专利名称：一种单管嵌套式等位专一聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种检测等位专一变异的聚合酶链式反应的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，它占人类可遗传的各种多态性的90％以上。据估计人类基因组中平均每500～1000个碱基对中就存在一个SNP，在总共32亿碱基对中SNP的总数高达几百万，与疾病的成因和药物的反应等有直接的或间接的关系，SNP将对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。
检测单核苷酸多态性的技术很多(Kwok，P.Y.ed，Single NucleotidePolymorphisms method and protocol，Humana Press，2003)可分为几大类但每类方法均存在各种缺点和局限。各类方法中等位专一PCR(AC-PCR)方法最简单又灵敏，但是现行AC-PCR方法的野生引物与等位专一突变模板往往也能退火而导致假阳性，反之亦然。这使现行的各种AC-PCR方法可信度较低。另一类方法是在一轮PGR扩增后用各种物理、化学和分子生物学方法对扩增产物进行分析，包括传统的方法如DNA测序、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)分析，和新近发展的方法如质谱法、微测序法、化学裂解法、变性高效液相层析法等。这些方法存在扩增产物污染、速度慢、程序复杂、难自动化、成本高和需专门设备等问题均未被广泛采用。第三类方法涉及寡核苷酸杂交，包括基于连接酶的方法、DNA微阵列方法和Invader Assay方法等，这些方法尚处于实验室摸索阶段未被临床广泛推广使用。九十年代中崛起的实时荧光定量PCR方法在实现闭管检测和量化方面迈出了一大步，也有应用于SNP检测的报导。但是用基于荧光绿I的实时方法来检测SNP，存在与现行等位专一PCR方法同样的假阳性问题。而用基于分子信标(发夹式探针)和5’核酸酶(TaqMan)的实时方法来检测SNP则需要设计带各种荧光基团的探针，同时必须配备昂贵的实时荧光定量仪。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明就是提供一种单管嵌套式等位专一聚合酶链式反应方法，以克服上述各种检测SNP方法扩增产物污染、速度慢、程序复杂、难自动化、成本高和需专门设备等缺点和局限，发展一种既简单、灵敏、快速和经济又准确的方法。
发明构思现行等位专一PCR方法所用的一对引物长均为18-30碱基，而且除针对等位专一突变碱基之外引物顺序与模板完全匹配。这种情况下虽然引物与匹配模板的结合强度非常高能顺利完成扩增，但引物与等位专一突变模板的结合强度仍相当高，在非严谨的条件下与模板能发生退火完成扩增造成假阳性。本发明针对这一原因，采用超短等位专一引物或在等位专一引物上导入若干错配，使野生引物与匹配模板的结合仍达到完成扩增所需要的强度，而野生引物与等位专一突变模板的结合强度则低于发生退火所需的阈值。为了克服超短引物和含错配碱基引物的非专一扩增问题，本发明提供了从复杂基因组如人基因组DNA富集目标模板，并能用单个反应管来完成整个扩增过程的方法。当等位专一突变发生于简单模板如质粒或噬菌体基因组上，超短等位专一引物或含错配碱基等位专一引物方法可直接应用。当SNP出现在基因的外显子上，等位专一突变将被拷贝在相应的RNA和cDNA上，本发明同样适用于以cDNA为模板检测SNP的方法。本发明方案也适用基于SYBR绿I的实时荧光检测单核苷酸多态性方法减少其假阳性。
以下用一些具体数据来说明本发明的原理。应用专业引物设计软件Oligo6.0(由Molecular Biology Insights，Inc.出品)。在人肌动球蛋白基因中随机选择7个3’端相同的寡核苷酸，对其解链温度和与模板结合强度进行计算，结果表明引物越短引物在3’端碱基错配对引物解链温度的影响越大，使引物与模板的结合强度的相对降低也越大(表1和表2)，说明引物区分匹配模板和等位专一突变模板的能力就越强。
表1.一个碱基错配对引物解链温度的影响
表2.18-30碱基长引物与模板结合强度的统计结果
标准PCR和现行的等位专一PCR的引物长度范围为18-30碱基，野生(突变)引物与野生模板(等位专一突变模板)结合强度平均值范围为452-598，显著高于非常高严谨性引物所需要的结合强度360点(表2和3)。但是，野生(突变)引物与等位专一突变模板(野生模板)结合强度平均值范围为220-308，均超过了非常低严谨性引物的最大允许假性结合强度，其中有些达到非常高严谨性引物所要求的结合强度，如此高的结合强度必将导致假阳性。
