进的结晶人血清白蛋白(“hSA”)的方法(在本申请中，hSA将被与术语人血清白蛋白互换地使用)。优选进行这种方法以加强重组hSA的纯化程序，该重组hSA然后可被用于治疗应用或作为药物制剂中的赋形剂。就药物制剂来说，如本发明所纯化的人白蛋白可被用作治疗剂或用作赋形剂。在每一种情况下，适合的制剂可以在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(16th和18th版，MackPublishing，Easton，Pa.(1980和1990))，以及在INTRODUCTION TOPHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS(4th版，Lea & Febiger，Philadelphia(1985))中找到，在此全部引入以供参考。
关于hSA的治疗应用，白蛋白施用的目的主要是通过维持血浆胶体渗透压(colloid oncotic pressure)来维持循环血浆容量，以及通过使腔内和间质的流体进入血管来治疗其他抗性严重的水肿。
通过在急性低蛋白血症引起的病理状况中，以及在对其他治疗方法耐受的慢性低蛋白血症引起的病理状况中补充白蛋白，白蛋白产品被用来获得暂时的状况改善。
白蛋白是第一个临床上用作血容量扩充剂的自然胶体成分，并且与其他胶体产品相比它是标准的胶体物质。一些特定的医学适应症(在该适应症中白蛋白可被用来增加患者中血管内胶体渗透压(oncoticpressure)并由此扩充血管内容量)包括低血容量性休克；严重烧伤；成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；腹水；肝衰竭；胰腺炎和正在经历心肺分流术的患者。(Cochrane等，1998)。白蛋白也可被用来治疗新生儿高胆红素血症、低蛋白血症和肾病综合征。(Vermeulen等，1995)。
人血液中的白蛋白部分起三种主要的生理作用(1)维持血浆胶体渗透压，(2)运输和螯合胆红素，以及(3)运输脂肪酸和其他中间代谢产物例如激素和酶。(Peters，T等)。因为白蛋白引起大约80％的血浆膨胀压，所以血清白蛋白浓度50％的减少会随之产生胶体渗透压66％的下降。(Rainey T.G.，等，1994)。在重症病患者中，死亡的危险与血清白蛋白浓度呈反相关。(Cochrane等，1998)。Goldwaster和Feldman估计对于血清白蛋白浓度的每2.5g/dL减少，有24％-56％死亡危险的增加。(Goldwaster等，1997)。这种估计是在关于其他共变量(例如，肾功能，血清氨基转移酶，乳酸酸中毒)调整后做出的，它强有力地表明白蛋白输注可能具有直接的细胞保护作用。(Cochrane等，1998)。
如上所述，清楚的是，根据可以得到的描述它的科学文献的数量和通过它享有的工业应用的数目来判断，hSA也许是所有血浆蛋白质中最为人们所知的。然而，这种大量的知识主要集中于它的生理学和白蛋白的临床应用，而不是血浆分级分离以外的从任何来源纯化它或获得所述分子所用的方法学。最熟知的并且仍然被广泛使用的纯化方法是60年前由Cohn和他的同事们开发(Cohn E.J.等，1947)。Cohn血浆分级分离方法主要被用来生产纯化的血浆产品，用于多种临床应用。Cohn还开发了一种被广泛使用的用于人血清白蛋白的结晶方法，该方法利用与从血浆分级分离方法熟知的那些类似的原理。然而，该方法具有明显的效率低并且经常不能提供足够的高度纯化的hSA的供应。
pH的影响
pH的影响是蛋白质结晶中的主要因素之一。通常蛋白质晶体在特定的pH有一个界定很好的溶解度最小的点。在蛋白质结晶的通常文献中，最常见的情况是这个最小溶解度是在靶蛋白质的等电点。然而，hSA在其等电点是高度可溶的，跨越大范围的离子强度。因此，白蛋白的结晶特性比许多其他蛋白质的特性更复杂的多，使可靠的结晶和/或纯化成问题。
白蛋白具有变化的等电点，取决于它接受的化学处理。带有全部足量的6个结合脂肪酸，hSA的pI通常是4.6，然而，当被全部脱脂时，它的pI可高达5.6。因此，hSA的结晶特性在它的“天然的”状态和脱脂状态之间变化，并且文献中报道的hSA本身结晶的最适pH实质上在低值4.6至高值8.0之间变化，并且高度依赖于以每批为基础的hSA的分子状态。因此，存在于文献中的被认为是hSA结晶的最适pH范围是混乱的并且明显依赖于不同的沉淀试剂，使用的每种沉淀剂具有可变化的浓度，也许只最适合于hSA分子可能状态中的一种。
例如，用低离子强度的hSA时，像在Cohn醇方法中期望的那样，结晶最适在pH4.9-5.3进行，该pH接近于天然白蛋白的等电点。在具有更高离子强度的状况中和当被强缓冲时，通过PEG溶液结晶的最适pH是7.4。总之，报道的关于hSA最适结晶的pH影响以这样一种表面上看来不合常规的方式依赖于试剂组成，所述方式通过参考现有技术和现有技术方法学不能得出可靠的结论。事实上，鉴于现有技术的教导的状态，每一种新试剂和技术必须根据特定pH或其他单变量进行大量的优化，以在得出结晶条件时被保持一致。
沉淀试剂的影响应该注意到，hSA在变化的盐浓度中具有很高的溶解度。它在低离子强度下加入乙醇(Cohn方法；Cohn E.J.等，1947)或其他溶剂，它可被沉淀或结晶。或者，用很高盐浓度的盐析出是可能的，并且描述了早期文献大多数使用的硫酸铵或乙醇。在更近的文献中，不同分子量的PEG溶液已被广泛地应用。然而，因为残余的污染物，列于文献中的试剂对于所得到的hSA临床应用来说是不可接受的。在现有技术的沉淀试剂中，只有乙醇和硫酸铵在hSA的生产中是有用的。然而，它们都有明显的实际问题。用乙醇结晶需要加入有毒的有机变性剂例如苯或重金属。硫酸铵对于最终白蛋白制剂来说不是合适的盐，因此需要被去除。
特定试剂的影响除了它的其他特征以外，白蛋白具有与许多较小的分子和离子结合和附着的超常能力。不同的长链醇和脂肪酸与hSA的结合强烈影响分子hSA的结晶特征，并且再次起使临床级人血清白蛋白的生产高度可变和不可预测的作用。能够显著影响hSA结晶特征的试剂的例子包括癸醇，棕榈酸和辛酸。
温度的影响还应该注意到，现有技术试图在乙醇溶液中结晶hSA，该溶液典型地是在0-10℃范围内的低温度下制备的。高盐和PEG操作经常在4-20℃的宽温度范围内进行。在这些现有技术努力中，不清楚温度对白蛋白沉淀的真正影响。在乙醇中晶体溶解度在低温下看起来较低。存在于现有技术中的PEG和盐方法中没有清楚描述温度的影响。对于生产效率和商业可行的方法来说，温度是主要的因素之一。总之，温度的意义没有被现有技术解释或公开。
动力学和放入晶种(seeding)根据现有技术，在将要完成的给定反应中结晶白蛋白所需的时间占几天时间。然而，现有技术方法中那些应用乙醇的方法也许是最快的，只需要12到24小时开始结晶。还根据现有技术方法，没有添加剂，包括用从先前反应中形成的晶体接种反应混合物，白蛋白的实际结晶也许是根本不可能的。另外，依赖PEG的结晶方法，可能利用或可能不利用这种类型的添加剂。应注意到，加入晶种确实显著加快晶体生长，尽管鉴于本技术领域中的混乱，通常没有可被利用的参考文献，给出了一致地可靠结果或产生高收率的晶体。
表1.
