专利名称：一种培养超高细胞浓度光合细菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种培养超高细胞浓度光合细菌的方法，涉及光合细菌培养基中支持光合细菌稳定生长的一种含碳有机物组成成分。
背景技术：
光合细菌(Photosynthetic Bacteria)是一大类能在厌氧光照条件下进行不产氧光合作用的原核生物的总称，属于革兰阴性菌，分为红螺菌科(Rhodospirillaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、绿菌科(Chlorobiaceae)和绿色丝状菌科(Chloroflexaceae)4个科，菌细胞主要分为杆状和球形2种不同形态，是地球生命起源的先锋物种之一。其中红假单胞菌(Rhodopseudomonas)和紫色无硫菌(Rhodospirillaceae)是产业化生产较多的光合细菌种类。光合细菌的蛋白质含量高达60％以上，同时富含可以作为细胞代谢激活剂和天然抗氧化剂的辅酶Q10(泛醌)及具有抗癌作用的类胡萝卜素，具有重要的营养和药用价值。目前，光合细菌在作为畜禽饲料添加剂促进动物生长、处理高浓度有机废水、水产养殖水质的净化和农业高效活性菌肥等方面都发挥了越来越重要的作用。
国内外研究现状显示，目前光合细菌主要有动态和静置2种培养方式，培养装置有开放和密闭2种类型。国外有采用透光的密闭式光生物反应器动态连续培养光合细菌的报道，但在国内多采用玻璃缸和塑料桶在光照下静置密闭培养。动态密闭培养一般在透光的反应器内进行，为了保持培养物能够得到充分的光照，通过泵使光合细菌液体培养物流过螺旋透光的玻璃管。对于静置封闭培养光合细菌的规模生产工艺一般分为四级培养，分别是一级试管种的转接和纯化；二级锥形瓶培养，培养体积1～5升；三级扩大培养，培养体积25～50升；四级扩大培养，培养体积为100～1500升。
对于光合细菌的培养基，一般包含了含碳、氮和磷等化合物，因为碳一般占光合细菌干重的50％左右，因此培养基组成中含碳化合物的选择与确定在光合细菌培养中占有非常重要的地位。目前在国内外光合细菌培养中，一般采用乙酸钠作为光合细菌培养的主要有机碳源。尽管乙酸钠可以作为光合细菌生长的较好碳源，可以支持光合细菌的快速生长，但随着光合细菌对乙酸钠的利用，必然使培养物的pH急剧上升，而过高的pH会明显抑制光合细菌的持续生长，从而导致我国企业生产的光合细菌细胞浓度一般仅维持在30亿/毫升左右，是限制光合细菌达到快速可持续生长的一个重要原因。因此研究确定既可以支持光合细菌快速生长，同时又能够保持培养物pH稳定的有机碳化合物，是超高细胞浓度光合细菌生产的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养超高细胞浓度光合细菌的方法，有效提高培养物中的光合细菌浓度，提高光合细菌产品的质量。
本发明在常规光合细菌培养基中采用乙醇作为光合细菌生长唯一有机碳源；并将乙醇在液体培养基中的浓度控制1.0克/升(g/L)～10.0克/升范围内。用乙醇替代乙酸钠等含碳有机物作为支持光合细菌生长的唯一碳源，不仅增加了培养物中的光合细菌浓度，而且提高光合细菌产品的质量。
如果乙醇按1.0g/L添加于培养基中，由于乙醇添加量较少，会导致光合细菌碳源供给量的不足，因此使光合细菌的生长受到影响。当乙醇添加量增加到10.0g/L，由于乙醇本身可以作为灭菌剂，对光合细菌的生长也产生抑制效应。实验显示，在光合细菌液体培养基中添加2.0g/L到5.0g/L时，是促进光合细菌生长的优化控制方法。
本发明在光合细菌培养基中研究确定一种能够支持光合细菌快速持续生长的有机碳化合物作为培养光合细菌的唯一有机碳源。一方面可以支持光合细菌的持续生长，另外还可以使培养物pH的过度升高得到缓解。
本发明的工作原理是在厌氧条件下，光合细菌对乙醇的利用途径是首先将乙醇转变为乙醛，然后将乙醛转化为乙酸后再进行进一步利用，因此当光合细菌利用乙醇作为碳源时一般来说不会导致pH发生的很大变化。但是当采用乙酸钠作为光合细菌生长的碳源时，虽然乙酸钠中的碳能够被利用，当没有被利用的钠离子必然消耗阴离子使氢离子浓度升高，也就是导致培养物的pH升高。
因为光合细菌在利用乙醇作为碳源时要经过转化为乙酸后才能被进一步利用，因此使光合细菌的初期生长速度低于采用乙酸钠作为碳源时的生长速度(图1)，但是由于在利用乙酸钠作为碳源过程中会导致钠离子的产生，使氢离子浓度升高，因此导致培养物pH的快速升高，这样就使光合细菌的持续生长受到抑制。而用乙醇作为碳源时，因培养物pH的升高幅度不大，没有明显影响光合细菌持续生长，因此使最终的光合细菌浓度有较大幅度的提高。另外，乙醇的碳含量为52％，而乙酸钠的碳含量仅为29％，因此在加入同样重量的乙酸钠和乙醇时，乙醇可以为光合细菌提供更多的碳源，这也是乙醇能够促进高细胞浓度光合细菌生产的一个重要原因。