表3.专业引物设计软件Oilgo6.0设定的引物严谨性标准
如果将等位专一PCR的引物降低至6-15碱基，则野生(突变)引物与野生模板(等位专一突变模板)结合强度平均值范围为174-408(表4)，所测试的寡核苷酸中多数达到中等严谨性引物的标准，其中一部份达到了非常高严谨性引物所需要的结合强度能完成退火。而野生(突变)引物与等位专一突变模板(野生模板)结合强度平均值范围降至64-184，多数已低于非常高严谨性引物所允许的假性结合强度160点不会发生退火(见表2和4)表4.6-15碱基长引物与模板结合强度的统计结果
在引物中导入若干错配同样可以调节引物与匹配及等位专一模板的结合强度使之符合检测SNP的需要。表5为在人肌动球蛋白基因中随机选择一个15个碱基寡核苷酸ATATCGCCGCGCTCG(5’至3’)，用Oligo6.0计算的结果。该引物与匹配模板的结合强度为505点，远高于非常高严谨性引物所需的360点，但3’碱基发生G与C转换后与模板结合强度仍有216点。若将引物的第7位的G换成C则引物与匹配模板结合强度为316点，达到中等严谨性引物的要求，而引物与等位专一突变模板的结合强度降为123点，不再会发生退火干扰检测。表5中的第二竖项表示针对等位专一突变的碱基在野生引物中不同位置时野生引物与等位专一突变模板的结合强度。其他数据为在野生引物的其他位置再导入一个错配碱基后野生引物与等位专一突变模板的结合强度。当引物长为18-30碱基时在引物的不同位置导入二个或更多的错配碱基可以达到同样目的。
表5.错配碱基对引物与模板结合强度的影响
技术方案本发明提供一种单管嵌套式等位专一聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用外套引物扩增10-30循环；(2)用内套引物扩增10-30循环；其中，外套引物是与模板严谨配对的引物，内套引物之一是长度为6-14碱基的超短引物或含1-30个错配碱基的错配引物。
上述的利用超短引物进行的等位专一聚合酶链式反应方法的一种优选方案为超短引物的长度为8-12碱基。
上述的利用超短引物进的等位专一聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为超短引物的等位专一突变设计于引物3’端数起的第1-6位，同时在引物中引进0-6个错配碱基，优选引进0-2个错配碱基。
上述的利用错配引物进行的等位专一聚合酶链式反应方法的一种优选方案为错配引物长15-50碱基，优选长15-30个碱基，等位专一突变设计于引物3’端数起的第1-6位，同时在引物中引进1-30个错配碱基，优选引进2-10个错配碱基，错配碱基可集中或分散，优选每间隔5-8个碱基引进一个错配碱基。
上述的利用超短或错配引物进行的等位专一聚合酶链式反应方法的一种优选方案为超短或错配引物与匹配模板的结合强度大于250点，优选大于300点，而与等位专一突变模板的结合强度小于160点，优选小于120点。
上述的等位专一聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为外套引物的扩增产物的解链温度比内套引物的扩增产物的解链温度高2-10℃，且PCR反应步骤依此为(1)用高于内套引物最高允许退火温度以上的退火温度扩增10-30循环；(2)控制退火温度在内套引物的解链温度以下，并且控制变性温度为低于外套扩增产物的变性温度而高于内套扩增产物的解链温度，继续扩增10-30循环。
并且，在第一阶段外套和和第二阶段内套反应之间有2-3个循环的过渡阶段，该阶段变性温度与第一阶段相同，而退火温度与第二阶段相同。
上述的等位专一聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为设计三重嵌套式引物并将超短引物作为最内套的引物。
本发明用单管嵌套式PCR完成SNP的检测，外套引物为高严谨性引物用以富集目标基因模板。用于等位专一扩增的内套引物之一为超短引物或含错配碱基引物。为克服超短引物和错配引物等位专一PCR的非专一扩增问题，在等位专一PCR扩增产物的外围设计一对外套引物，外套引物扩增产物变性温度比作为内套的等位专一扩增产物解链温度高2℃以上，优选高3℃以上；控制外套PCR反应变性温度比外套扩增产物解链温度高2℃以上，控制内套PCR反应变性温度介于外套扩增产物和内套扩增产物之间。同时设计内套引物的最高允许退火温度比外套反应的实际控制退火温度低2℃以上，优选低3℃以上。控制外套反应退火温度高于内套引物最高允许温度；控制内套反应退火温度适合内套反应。在第一阶段外套和和第二阶段内套反应之间有2-3个循环的过渡阶段，该阶段变性温度与第一阶段相同，而退火温度与第二阶段相同。