在文献中找到的结晶试剂和条件的实例一览表。
使用无机盐的现有技术方法学现有技术(Haupt和Heide(1967))提供了用不同无机盐结晶人血清白蛋白的方法，所述无机盐包括50％饱和的(NH4)2SO4；15-20％Na2SO4；2.2M K-磷酸盐pH 6.8和3M Na-磷酸盐pH5.0。在这些现有技术结晶方法中发现癸醇是必需的结晶辅助剂。发现在它们的分子主链上多于5个碳原子的其它脂肪醇也是适用的。然而，非常有限地描述了结晶条件和步骤。没有呈现物料平衡。在可从本引文中获得的数据的基础上，以充分可控或可靠的方式进行白蛋白的结晶是不可能的。
现有技术文献的综述显示，尽管有多种建议的结晶方法，但相关的引文没有教导在工业或商业规模上有效的方法，教导了不适用于生产治疗产品或赋形剂的方法，或教导了仅适用于生产仅在X-射线衍射研究中有用的单晶的方法。因此现有技术的局限阻止了结晶条件的广博知识的发展，所述结晶条件是在设计治疗剂、药物赋形剂或医疗辅助剂作用中hSA的大规模结晶方法中必需的。此外，现有技术没有提供这样的教导，该教导提供了来自人血浆以外来源的用途。因此，存在了解可靠并且在商业规模上由各种各样的来源生产白蛋白晶体的物理和化学条件的需要。
发明概述本发明提供了改进的生产晶体人白蛋白的方法。该方法适合于各种白蛋白来源包括人血浆，以及来自重组白蛋白来源例如培养的哺乳动物细胞、转基因哺乳动物的乳或其它体液、转基因植物、转基因鸟类、重组细菌细胞培养物、重组酵母细胞培养物或重组昆虫细胞培养物。也就是，它适用于生产结晶的和药物级hSA，不论它来自的原料流(feedstream)。所述方法具有高纯化力，以致于能将晶体白蛋白与存在于特定原料或原料流中的其它蛋白质、细菌、脂肪酸或其它分子种类有效地分离。在本发明的另外实施方案中，通过在结晶介质中的加热和冷却循环，可以将白蛋白溶解并再结晶。按照本发明使用者的需要，可以重复这种，重结晶步骤无限数次。在重结晶步骤中常规地改进白蛋白的纯度。
本发明的方法还提供试剂和条件的精确组合，允许晶体人白蛋白生产的最佳化。在这些方法中重要的方法参数例如pH和温度被精确操作。本发明的另外实施方案提供了磷酸钠或磷酸钾和/或辛酸或辛酸盐的沉淀试剂的最佳浓度。
本发明的方法是基于某些影响人白蛋白结晶的关键因素。优选地，本发明的方法以特定的方式优化了如下变量以便优化结晶方案参数如下1.以计划步骤改变磷酸盐浓度；2.以计划步骤变化反应混合物的温度，其中连续地应用加热和冷却过程；3.以计划的步骤方式控制反应混合物的pH或变化其pH；4.其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从特定原料流中纯化和结晶。
参照附图，在下面本发明优选实施方案的详细描述中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图简要说明

图1显示了结晶重组人血清白蛋白的方法流程图。
图2显示了在pH6.2，不同的温度下的白蛋白溶解度，和指数趋势线。
图3显示了在pH6.2，不同的温度下的白蛋白溶解度，和线性趋势线。
图4显示了在15℃下白蛋白晶体的pH溶解度。
图5提供了洗涤的白蛋白晶体在不同的磷酸盐溶液pH6.2中的溶解度研究。
图6提供了洗涤的白蛋白晶体在具有变化的辛酸盐浓度的2.63M磷酸盐溶液中的溶解度研究。
图7显示了hSA晶体浆液在2.7M磷酸盐pH6.2中的热沉淀研究。
图8显示了白蛋白的制备性结晶的方法流程图。
图9显示了重组人血清白蛋白结晶的方法流程图。
图10显示了重结晶重组人血清白蛋白的方法流程图。
图11显示了在溶液混合物中的结晶的人白蛋白，该溶液混合物是2.3摩尔Na-K-磷酸盐pH6.2；辛酸盐1.4mg/ml；hSA 80mg/ml，在4℃结晶过夜，有两小时在室温(RT)下在空气密封室中。
图12显示了结晶的人白蛋白。显示了在溶液混合物中的结晶的人白蛋白，该溶液混合物是2.5摩尔Na-K-磷酸盐pH6.2；用辛酸盐饱和；hSA 46.5mg/ml，在4℃结晶过夜。
图13显示了在溶液混合物中的结晶的人白蛋白，该溶液混合物是2.3摩尔Na-K-磷酸盐pH6.2；辛酸盐1.4mg/ml；hSA 80mg/ml，在4℃结晶过夜，有0小时在室温(RT)下在空气密封室中。
图14显示了，本发明的白蛋白晶体以及更多的非晶形沉淀。典型的晶体大小大约是0.1×0.4mm。沉淀随时间消失成为结晶。在4℃下，在2.7摩尔含有0.08％癸醇的硫酸铵；0.05M Na-K-磷酸盐pH7.4中制备晶体。在4℃下结晶，hSA 58.7mg/ml。
优选实施方案的描述在本说明书中下列缩写具有指定的含义。
缩写pH 按照熟知的科学参数描述化学物或化合物氢离子活性的所用术语。
PEG 聚乙二醇的缩写术语的解释胶体 -指不能轻易穿过毛细管壁的大分子。这些化合物发挥渗透(oncotic)(即它们吸引流体)负载的作用并且通常被施用以恢复血管内容量和改善组织灌流。
渗滤 -一种结合超滤膜从大分子溶液中有效去除盐或其它小分子的操作。目的是从白蛋白溶液中去除小分子并且调节缓冲剂，用于下一个步骤。
组织灌流 -流至组织的血液的量原料流-提供过程或方法并且含有目的蛋白质的原料或原溶液。
本发明结晶hSA的方法提供了高度理想的从含有各种各样的其它蛋白质组分的原料流中分离和纯化白蛋白的方法。晶体是蛋白质的最纯的形式，一旦被沉淀，晶体比非晶形沉淀具有显著更好的机械操作特性并且可通过各种各样的本领域中已知的方法被分离。例如，在工业滤器上可有效地分离和洗涤晶体。结晶是被最多使用的精细化学物质和药物的最终纯化方法。
按照本发明的优选实施方案，用磷酸钠和磷酸钾的混合物结晶白蛋白。通过使用本发明的方法条件和方法以系统方式优化结晶。如果条件没有被最佳地调节，白蛋白可以非晶形相、液滴或凝胶的形式沉淀。非晶形沉淀是非常难以操作的，在滤器上不能有效地分离和洗涤它。非晶形相不轻易地转化为晶体。当按照本发明调节方法条件时，晶体产生是最佳的。下面提供了本发明的不同实施方案。
1.磷酸盐尽管单独用磷酸钠或单独用磷酸钾可进行结晶，但优选使用磷酸钠和磷酸钾的混合物。优选磷酸盐NaH2PO4和K2HPO4，因为它们可被溶解呈直到4摩尔水溶液的浓度。可以所有的比例混合这些4M的磷酸盐以制备具有各种希望的pH值的4M结晶缓冲剂。
优选地，以相对高的磷酸盐浓度结晶白蛋白，典型地约2.7M或更高。在图1和图2中最清楚地揭示了磷酸盐浓度的重要性，它们描述了白蛋白晶体在具有不同摩尔浓度的磷酸盐中的溶解度。图2的半对数图显示，通过增加磷酸盐摩尔浓度系统地降低晶体的溶解度。通过使用不断增加的磷酸盐的摩尔浓度，在方法中可以将白蛋白收率调节至理想的水平。借助磷酸盐的溶解度，设置可使用磷酸盐浓度的上限。通过降低温度和增加白蛋白浓度，降低磷酸盐溶解度。在本发明方法的一个实施方案中，通过将试剂的温度降低至10℃以下，显著地降低磷酸盐的溶解度。通过降低试剂的温度和增加白蛋白浓度，可获得的水浓度也被降低。
按照本发明的优选实施方案，在磷酸盐浓度2.0-2.7M的范围内，原料中的大多数杂质有效地沉淀，白蛋白在室温(25-30℃)下不轻易地结晶。通过被过滤(在调节磷酸盐浓度2.0-2.7M后)去除杂质。此后将滤液致冷至10℃，在该温度下白蛋白结晶。此外为了增加晶体白蛋白收率，可以增加磷酸盐浓度(利用图1和图2的信息)，还参见表2和图4。
2.pH的重要性按照本发明，用磷酸盐混合物充分控制结晶批料(batch)的pH。将具有不同pH值的混合物的实例和得到的对白蛋白晶体的影响呈现在表1中。将pH对白蛋白晶体溶解度的影响图解地呈现在图2中，还参见表2。通过降低pH从pH5.6至大约6.6降低了白蛋白晶体溶解度。直到至少pH7.4晶体溶解度仍然在很低的水平。在低于pH5.5晶体完全溶解。