本发明的优点在于既能够使光合细菌持续生长，最终达到较高的细胞浓度，同时又可以在一定程度上缓解因培养物pH升高过快而对光合细菌生长产生的抑制作用。促进了工业化生产出超高细胞浓度光合细菌液。
图1是本发明乙醇(3.0g/L)和乙酸钠(3.0g/L)分别作为有机碳源对光合细菌生长的效应的示意图。其中，横坐标为时间，单位天；纵坐标为光合细菌生长的光密度值(OD550nm)。由图中显示出当乙酸钠作为主要有机碳源时可以使光合细菌的生长延迟期缩短，在实验前3天内，光合细菌的生长量(OD550nm)一直高于采用乙醇作为主要有机碳源时的光合细菌生长量。但是随着时间的延长，采用乙酸钠作为碳源时，光合细菌的生长速度在实验第3天以后明显降低，在实验第5天培养物的OD550nm为4.50。与之相反，当采用乙醇为碳源时，在实验第3天以后，光合细菌仍然维持很高的生长速度，在实验第4天时光合细菌浓度超过了采用乙酸钠作为碳源时的光合细菌浓度，在实验结束的第5天培养物OD550nm达到了5.65，使光合细菌浓度提高了25.6％。
图2是本发明乙醇(3.0g/L)和乙酸钠(3.0g/L)分别作为有机碳源时培养物pH的变化示意图。其中，横坐标为时间，单位天；纵坐标为pH。由图中显示出当光合细菌培养物的初始pH都在6.9时，无论是乙酸钠还是乙醇作为碳源，pH均随着实验时间的延长而迅速升高，当乙酸钠作为碳源时，在实验第3天培养物pH已升高到9.25，如此高的pH必然会对光合细菌的生长产生强烈的抑制作用，因此导致3天以后的光合细菌生长基本处于非常缓慢的状态。当采用乙醇作为碳源时，虽然培养物中的pH也会有所升高，但是升高的幅度远远低于采用乙酸钠作为碳源时的升高幅度，在实验结束的第5天，培养物pH仅增加到9.1，没有明显抑制光合细菌的生长。
图1和图2的研究结果表明，虽然乙酸钠作为有机碳源时可以使光合细菌的初始生长速度较快，但因光合细菌对乙酸钠的利用导致培养物的pH快速升高而使光合细菌的快速生长受到抑制。但采用乙醇作为碳源时，可以使光合细菌能够持续稳定地生长，同时培养物pH的升高幅度较小，没有对光合细菌的生长产生明显的抑制效应。与乙酸钠作为碳源相比，当乙醇作为碳源时，可以使光合细菌的浓度提高了25.6％，这在光合细菌的产业化生产上具有非常重要的意义。
具体实施例方式
首先配制光合细菌的基础培养基，其组成为(g/L)NH4Cl 1.0，KH2PO40.5，MgSO47H2O 0.2，NaCl 2.0，酵母粉0.5，微量元素液1.0ml/L。微量元素液包括(mg/L)FeCl36H2O 5.0，CuSO45H2O 0.05，H3BO31.0，MnCl24H2O 0.05，ZnSO47H2O 1.0，CoCl26H2O 0.5。分别用去离子水配制微量元素液和光合细菌培养基后，将配制好的光合细菌培养基放入500ml玻璃瓶内在124℃下进行高温高压灭菌20分钟，待培养基冷却至室温后在洁净工作台无菌条件下加入1.9ml无水乙醇，使乙醇浓度达到3.0g/L，同时在同样培养基中加入3.0g/L乙酸钠而不加入乙醇为对照，研究确定乙酸钠和乙醇分别作为主要有机碳源对光合细菌生长的效应。将接种光合细菌后的培养物放入培养箱中，在温度30℃，白炽灯光照强度3000lux下进行连续光照培养，经过5天的培养后结果见图1和图2。说明乙醇作为有机碳源时与乙酸钠作为有机碳源时相比，一方面可以使光合细菌能够持续稳定的生长，另外可以使光合细菌的细胞浓度达到45亿/ml以上，提高了25.6％光合细菌生物量。
权利要求
1.一种培养超高细胞浓度光合细菌的方法，其特征在于在常规光合细菌培养基中采用乙醇作为光合细菌生长唯一有机碳源；并将乙醇在液体培养基中的浓度控制在1.0克/升～10.0克/升范围内。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于将乙醇在液体培养基中的浓度控制在2.0克/升～5.0克/升范围内。
全文摘要
本发明提供了一种培养超高细胞浓度光合细菌的方法。其特征在于在常规光合细菌培养基中采用乙醇作为光合细菌生长唯一有机碳源；并将乙醇在液体培养基中的浓度控制在1.0克/升～10.0克/升范围内。本发明的优点在于既能够使光合细菌持续生长，最终达到较高的细胞浓度，同时又可以在一定程度上缓解因培养物pH升高过快而对光合细菌生长产生的抑制作用。促进了工业化生产出超高细胞浓度光合细菌液。
文档编号C12N1/20GK1609190SQ20041000980
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月16日 优先权日2004年11月16日
发明者闫海, 何红胜, 魏玉霞, 周洁, 弓爱君, 吕乐 申请人:北京科技大学