pH对结晶动力学具有特异的作用，因此不能以简单的方式使用更高的pH范围6.3-7.4。在更高的pH范围内，如果恰好在方法的开始调节这样的pH，白蛋白以非晶形相(液滴)的形式沉淀。因此结晶方法优选最初用磷酸盐pH6.2进行(见表1磷酸盐的混合配方以及图2和图3)。过后当白蛋白大多数被结晶时，增加磷酸盐浓度并且调节pH至更高的值，以增加晶体收率。当洗涤晶体时，还有利地使用更高的pH，因为减少了蛋白质的丢失。
3.温度的影响将白蛋白晶体在不同温度和磷酸盐浓度下的溶解度图解地呈现在图3中。在更高的温度下，白蛋白晶体溶解度增加。最低的溶解度存在于约0℃。然而，优选的结晶温度是约10℃，因为在更低的温度下磷酸盐可结晶并且使方法失去控制。实例操作约0℃是可能被进行的，因为磷酸盐结晶相对地慢。
白蛋白的结晶动力学在室温下非常慢。因此可以在室温下将磷酸盐浓度调节至2.6-2.7，不沉淀或结晶白蛋白。然而，杂质在室温下轻易地沉淀。过滤后，将白蛋白溶液致冷优选至10℃。搅拌溶液，白蛋白结晶。
通过利用加热循环可以将白蛋白再结晶。通过加热至45℃溶解晶体。致冷至10℃后，白蛋白再次结晶。可以使用再结晶以提高晶体纯度。在每次结晶后，通过进行过滤可以去除母液。可在滤器上用冷的3M磷酸盐洗涤晶体。可以重复无数次再结晶循环。可以使用再结晶以提高白蛋白纯度。为方便，请参见表7和表8以及图7。
白蛋白相对热稳定。它能被加热直到65-70℃持续长时间。在这样的高温度下，大多数其它的蛋白质变性和沉淀。因此可以使用65-70℃的加热处理以在结晶前纯化白蛋白溶液。最高的可耐受温度与白蛋白的组成和pH有关。在高磷酸盐浓度pH6.2下，最高的温度是65℃。在低盐媒介和pH5.4下，在70℃加热2-3小时是可能的。将热处理影响的实例呈现在表2和表3以及图6中。
4.辛酸盐白蛋白需要用辛酸盐饱和以便能够结晶。辛酸盐对白蛋白，具体对热稳定性还具有稳定作用。其它的长连脂肪酸和长链醇也是有用的。在现有技术中癸醇是非常有效和熟知的。辛酸盐具有双重作用，这取决于如何使用它。当仅将它用来饱和白蛋白的结合位点时，它是有益的。然而，过量的辛酸盐将溶解晶体并减少白蛋白收率。
辛酸盐的作用很好地揭示在图4中。向洗涤的晶体中添加辛酸盐明显增加晶体溶解度。当辛酸盐增加至10mM时，晶体溶解度快速增加。当辛酸盐增加从10mM至20mM时，溶解度增值较小但仍然明显。在磷酸盐浓度2.63M和温度10℃下，白蛋白溶解度增加从10mM辛酸盐中的9mg/ml至10mM辛酸盐中的21mg/ml。在更高的磷酸盐浓度2.82M和温度10℃下，白蛋白溶解度增加从0mM辛酸盐中的2mg/ml至10mM辛酸盐中的12mg/ml。
辛酸盐的溶解影响是这样的重要，以致于游离辛酸盐的浓度应被很好地控制并在结晶步骤中维持尽可能低。当其它方面的条件使白蛋白晶体溶解度非常低时，低水平的游离辛酸盐，1-2mM，也许是可接受的。请参见图2至图7。
5.白蛋白浓度、纯度在实验溶液中，将起始溶液中的白蛋白浓度设定至比所用条件下晶体的溶解度更高的水平。按照本发明，当用来源于转基因动物或细胞培养物的原料流工作时，通常使用最初的澄清步骤以提供一种溶液，在该溶液中白蛋白浓度和其它化学参数被调节或被操作以致于它也比hSA晶体的溶解度高。在这两种情况下，通过使用相图(图1-4)中的溶解度信息可以估计白蛋白的回收。按照本发明，在原料流溶液中的白蛋白的浓度水平通常在一升结晶批中15-300克白蛋白的范围内。在来自生物来源并且适用于商业或产业生产hSA的原料流中，遇到了这些相同的范围。
此外，按照本发明的优选实施方案，在结晶过程中白蛋白不需要是纯的。可利用本发明开发并提供的方法以结晶出在原料中的白蛋白，其中纯度水平大约是10％，也就是，白蛋白仅构成给定溶液总蛋白质的10％。例如，用来源自转基因来源或细胞培养物的hSA，在澄清步骤后留下的大多数杂质在第一次添加磷酸盐直到2.6M浓度水平后可被去除。还应注意到，转基因来源，典型地是乳汁，但也包括其它体液例如血液或尿，可含有hSA，该hSA是被设计以引起hSA(或其它目的蛋白质)在那些体液或组织中稳定表达的DNA构建体的插入的结果。在沉淀和被过滤后，通过超滤进一步浓缩滤液以增加白蛋白浓度水平。此后按照本发明将浓缩的白蛋白溶液冷却并结晶。
实施例1优选的结晶方法本方法描述了纯化的白蛋白溶液的结晶并为所述目的描述了仅磷酸盐溶液的用途。然而，按照本发明，添加本文提供的另外的步骤，可以在不纯或只是部分纯化的原料上使用本方法，如可从转基因或细胞培养原料流中见到的原料。下面呈现了例如利用具有明显不纯物质的起始溶液的本发明方法的变异。
步骤1.沉淀在结晶中使用了磷酸盐储备溶液，该溶液含有溶解在水中并被补充至1.0升的2.8摩尔的NaH2PO4和1.2摩尔的K2HPO4。当被稀释成0.5M后测量时，该4M磷酸盐溶液具有pH6.2。此后，通过添加371mlpH6.2的4.0M磷酸盐储备溶液，沉淀200ml纯化的白蛋白溶液。在所添加体积的基础上，磷酸盐浓度是2.6M。使溶液在室温下沉淀4-18小时，就本发明的这种变异来说，目的时间相对于现有技术方法是短的，在所有情况下少于24小时。所产生的沉淀的量与白蛋白溶液中杂质的量直接有关。
步骤2.过滤此后，通过具有大约1μm孔径的玻璃纤维或纤维素纤维纸过滤沉淀的hSA。然后将过滤的溶液用于按照本发明优选的结晶方法。
步骤3.结晶在10℃的恒温的温箱中进行结晶。用顶部驱动的螺旋桨缓慢搅拌(大约70rpm)所述批料(batch)。通过添加229ml pH6.2的4M磷酸盐从2.6M至3M逐渐增加磷酸盐浓度。使结晶批料持续4天，然后收获和洗涤。
步骤4.晶体的收获和洗涤按照本发明优选的实施方案，通过用玻璃纤维(1μm孔大小，142mm直径)过滤所述批料而收获hSA晶体。过滤后，然后用约80ml冷的3M磷酸盐pH6.2洗涤晶体。然后将晶体悬浮在约150ml冷的3M磷酸盐pH6.2。
关于下表2和本发明的优选结晶方法，优选保持混合体积比例固定。优选地，在制备缓冲剂混合物后不应调节pH。就本发明的这个实施方案来说，pH是大约的，因为该值将随磷酸盐浓度的改变而变化。在pH对晶体溶解度的研究中使用本发明的缓冲剂。如从下表2中所见，缓冲剂No10提供了为晶体形成一致地优化的条件并且提供该缓冲剂的条件是本发明标准缓冲剂的优选条件。(还参见，图11-13)。
表2.4M磷酸盐缓冲液的混合表
磷酸盐缓冲剂稀释的缓冲剂的pH值是在0.1-0.4M的范围内。
缓冲剂No11.pH6.3不太受稀释的影响。
当M更高时，缓冲剂No1-10具有更低的pH。
当摩尔浓度更高时，缓冲剂No12-30具有更高的pH。
还应注意到，在本公开的图6中提供了作为辛酸盐浓度和温度的函数的白蛋白在2.63M磷酸盐中溶解度的曲线开放的圈(○)为在10℃下温育的样品的标记并且黑色正方形(■)为在5℃下温育的样品的标记。
实施例2用微扩散(microdiffusion)方法结晶白蛋白按照本领域中已知的悬滴微扩散(hanging drop microdiffusion)法由48份样品制备了结晶样本。样品溶液含有纯化的198mg/ml的白蛋白和3.2mg/ml辛酸钠。通过将3μl的白蛋白溶液与3μl的1.8-2.3M磷酸盐混合制备了白蛋白的水溶液。允许滴在封闭的微扩散孔中平衡并在5℃下冷却。按照本发明的优选实施方案，在少于24小时内产生晶体。按照本发明，来自其它来源物质，特别是转基因来源和细胞培养来源的原料流也可以与悬滴法结合被使用。
用显微镜观察晶体并用数字照相机拍照。在表19和20上提供了关于晶体发展的信息。这些样本显示，辛酸盐饱和的白蛋白在1.8M至2.3M磷酸盐，在精确限定的pH范围，即从5.0-6.4内结晶。结晶形成的最优选的pH是在pH6.2，如在下表3中所见。有效提供的实验条件的范围覆盖了在其它原料流来源中所见的浓度和溶液参数的范围，见表4。
表3.
表4.
实施例3在不纯原料中结晶白蛋白从重组hSA原料起始进行下面的方法描述，该原料含有许多干扰结晶的杂质。需要最先的方法步骤用于去除杂质。如果使用更纯的白蛋白，相应地减少步骤的数目。
步骤1.浓缩应通过尽可能多的超滤过滤浓缩原料。高蛋白质浓度将减少磷酸盐的使用并增加可结晶rhSA的收率。在浓缩步骤的末尾还应用水过滤材料，以减少来源于前面方法步骤的盐。蛋白质浓缩的标准A280nm＝150-200。
步骤2.用磷酸盐的最初沉淀向1.5体积的rhSA浓缩物中添加2.5体积的4M磷酸盐(pH6.2)。在本步骤中的最终磷酸盐浓度是2.5M，该浓度沉淀杂质但不沉淀白蛋白。优选在室温下进行该步骤。
步骤3.过滤去除用布氏漏斗或压力室滤器滤出的沉淀。使用硅藻土作为助滤剂，因为沉淀是非常细粒状的物质。因为沉淀将浮在液体的上面，所以离心不是一种方便的选择。
步骤4.结晶通过在滤液中添加更多的4M磷酸盐(pH6.2)直到浓度为2.8M，开始hSA的结晶。在冷却的温度，优选约5.0℃下进行结晶。hSA的结晶，按照本发明的实施方案在24小时内自发开始。在另一个实施方案中，晶种的添加将使该过程更迅速。
步骤5.晶体的洗涤按照本发明的优选实施方案，通过离心或优选通过过滤洗涤晶体。在离心中，晶体浮在磷酸盐缓冲剂的上面。在约+5℃下用新鲜2.8M磷酸盐溶液进行洗涤。应该用小于0.1bar的低压差进行晶体洗涤。重复洗涤3-4次直到滤液中的可溶性蛋白质保持在接近恒定的低水平，A280nm＝1.0或更小。
步骤6.晶体贮存物的配制将洗涤过的晶体分散在小体积的2.8M磷酸盐缓冲剂中。可以在这种溶液中贮藏晶体直到被配置用于下一步骤。
实施例4加热处理后结晶不纯的白蛋白原料本实施例使用的原料流物质具有显著量的作为杂质的蛋白质。白蛋白为存在的蛋白质的大约30％。如已所述，这在由澄清的或部分纯化的转基因或细胞培养物来源提供的原料流物质的典型范围内。将使用的包括107ml 4M磷酸盐pH6.2的溶液添加到200ml原料溶液中(此步骤前它是在2M磷酸盐中)以得到2.70M溶液。按照本发明，将这种沉淀的溶液用作结晶的原料溶液。
热处理在55℃将沉淀的起始溶液(在2.70M磷酸盐中)温育90分钟。作为这种热处理的结果，形成了大量的棒条样晶体以及非晶形沉淀。总蛋白质的大约75％至80％结晶或沉淀。当它还是热的时候，通过玻璃纤维滤器过滤浆液去除晶体和沉淀。使用一些硅藻土作为助滤剂。只取含白蛋白的上清液滤液用于下一步骤。
浓缩和过滤过滤后，溶液具有太低的白蛋白浓度用于结晶。因此，要将它浓缩并用Fresenius Polysulfone UF 6.2Hemoflow F5HPS透析筒在55℃渗滤。方法步骤的详细数据显示在表6中。
hSA结晶增加浓缩溶液的磷酸盐浓度并将其缓慢调节至2.8。同时在冷却器中轻轻地搅拌该批料使hSA结晶。
收获hSA晶体并通过过滤的真空洗涤。洗涤溶液是2.88M磷酸盐pH6.4。如在下表5和图7中所显示的，杂质的热结晶在技术上是容易的并且是去除原料的主要杂质的快速方法。
表5.原料和洗涤的晶体的纯度分析。ELISA试验的结果。
原料Genzyme转基因hSA白蛋白浓度lot # X1131FF，蛋白质浓度试验TP 84g/l和79g/l，ALB 28.58g/l和28.75g/l。
表6.不纯的白蛋白从原料到晶体
用200ml等份样品溶液计算全部序列步骤的物料平衡。
实施例5通过使用加热和冷却循环重结晶白蛋白将先前在2.7M磷酸盐pH6.2中制备的hSA晶体浆液，蛋白质浓度为37.5g/l，用作按照本发明的优选实施方案进行的本研究的原料。将五份所述晶体浆液的样品，每份0.50ml，在40、45、55、65或70℃培育60分钟。在全部测试温度下溶解晶体。在加热结束时，通过0.45μm滤器过滤样品。通过测量在280nm处的吸收测定滤液的可溶性蛋白质。
如在表7和表8以及图13中所见，当在40-55℃温育所述晶体浆液时，总蛋白质的约10％沉淀。在这种温度范围内该值非常恒定并且它表示在加热过滤步骤中被去除的杂质。当将温度从65增加至70℃，样品中的可溶性蛋白质从83％降低至37％。因此，在70℃白蛋白也开始不可逆地沉淀。
过滤后，样品1至5加热达到65℃，在设定在5℃的冷却器中18小时后样品全部重结晶良好。当在70℃温育样品5时，在滤液中没有晶体产生，这表明白蛋白在所述温度下在2.7M磷酸盐中不稳定，参见表8。这些例子显示白蛋白可以，按照本发明的优选实施方案，通过使用加热达到65℃，此后过滤并通过合适的重结晶循环而被很好地纯化。
表7.hSA晶体浆液的加热沉淀研究的结果
表8.被加热并过滤的样品的观察，在低温下重结晶。
实施例6在更高的pH下结晶白蛋白按照本发明进行的本研究显示，白蛋白晶体的溶解度和结晶可能依赖pH。另一个问题是在磷酸盐缓冲剂存在下的辛酸盐的分离。在更高的pH下辛酸盐的溶解度增加。因此，甚至轻微更高的pH对最佳结晶形成将是理想的。按照本发明，用三个不同的磷酸盐摩尔浓度水平在pH6.2-6.6的范围内制备了试验结晶。如下表9中呈现了实验细节。
结果的评价如在下表9中所见，当将pH增加至值6.4和6.5时，白蛋白非常有效地结晶。在pH6.4以上时，白蛋白溶解度非常低。不幸的是，在更高的pH水平时，白蛋白结晶为非常小的针形(参见图10-13)。可能通过在较低的pH6.2或6.3开始结晶，可发展成较大的晶体尺寸。在实现接近平衡时，通过逐渐地添加4M K2HPO4将pH调节至更高的水平。
表9.白蛋白浓缩物102-5的试管结晶。
实施例7白蛋白晶体的重结晶和洗涤重结晶和洗涤在45℃加热洗涤的晶体(102-12)5分钟。晶体快速溶解。在还温的时候，用0.45μm注射器滤器过滤溶液。在2℃搅拌经过滤的溶液直到结晶(3天)。该批结晶很好(图2)。通过过滤收获晶体并在0.45μm(50mm直径)Sartorius膜上用2.82M pH6.2磷酸盐洗涤。将洗涤过的晶体分散在2.82M磷酸盐缓冲剂中。
表10.白蛋白晶体的重结晶和洗涤
适应症和用途低血容量症低血容量症是通过本发明的方法纯化并可制备得到的白蛋白，25％的溶液，Buminate 25％的可能适应证。它在逆转低血容量症的有效性在很大程度上取决于它将肠液吸入循环中的能力。它对水合很好的患者最有效。当低血容量症是长时间持续并且血白蛋白减少存在，伴随大量的水合或浮肿，25％白蛋白比5％蛋白质溶液优选。然而，在缺乏大量或过度水合的情况下，应该使用5％蛋白质溶液或应用拟晶体稀释25％白蛋白。虽然在休克的紧急处理中可以使用拟晶体溶液和含胶体的血浆替代物，但白蛋白具有延长的静脉内半衰期。当血容量缺失是出血造成的时候，应尽可能快速地给予适合的红血细胞或全血。
血清蛋白减少血清蛋白减少是使用通过本发明方法纯化和可制得的白蛋白(25％的溶液，Buminate 25％)的另一种可能的适应症。血清白蛋白减少可由下面所述的一种或多种引起产生不足(营养不良、烧伤、大手术、感染等)；过量的分解代谢(烧伤、大手术、胰腺炎等)；从身体的丢失(出血、过量的肾排泄、烧伤渗出物等)；以及身体内的重分布(大手术、各种炎性状况等)。
当白蛋白缺失是过量蛋白质丢失的结果时，施用白蛋白的效果将是暂时的，除非逆转了潜在的病症。在大多数情况下，伴随潜在病症的治疗的增加的氨基酸和/或蛋白质的营养性替代将比白蛋白溶液更有效地恢复正常血浆白蛋白水平。偶然地伴随严重损伤、感染或胰腺炎的血清蛋白减少不能快速地逆转并且营养补充剂可能不能恢复血清白蛋白水平。在这些情况下，白蛋白(人)，25％的溶液，Buminate 25％可能是一种有用的辅助剂。
烧伤还没有建立在烧伤的早期治疗中使用白蛋白、电解质和流体的最佳方案，但是，结合适当的类晶体疗法，白蛋白(人)，25％的溶液，Buminate 25％可能被表明在广泛烧伤后起始24小时期间后用于胶体渗透压缺陷的治疗和替代伴随任何严重烧伤的蛋白质丢失。
成人呼吸窘迫综合征(ARDS)ARDS的特征是血蛋白过少状态，该状态在原因上可能与间质性肺水肿有关。虽然关于在这些患者中白蛋白输注的精确适应症存在不确定性，但如果有伴随有血白蛋白减少的肺过载，当与利尿剂一起使用时，25％白蛋白溶液可能具有治疗效果。
肾变病在治疗有严重肾变病的患者中的浮肿中，白蛋白(人)，25％的溶液可能是一种有用的辅助，所述患者正接受类固醇类和/或利尿剂。
心肺分流外科手术在心肺分流手术之前或在心肺分流手术过程中推荐白蛋白(人)，25％的溶液，Buminate 25％，尽管没有显示它相对于类晶体溶液的优点的明确数据。
新生儿的溶血病(HDN)在患有严重的HDN的婴儿中可给予白蛋白(人)，25％的溶液，Buminate 25％以试图结合未缀合胆红素并使其解毒。
将通过本发明方法纯化的白蛋白用作药物给药的赋形剂也是可能的。
晶体筛选实验在具有被分成4排(A、B、C、D)和6列的24孔盒中进行悬滴筛选。在初步报告中，仅以如下试剂列表的形式呈现所述筛选。提供了对结果的简要评论。在最终报告中，在表中用类似于下面实施例表的完全细节提供结果。
显微术和表在实验的开始用2-3天的频率以及后来一周一次进行了用显微术的样品评价。表中的显微术观察结果为使用下面字母的缩写形式N＝没有沉淀或其它相分离C＝一些沉淀存在CC＝显著量的晶体存在A＝非晶形沉淀，看起来像云或棕色烟的非透明颗粒云，颗粒的大小接近光学显微镜分离能力的最低限。
AA＝显著量的非晶形沉淀L＝液相分离，球形透明滴，看起来像水中的油。
LL＝明显的液相分离G＝凝胶块，直径几微米的不规则玻璃状透明颗粒GG＝显著量的凝胶X＝污染或干燥的滴，中断的实验表11.
对非晶形沉淀的可逆温度影响。在显微术下，在较高的温度下沉淀增加。晶体是非常温度敏感的，它们在较高的温度下溶解。
MCS 23 AAT，样品GTC hSA标记7F-5AC；用0.05M K-Na-磷酸盐pH7.4缓冲的PEG 3350或(NH4)2SO4，癸醇添加物的影响。A排在0.05M K-Na-磷酸盐pH7.4中的17、18、19、22、25或30％的500μl PEG 3350；向每500μl A试剂中添加10μl 4％癸醇以得到最终0.08％癸醇。B排和A排一样，但向每500μl A试剂中添加50μl 4％癸醇以得到最终0.36％癸醇。C排500μl的(NH4)2SO4，在0.05M K-Na-磷酸盐pH7.4中的1.5、1.65、1.8、2.1、2.4或2.7M；向每500μl A试剂中添加10μl 4％癸醇以得到最终0.08％癸醇。D排和C排一样，但向每500μl A试剂中添加50μl 4％癸醇以得到最终0.36％癸醇。
结果用2.4M和2.7M硫酸铵-癸醇组合产生了高质量的晶体(图14)用19％PEG，0.08％癸醇生产了不同习性的晶体。用两种试剂还生产了非晶形或凝胶沉淀。结晶与试剂浓度和温度非常显著地相关。
表12.
上表12，MCS 22 AAS，样品Sigma hSA，A-9511；用0.05M K-Na-磷酸盐pH7.4缓冲的PEG 3350或(NH4)2SO4癸醇添加物的影响与表11相似的筛选。
结果Sigma hSA以及GTC hSA 7F-5AC不结晶。只有一个在1.5M(NH4)2SO4，0.36％癸醇中的样品产生了高质量的晶体。
表13.
对非晶形的可逆温度影响。在显微术下，在较高的温度下沉淀增加。晶体是非常温度敏感的，它们在较高的温度下溶解。
关于表13，MCS 22AT，样品GTC hSA；标记7F-5AC；用0.05MK-Na-磷酸盐pH7.4缓冲的PEG 3350或(NH4)2SO4辛酸添加物的影响。
结果只在没有辛酸的2.7M(NH4)2SO4中产生了不稳定的晶体。
表14.
MCS 22AT，样品Sigma hSA，A-9511用0.05M K-Na-磷酸盐pH7.4缓冲的PEG 3350或(NH4)2SO4辛酸添加物的影响。与表3相似的筛选。
结果没有晶体产生。在较高试剂浓度下只有沉淀。
表15.
MCS16样品GTC hSA标记7F-5AC；用磷酸盐缓冲的硫酸铵4排A 1,0M，B 1,5M，C 2,0M，D 3,0M6栏0,1M磷酸盐pH5.0 pH5.6 pH5.9 pH6.2 pH6.6 pH7.0
结果在2M以上非晶形沉淀。一些不稳定的质量不好的晶体在40天贮藏中消失了。
表16.
注晶体不稳定。
MCS17，样品GTC hSA标记7F-5AC；用磷酸盐缓冲的硫酸钠4排A 1,0M，B 1,5M，C 1.75M，D 2.0M Na2SO4
6栏0,1M磷酸盐pH5.0 pH5.6 pH5.9 pH6.2 pH6.6 pH7.0结果在1.75M和2.0M Na2SO4中的不稳定晶体在1.5-2.0M Na2SO4中的沉淀、非晶形和凝胶表17.
注当将晶体移至室温进行显微镜观察时，晶体不稳定。
MCSA30，样品GTC hSA标记7F-5AC在所有滴中1.6-2.2M K-Na-磷酸盐pH6.6-7.8，0.36％癸醇结果在2.2M磷酸盐pH7.0-7.8中好质量的晶体。晶体是非常温度敏感的，在室温下显微术后它们溶解并且在致冷器中又结晶。
表18.
注可逆温度影响；显微术下在更高温度下非晶形沉淀增加。晶体不稳定，显微术下在较高温度下它们溶解。
表19.
注可逆温度影响；显微术下在较高温度下非晶形沉淀增加。晶体不稳定，显微术下在较高温度下它们溶解。
表18和19MCS 15/1和MCS 15/2，样品GTC hSA标记7F-5AC没有任何添加物的磷酸盐
pH4.3-8.2 Na-K-PO4浓度1,2M-2,2M4排A 1,2M，B 1,6M，C 1,8M，D 2,2M11栏pH4.3(NaH2PO4)含有pH5.0 pH5.3 pH5.6 pH5.9 pH6.2 pH6.6 pH7.0 pH7.4 pH7.7 pH8.2结果在pH7.4为沉淀的精确最佳值。在pH6.6以上和在pH5.3不稳定的晶体。存在进一步研究的很大潜力。
表20.
MCS21，样品GTC hSA标记7F-5AC与氯化镁的试剂组合并含有2-丙醇或苄醇结果只在用含有2-丙醇的样品时沉淀。用苄醇没有影响。
表21.
样品GTC hSA标记7F-5AC
用磷酸盐缓冲的氯化钠4排A 1,5 B 2.0M，C 3.0M，D 4,0M6栏0,1M磷酸盐pH5.0 pH5.6 pH5.9 pH6.2 pH6.6 pH7.0结果没有沉淀或相分离表22.
样品GTC hSA标记7F-5AC用磷酸盐缓冲的氯化钾4排A 1,5M，B 2.0M，C 3.0M，D 4,0M6栏0,1M磷酸盐pH5.0 pH5.6 pH5.9 pH6.2 pH6.6 pH7.0结果大多数没有沉淀或相分离。在3.9M KCl pH6.2-6.6中40天后，凝胶沉淀。
表23.
样品GTC hSA标记7F-5AC10-25％PEG 6000，0.05-0.3M乙酸铵，0.035M Tris-HCl pH8.0-8.4，结果没有晶体。在大多数样品中有不同的沉淀。
表24.
样品GTC hSA标记7F-5AC样品中的不同分子量400-20000的PEG，磷酸盐缓冲剂pH7.4。
结果没有晶体并且大多数没有沉淀，在最高浓度的PEG6000下非晶形形成。
表25.
样品GTC hSA标记7F-5AC用0.1M K-Na-磷酸盐pH4.8-8.2缓冲的25％PEG 6000和10-30％2-丙醇排A25％PEG 6000和10％2-丙醇，缓冲剂pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2排B25％PEG 6000和15％2-丙醇，缓冲剂pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2排C25％PEG 6000和20％2-丙醇，缓冲剂pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2排D25％PEG 6000和30％2-丙醇，缓冲剂pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2结果在所有样品中的强液相分离，在30％2-丙醇中的凝胶相。
重组生产越来越多的重组蛋白质正被开发用于治疗和诊断应用。然而，使用常规方法，这些蛋白质的许多可能难以以功能形式和/或以所需要的量生产或生产费用昂贵。常规方法涉及将负责特定蛋白质产生的基因插入宿主细胞例如细菌、酵母或哺乳动物细胞，例如，COS或CHO细胞中，然后使细胞在培养基中生长。然后培养的细胞合成所需要的蛋白质。传统的细菌或酵母系统不能产生呈功能形式的许多复合体蛋白质。尽管哺乳动物细胞可以产生复合体蛋白质，但他们一般难以生长和生长费用昂贵，并且通常只产生mg/L量的蛋白质。另外，非分泌的蛋白质相对地难以从原核细胞或哺乳动物细胞中纯化，因为它们不被分泌到培养基中。
一般地，转基因技术的特征在于，制造和分泌正常情况下不被分泌的蛋白质(非分泌的蛋白质)的方法。该方法包括从核酸构建体中表达蛋白质，所述核酸构建体包括(a)启动子，例如，乳上皮特异性启动子，例如，乳汁蛋白启动子；(b)能指引蛋白质分泌的信号序列，例如，来自乳汁特异性蛋白质的信号序列；(c)可选择地，编码分泌的蛋白质的氨基末端编码区的足够部分的序列，例如，被分泌到乳中的蛋白质，以允许，例如，在转基因哺乳动物的乳汁中，非分泌的蛋白质的分泌；以及(d)编码非分泌的蛋白质的序列，其中元件(a)、(b)，可选择地(c)，以及(d)优选以所述次序可操作地连接。
在优选的实施方案中元件a、b、c(如果存在)，以及d来自相同的基因；元件a、b、c(如果存在)，以及d来自两种或更多种基因。
在优选的实施方案中，所述分泌是至转基因哺乳动物的乳汁中。
在优选的实施方案中所述信号序列是β-酪蛋白信号序列；所述启动子是β-酪蛋白启动子序列。
在优选的实施方案中，非分泌的蛋白质编码序列是人来源的；编码截短的核或胞质多肽；编码人血清白蛋白或其它期望的目的蛋白质。
本发明的实施将使用，除非另有说明，常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的技术，这些技术在本领域的技术人员技能之内。在文献中描述了这样的技术。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，由Sambrook，Fritsch和Maniatis编(Cold Spring HarborLaboratory Press1989)；DNA Cloning，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等，美国专利No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1984)；Culture Of AnimalCells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical GuideTo Molecular Cloning(1984)；论文，Methods In Enzymology，(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154和155(Wu等人编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
乳汁特异性启动子在实施本发明中有用的转录启动子是在乳腺上皮细胞中优先被激活的那些启动子，包括控制编码乳汁蛋白例如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark等，(1989))Bio/Technology7487-492)、乳清酸蛋白(Gorton等(1987)Bio/Technology51183-1187)、以及乳清蛋白(Soulier等，(1992)FEBS Letts.29713)的基因的启动子。酪蛋白启动子可来源于任何哺乳动物物的α、β、γ或κ酪蛋白基因；优选的启动子来源于山羊β酪蛋白基因(DiTullio，(1992)Bio/Technology1074-77)。在乳房组织中被特异性激活的乳汁特异性蛋白质启动子可来源于cDNA或基因组序列。优选地，它们是来源基因组。
关于在至少一个，通常是多个生物中的上面列出的所有乳腺特异性基因的DNA序列信息是可获得的。参见，例如，Richards等，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(α-乳清蛋白大鼠)；Campbell等，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee &Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242，735-742(1987)(α-乳清蛋白人)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky等，Gene 66，87-96(1988)(牛β酪蛋白)；Alexander等，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon等，FEBS Lett.188，48-55(1977)(牛αs2酪蛋白)；Jamieson等，Gene61，85-90(1987)，Ivanov等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexander等，Nucleic Acids Res.17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie 69，609-620(1987)(牛α-乳清蛋白)。Mercier & Vilotte，J.Dairy Sci.76，3079-3098(1993)综述了不同乳蛋白基因的结构和功能(为所有目全部并入以供参考)。达到可能需要另外的序列的程度，使用现有的序列作为探针，可轻易地克隆已经获得的序列侧翼区。使用已知的相关核苷酸序列，或相关蛋白质的抗体作为探针，通过筛选来自这类生物的库，同样获得来自不同生物的乳腺特异性调节序列。
信号序列在信号序列中，适用于本发明的是乳汁特异性信号序列或导致真核或原核蛋白质分泌的其它信号序列。优选地，所述信号序列选自乳汁特异性信号序列，即，它来自编码被分泌入乳汁中的产品的基因。最优选地，所述乳汁特异性信号序列与在本发明的表达系统中使用的乳汁特异性启动子有关。对本发明来说，信号序列的大小并不关键。全部所需要的是，所述序列具有足够的大小以实现例如，乳房组织中所期望的重组蛋白质的分泌。例如，来自编码酪蛋白，例如，α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸蛋白和乳清蛋白的基因的信号序列适用于本发明。优选的信号序列是山羊β-酪蛋白信号序列。
也可以使用来自其它分泌的蛋白质，例如，由肝细胞、肾细胞或胰细胞分泌的蛋白质的信号序列。
转基因哺乳动物在本发明人血清白蛋白的情况下，将目的蛋白质的DNA构建体导入哺乳动物的生殖系。例如，通过标准的转基因技术，可将所述构建体的一个或多个拷贝掺入哺乳动物胚胎的基因组中。
在本发明中可以有用地使用非人类哺乳动物。本申请将哺乳动物定义为不包括人的具有乳腺并产生乳汁的所有动物。优选地，优选产生大量的乳汁并具有长泌乳期的哺乳动物。优选的哺乳动物是奶牛、绵羊、山羊、小鼠、牛、骆驼和猪。当然，关于本发明的任何给定的表达序列，这些哺乳动物中的每一个可能与其它的不一样有效。例如，特定的乳汁特异性启动子或信号序列可能在一种哺乳动物中比在其它的哺乳动物中更有效。然而，本领域的技术人员通过本发明的教导可容易地作出这样的选择。
虽然为理解的目的用举例说明和实例在一些细节中描述了前述发明，但对本领域的技术人员来说，可以实施某些变化和修饰将是显而易见的。因此，所述描述和实例不应被解释为限制本发明的范围，该范围由所附的权利要求限定。
还应注意的是，尽管白蛋白是用不同的化合物、乙醇和包括磷酸盐的无机盐进行结晶的，但在文献中没有发现用磷酸盐结晶的产业方法。通过本发明的优选实施方案，现已发现通过最大程度地利用本发明的发明关键方法参数和/或条件，用磷酸盐可有利地结晶人白蛋白。上面列举和描述了发明的参数及其一些变异。
因此，还要理解，此处提供结晶的和纯化的人白蛋白的本发明的实施方案仅仅是举例说明本发明原理的应用。从前面的描述中明显的是，不脱离本发明的精神，或所附权利要求的范围，可以采用在形式、使用方法和所公开的元件的应用中的变化。
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30.Vermeulen LC et al.，Guidelines for the Use of Albumin，Nonprotein Colloids，and Crystalloid Solutions，ARCH INTERN MED.(1995)155373-379.
权利要求
1.一种晶体人白蛋白产品，该产品包含至少一部份由如下方法得到的物质a)浓缩含白蛋白的流体，直到所述流体具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流体中添加第一磷酸盐混合物，直到所述磷酸盐混合物的浓度在2.4-2.6摩尔的范围内；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次过滤以致形成所得的结晶批料溶液以去除杂质；d)冷却所述结晶批料溶液的滤液至至多15℃的温度；e)让所述结晶批料溶液中的人白蛋白结晶；f)向所述结晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸盐混合物，足以达到至多3.0摩尔的浓度；g)从任何剩下流体中进行白蛋白晶体的第一次分离；h)将来自所述第一次白蛋白晶体分离的白蛋白晶体悬浮在第二磷酸盐混合物中，其中所述第二磷酸盐混合物具有2.7-3.0M的浓度；i)加热来自所述第一次白蛋白晶体分离的晶体悬浮液达到温度在40-50℃的范围内以溶解晶体；j)对来自所述白蛋白晶体的第一次分离的溶解的晶体悬浮液提供第二次过滤；k)冷却来自所述白蛋白晶体的第一次分离的所得到的溶解的晶体悬浮液至至多15℃的温度；和l)让白蛋白晶体从所得到的冷却的晶体悬浮液中形成；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的含有人白蛋白的原料流中纯化和结晶。
2.权利要求1的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
3.权利要求1的方法，其中所述第一磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
4.权利要求1的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
5.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有在一升溶液中15-50克范围内白蛋白的浓度。
6.权利要求1的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物的温度在20-30℃的范围内。
7.权利要求1的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物具有6.0-6.7范围内的pH。
8.权利要求1的方法，其中将过滤所述结晶批料后收集的所述滤液的温度冷却至至多10℃。
9.权利要求1的方法，其中使所述结晶批料溶液结晶至多12小时。
10.权利要求1的方法，其中使所述结晶批料溶液结晶至多24小时。
11.权利要求1的方法，其中使所述结晶批料溶液结晶至少24小时。
12.权利要求1的方法，其中通过过滤完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
13.权利要求1的方法，其中通过离心完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
14.权利要求1的方法，其中通过重力完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
15.权利要求1的方法，其中通过干燥完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
17.权利要求1的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
18.权利要求1的方法，其中所述第二磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
19.权利要求1的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
20.权利要求1的方法，其中将来自白蛋白晶体的第一次分离的所述溶解的晶体悬浮液冷却至至多10℃的温度。
21.权利要求20的方法，其中将从所述溶解的晶体悬浮液中沉淀出来的白蛋白晶体再溶解成溶液并且重结晶至少一次。
22.权利要求1的方法，其中预先将所述含白蛋白的流体澄清以去除杂质不在溶液中。
23.权利要求1的方法，其中所述原料流是来自转基因哺乳动物的乳汁或其它体液。
24.权利要求23的方法，其中将来自转基因哺乳动物的乳汁澄清以去除杂质和一些乳汁蛋白质。
25.权利要求23的方法，其中在给定原料流中纯度的水平是至少10％，也就是，其中人白蛋白构成给定溶液总蛋白质的至少10％。
26.权利要求1的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是5.6-7.8。
27.权利要求1的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是6.0-6.5。
28.权利要求1的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是7.0-7.8。
29权利要求1的方法，其中所述第一磷酸盐混合物的浓度具有2.2-3.0M范围内的浓度。
30.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-400克范围内的白蛋白浓度。
31.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-300克范围内的白蛋白浓度。
32.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-100克范围内的白蛋白浓度。
33.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-40克范围内的白蛋白浓度。
34.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-10克范围内的白蛋白浓度。
35.权利要求1的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物制剂中的赋形剂。
36.权利要求1的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物组合物中的治疗剂。
37.权利要求1的方法，其中所述原料流是来源自表达重组人白蛋白的宿主的培养上清液或体液。
38.权利要求37的方法，其中所述宿主是哺乳动物细胞培养物。
39.权利要求37的方法，其中所述宿主是酵母细胞培养物。
40.权利要求37的方法，其中所述宿主是昆虫细胞培养物。
41.权利要求37的方法，其中所述宿主是原核细胞培养物。
42.权利要求1的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用于治疗医学疾病。
43.权利要求42的方法，其中所述医学疾病选自a)水肿；b)低血容量症；c)血清蛋白减少；d)成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；e)肾变病；f)新生儿溶血性疾病(HDN)；g)严重烧伤；h)低蛋白血症；和i)急性胰腺炎。
44.权利要求1的方法，其中在心肺分流外科手术期间使用所述结晶人白蛋白产品。
45.一种生产结晶人白蛋白的方法，该方法包括a)浓缩含白蛋白的流体，直到所述流体具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流体中添加第一磷酸盐混合物，直到所述磷酸盐混合物的浓度在2.4-2.6摩尔的范围内；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次过滤以致形成所得的结晶批料溶液以去除杂质；d)冷却所述结晶批料溶液的滤液至至多15℃的温度；e)使所述结晶批料溶液中的人白蛋白结晶；f)向所述结晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸盐混合物，足以达到至多3.0摩尔的浓度；g)从任何剩下流体中进行白蛋白晶体的第一次分离；h)将来自所述第一次白蛋白晶体分离的白蛋白晶体悬浮在第二磷酸盐混合物中，其中所述第二磷酸盐混合物具有2.7-3.0M的浓度；i)加热来自第一次白蛋白晶体分离的晶体悬浮液直到温度在40-50℃的范围内以溶解晶体；j)对来自所述白蛋白晶体的第一次分离的溶解的晶体悬浮液提供第二次过滤；k)冷却来自所述白蛋白晶体的第一次分离的所得到的溶解的晶体悬浮液；和l)使白蛋白晶体从所得到的冷却的晶体悬浮液中形成；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的含有人白蛋白的原料流中纯化和结晶。
46.权利要求45的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
47.权利要求45的方法，其中所述第一磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
48.权利要求45的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
49.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有在一升溶液中15-50克范围内白蛋白的浓度。
50.权利要求45的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物的温度在20-30℃的范围内。
51.权利要求45的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物具有6.0-6.7范围内的pH。
52.权利要求45的方法，其中将过滤所述结晶批料后收集的所述滤液的温度冷却至至多10℃。
53.权利要求45的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多12小时。
54.权利要求45的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多24小时。
55.权利要求45的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至少24小时。
56.权利要求45的方法，其中通过过滤完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
57.权利要求45的方法，其中通过离心完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
58.权利要求45的方法，其中通过重力完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
59.权利要求45的方法，其中通过干燥完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
60.权利要求45的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
61.权利要求45的方法，其中所述第二磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
62.权利要求45的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
63.权利要求45的方法，其中将来自白蛋白晶体的所述第一次分离的所述溶解的晶体悬浮液冷却至至多10℃的温度。
64.权利要求63的方法，其中将从所述溶解的晶体悬浮液中沉淀出来的白蛋白晶体再溶解成溶液并且重结晶至少一次。
65.权利要求45的方法，其中预先将所述含白蛋白的流体澄清以去除杂质不在溶液中。
66.权利要求45的方法，其中所述原料流是来自转基因哺乳动物的乳汁或其它体液。
67.权利要求66的方法，其中将来自转基因哺乳动物的乳汁澄清以去除杂质和一些乳汁蛋白质。
68.权利要求66的方法，其中在给定原料流中纯度的水平是至少10％，也就是，其中人白蛋白构成给定溶液总蛋白质的至少10％。
69.权利要求45的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是5.6-7.8。
70.权利要求45的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是6.0-6.5。
71.权利要求45的方法，其中所述得到的结晶批料溶液的pH是7.0-7.8。
72权利要求45的方法，其中所述第一磷酸盐混合物的浓度具有2.2-3.0M范围内的浓度。
73.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-400克范围内的白蛋白浓度。
74.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-300克范围内的白蛋白浓度。
75.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-100克范围内的白蛋白浓度。
76.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-40克范围内的白蛋白浓度。
77.权利要求45的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-10克范围内的白蛋白浓度。
78.权利要求45的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物制剂中的赋形剂。
79.权利要求45的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物组合物中的治疗剂。
80.权利要求45的方法，其中所述原料流是来源自表达重组人白蛋白的宿主的培养上清液或体液。
81.权利要求80的方法，其中所述宿主是哺乳动物细胞。
82.权利要求80的方法，其中所述宿主是酵母细胞。
83.权利要求80的方法，其中所述宿主是昆虫细胞。
84.权利要求80的方法，其中所述宿主是原核细胞。
85.权利要求45的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用于治疗医学疾病。
86.权利要求85的方法，其中所述医学疾病选自a)水肿；b)低血容量症；c)血清蛋白减少；d)成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；e)肾变病；f)新生儿溶血性疾病(HDN)；g)严重烧伤；h)低蛋白血症；和i)急性胰腺炎。
87.权利要求85的方法，其中在心肺分流外科手术期间使用所述结晶人白蛋白产品。
88.一种人白蛋白产品，该产品包含至少一部份由如下方法形成的物质a)浓缩含白蛋白的流体，直到所述流体具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流体中添加第一磷酸盐混合物，直到所述磷酸盐混合物的浓度在2.6-3.0摩尔的范围内并且pH在6.1-6.3的范围内；c)冷却所述结晶批料溶液的所得滤液至至多15℃的温度；d)使所述结晶批料溶液中的人白蛋白结晶；和e)从任何剩下的流体中分离白蛋白晶体；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的含有人白蛋白的原料流中纯化和结晶。
89.权利要求88的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
90.权利要求88的方法，其中所述第一磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
91.权利要求88的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
92.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有在一升溶液中15-50克范围内白蛋白的浓度。
93.权利要求88的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物的温度在20-30℃的范围内。
94.权利要求88的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多12小时。
95.权利要求88的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多24小时。
96.权利要求88的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至少24小时。
97.权利要求88的方法，其中通过过滤完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
98.权利要求88的方法，其中通过离心完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
99.权利要求88的方法，其中通过重力完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
100.权利要求88的方法，其中通过干燥完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
101.权利要求88的方法，其中将从所述溶解的晶体悬浮液中沉淀出来的白蛋白晶体再溶解成溶液并且重结晶至少一次。
102.权利要求88的方法，其中预先将来自所述原料流的所述含人白蛋白的流体澄清以去除杂质不在溶液中。
103.权利要求88的方法，其中所述原料流是来自转基因哺乳动物的乳汁或其它体液。
104.权利要求103的方法，其中将来自转基因哺乳动物的乳汁澄清以去除杂质和一些乳汁蛋白质。
105.权利要求103的方法，其中在给定原料流中纯度的水平是至少10％，也就是，其中人白蛋白构成给定溶液总蛋白质的至少10％。
106.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-400克范围内的白蛋白浓度。
107.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-300克范围内的白蛋白浓度。
108.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-100克范围内的白蛋白浓度。
109.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-40克范围内的白蛋白浓度。
110.权利要求88的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-10克范围内的白蛋白浓度。
111.权利要求88的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物制剂中的赋形剂。
112.权利要求88的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物组合物中的治疗剂。
113.权利要求88的方法，其中所述原料流是来源于表达重组人白蛋白的宿主的培养上清液或体液。
114.权利要求113的方法，其中所述宿主是哺乳动物细胞培养物。
115.权利要求113的方法，其中所述宿主是转基因哺乳动物。
116.权利要求113的方法，其中所述宿主是转基因鸟。
117.权利要求113的方法，其中所述宿主是转基因植物。
118.权利要求113的方法，其中所述宿主是酵母细胞培养物。
119.权利要求113的方法，其中所述宿主是昆虫细胞培养物。
120.权利要求113的方法，其中所述宿主是原核细胞培养物。
121.权利要求88的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用于治疗医学疾病。
122.权利要求121的方法，其中所述医学疾病选自a)水肿；b)低血容量；c)血清蛋白减少；d)成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；e)肾变病；f)新生儿溶血性疾病(HDN)；g)严重烧伤；h)低蛋白血症；和i)急性胰腺炎。
123.权利要求88的方法，其中在心肺分流外科手术期间使用所述结晶人白蛋白产品。
124.权利要求88的方法，其中通过一个或多个重结晶步骤进一步纯化所述白蛋白晶体，所述步骤包括a)将来自第一次白蛋白晶体分离的白蛋白晶体悬浮在第二磷酸盐混合物中，其中所述第二磷酸盐混合物具有2.7-3.0M的浓度并且6.1-6.3范围内的pH；b)加热来自第一次白蛋白晶体分离的晶体悬浮液直到温度在40-50℃的范围内以溶解晶体；c)对来自所述白蛋白晶体的第一次分离的溶解的晶体悬浮液提供第二次过滤；d)冷却来自所述白蛋白晶体的第一次分离的所得到的溶解的晶体悬浮液至至多15℃的温度；e)让白蛋白晶体从所得到的冷却的晶体悬浮液中形成；和f)从任何剩下流体中分离白蛋白晶体；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的原料流中纯化和结晶。
125.权利要求124的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
126.权利要求124的方法，其中所述第二磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
127.权利要求124的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
128.一种人白蛋白产品，该产品包含至少一部份由如下方法得到的物质a)浓缩含白蛋白的流体，直到所述流体具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流体中添加第一磷酸盐混合物，直到所述磷酸盐混合物的浓度为至多2.6摩尔并且pH在6.1-6.3的范围内；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次过滤以致形成所得的结晶批料溶液以去除杂质；d)冷却所述结晶批料溶液的所得滤液至至多15℃的温度；e)向所述结晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸盐混合物，足以达到至多3.0摩尔的浓度；f)让所述结晶批料溶液中的人白蛋白结晶；和g)从任何剩下流体分离白蛋白晶体；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的原料流中纯化和结晶。
129.权利要求128的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
130.权利要求128的方法，其中所述第一磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
131.权利要求128的方法，其中所述第一磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
132.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有在一升溶液中15-50克范围内白蛋白的浓度。
133.权利要求128的方法，其中在添加时所述第一磷酸盐混合物的温度在20-30℃的范围内。
134.权利要求128的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多12小时。
135.权利要求128的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至多24小时。
136.权利要求128的方法，其中允许所述结晶批料溶液结晶至少24小时。
137.权利要求128的方法，其中通过过滤完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
138.权利要求128的方法，其中通过离心完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
139.权利要求128的方法，其中通过重力完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
140.权利要求128的方法，其中通过干燥完成所述白蛋白晶体的第一次分离。
141.权利要求128的方法，其中将从所述溶解的晶体悬浮液中沉淀出来的白蛋白晶体再溶解成溶液并且重结晶至少一次。
142.权利要求128的方法，其中预先将来自所述原料流中的所述含人白蛋白的流体澄清以去除杂质不在溶液中。
143.权利要求128的方法，其中所述原料流是来自转基因哺乳动物的乳汁或其它体液。
144.权利要求103的方法，其中将来自转基因哺乳动物的乳汁澄清以去除杂质和一些乳汁蛋白质。
145.权利要求103的方法，其中在给定原料流中纯度的水平是至少10％，也就是，其中人白蛋白构成给定溶液总蛋白质的至少10％。
146.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-400克范围内的白蛋白浓度。
147.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-300克范围内的白蛋白浓度。
148.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-100克范围内的白蛋白浓度。
149.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液3-40克范围内的白蛋白浓度。
150.权利要求128的方法，其中所述含白蛋白的流体具有每升溶液2-10克范围内的白蛋白浓度。
151.权利要求128的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物制剂中的赋形剂。
152.权利要求128的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用作药物组合物中的治疗剂。
153.权利要求128的方法，其中所述原料流是来源自表达重组人白蛋白的宿主的培养上清液或体液。
154.权利要求153的方法，其中所述宿主是哺乳动物细胞培养物。
155.权利要求153的方法，其中所述宿主是转基因哺乳动物。
156.权利要求153的方法，其中所述宿主是转基因鸟。
157.权利要求153的方法，其中所述宿主是转基因植物。
158.权利要求153的方法，其中所述宿主是酵母细胞培养物。
159.权利要求153的方法，其中所述宿主是昆虫细胞培养物。
160.权利要求153的方法，其中所述宿主是原核细胞培养物。
161.权利要求128的方法，其中将所述结晶人白蛋白产品用于治疗医学疾病。
162.权利要求161的方法，其中所述医学疾病选自a)水肿；b)低血容量症；c)血清蛋白减少；d)成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；e)肾变病；f)新生儿溶血性疾病(HDN)；g)严重烧伤；h)低蛋白血症；和i)急性胰腺炎。
163.权利要求128的方法，其中在心肺分流外科手术期间使用所述结晶人白蛋白产品。
164.权利要求128的方法，其中通过一个或多个重结晶步骤进一步纯化所述白蛋白晶体，所述步骤包括g)将来自第一次白蛋白晶体分离的白蛋白晶体悬浮在第二磷酸盐混合物中，其中所述第二磷酸盐混合物具有2.7-3.0M的浓度并且6.1-6.3范围内的pH；h)加热来自第一次白蛋白晶体分离的晶体悬浮液直到温度在40-50℃的范围内以溶解晶体；i)对来自所述白蛋白晶体的第一次分离的溶解的晶体悬浮液提供第二次过滤；j)冷却来自所述白蛋白晶体的第一次分离的所得到的溶解的晶体悬浮液至至多15℃的温度；k)让白蛋白晶体从所得到的冷却的晶体悬浮液中形成；和l)从任何剩下流体中分离白蛋白晶体；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的原料流中纯化和结晶。
165.权利要求164的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由磷酸钠盐组成。
166.权利要求164的方法，其中所述第二磷酸盐混合物是磷酸钾盐。
167.权利要求164的方法，其中所述第二磷酸盐混合物由钠盐和钾盐组成。
168.权利要求1的方法，其中所述含白蛋白的原料流含有与溶解的人血清白蛋白产品结合的化合物，所述化合物选自a)辛酸盐；b)脂肪酸；和c)长链醇。
169.权利要求1的方法，其中将所述人白蛋白产品纯化至浓缩物，所述浓缩物为各种状态中的一种，所述条件为选自a)结晶；b)凝胶；c)沉淀；和。d)小滴。
170.权利要求88的方法，其中所述含人白蛋白的原料流含有与溶解的人血清白蛋白产品结合的化合物，所述化合物选自a)辛酸盐；b)脂肪酸；和c)长链醇。
171.权利要求88的方法，其中将所述人白蛋白产品纯化至浓缩物，所述浓缩物为各种状态中的一种，所述条件为选自a)结晶；b)凝胶；c)沉淀；和。d)小滴。
172.权利要求128的方法，其中所述含人白蛋白的原料流含有与溶解的人血清白蛋白产品结合的化合物，所述化合物选自a)辛酸盐；b)脂肪酸；和c)长链醇。
173.权利要求128的方法，其中将所述人白蛋白产品纯化至浓缩物，所述浓缩物为各种状态中的一种，所述条件为选自a)结晶；b)凝胶；c)沉淀；和。d)小滴。
174.一种生产结晶人白蛋白的方法，该方法包括a)浓缩含白蛋白流体，直到所述流体具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流体中添加足够量的第一化学修饰剂；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次过滤以致形成所得的结晶批料溶液以去除杂质；d)冷却所述结晶批料溶液的所得滤液至至多20℃的温度；e)让所述结晶批料溶液中的人白蛋白结晶；f)向所述结晶批料溶液中添加更多的所述第一化学修饰剂，足以达到至多3.0摩尔的浓度；g)从任何剩下流体中进行白蛋白晶体的第一次分离；h)将来自第一次白蛋白晶体分离的白蛋白晶体悬浮在第二化学修饰剂中；i)加热来自第一次白蛋白晶体分离的晶体悬浮液直到温度在40-50℃的范围内以溶解晶体；j)对来自所述白蛋白晶体的第一次分离的溶解的晶体悬浮液提供第二次过滤；k)冷却来自所述白蛋白晶体的第一次分离的所得到的溶解的晶体悬浮液至至多15℃的温度；和l)让白蛋白晶体从所得到的冷却的晶体悬浮液中形成；其中这些特定步骤的应用允许人白蛋白从给定的含有人白蛋白的原料流中纯化和结晶。
175.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是聚乙二醇并且所述第二化学修饰剂是癸醇。
176.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是(NH4)2SO4并且所述第二化学修饰剂是癸醇。
177.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是聚乙二醇并且所述第二化学修饰剂是辛酸。
178.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是(NH4)2SO4并且所述第二化学修饰剂是辛酸。
179.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是2-丙醇并且所述第二化学修饰剂是MgCl2。
180.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是苄醇并且所述第二化学修饰剂是MgCl2。
181.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是氯化钾并且所述第二化学修饰剂是氯化钾。
182.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是聚乙二醇并且所述第二化学修饰剂是乙酸铵。
183.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是聚乙二醇并且所述第二化学修饰剂是聚乙二醇。
184.权利要求174的方法，其中所述第一化学修饰剂是聚乙二醇并且所述第二化学修饰剂是2-丙醇。
全文摘要
本发明涉及通过结晶和重复的结晶从各种来源纯化和生产人白蛋白。本发明方法的基本特征包括提供特定的反应条件和沉淀试剂以使白蛋白结晶最大化。利用溶解度图作为本发明方法的过程控制的基础。本发明特别地控制磷酸盐浓度、pH和温度以精确指导结晶动力学和晶体产率。
文档编号A23J1/00GK1732185SQ200380107863
公开日2006年2月8日 申请日期2003年10月28日 优先权日2002年11月19日
发明者K·维苏里, S·尤奥迪拉, S·P·弗尔顿, D·E·考托 申请人:陶洛斯Hsa有限责任公司