有益效果1.与现行的各种非等位专一PCR检测单核苷酸多态性方法相比，本发明方法简单、灵敏、经济、快速。既不需要针对模板设计荧光探针，也没有复杂费时的PCR后过程，更不需要昂贵的检测设备。
2.与现行的各种等位专一PCR方法相比，本发明假阳性低，可信度高。
3.等位专一错配碱基可定位在引物的3’端碱基，也可定位在近3’端的其他碱基，使引物对设计和选择有较大的空间。
4.在等位专一引物内引进错配，不仅减少检测假阳性，也有更多机会选择到发夹结构低和引物3’端碱基互补低的引物，有利于克服引物二聚物的形成。
具体实施例方式
实施例1实施例1以人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)为目标，假定等位专一突变发生在第1281碱基(由G改变为C)或第1356位碱基(由C改变为G)，引物顺序和特性示于表6。A1为外套富集模板用引物，A2和A3为内套等位专一PCR引物。A2的等位专一引物为正引物，引物3’端数起第三个碱基针对等位专一突变以粗黑体字表示；A3的等位专一引物为反引物，引物3’端碱基针对等位专一突变以粗黑体字表示。
表6.实施例1引物顺序和特性
*最邻近碱基法计算的解链温度外套引物“A1”的正反引物间不含内含子，扩增产物长295碱基，扩增产物解链温度84℃；内套引物“A2”扩增产物长114碱基，扩增产物解链温度78.4℃；内套引物“A3”扩增产物长179碱基，扩增产物解链温度79.7℃。
实施例1试验采用Clontech公司的Advantage-2试剂盒，每管反应体积5微升，正反引物各0.4μM，每100微升反应液加0.5微克人基因组DNA。PCR程序为初次变性94℃1分钟，前3个循环变性94℃10秒钟，退火和延伸72℃1分钟；中间17个循环变性88℃10秒钟，退火和延伸72℃1分钟；再三个循环变性88℃10秒钟，退火31-55℃30秒钟，延伸68℃30秒钟；最后14循环变性82℃10秒钟，退火31-55℃30秒钟，延伸68℃30秒钟。试验结果示于表7。
表7.实施例1试验结果
结果表明引物对A2正野/A2反和A3正/A3反野在31至50℃范围内均得到目标扩增产物，而A2正突/A2反和A3正/A3反突引物对在同样条件下没有目标扩增产物形成。
实施例2.
实施例2也以人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)为目标，假定等位专一突变发生在第1281碱基(由G改变为C)。外套富集模板用引物与实施例1相同。A4为内套等位专一PCR引物，引物长20碱基，等位专一引物为正引物，引物3’端数起第二个碱基针对等位专一突变以粗黑体字表示，在等位专一引物的3’端数起的第8位(由T改为A)和16位(由G改为C)引进二个错配碱基以下划线表示。引物顺序和特性见表8。
表8.实施例2引物顺序和特性
*最邻近碱基法计算的解链温度内套扩增产物长131碱基，解链温度79.2℃。按实施例1相同方法进行扩增。结果引物对A4正野/A4反在31至50℃范围内均得到目标扩增产物，而引物对A4正突/A4反在同样条件下没有目标扩增产物形成。
实施例3实施例3以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(美国国家生物信息中心基因库编号XM_006959)为目标。假定等位专一突变发生在第415碱基(由G改变为C)。引物顺序和特性示于表9。G1为外套富集模板用引物，G2为内套等位专一PCR引物，等位专一引物为正引物，引物3’端数起第5个碱基针对等位专一突变以粗黑体字表示。
表9.实施例3引物顺序和特性
*最邻近碱基法计算的解链温度外套引物“G1”的扩增产物长度616碱基，扩增产物解链温度90.4℃。内套引物“G2”扩增产物长度147碱基，扩增产物解链温度87.1℃。
实施例3的PCR模板为cDNA，用Clontech的反转录试剂盒由Oligo(dT)从人组织总RNA合成，每50微升PCR反应液加5微升cDNA。PCR方法与实施例1相同，PCR首次循环变性94℃1分钟，前20个循环变性94℃10秒钟。后15循环变性89℃10秒钟。PCR前20个循环退火和延伸72℃1分钟，后13个循环退火31-55℃30秒钟，延伸68℃30秒钟。中间二个循环变性94℃10秒钟，退火31-55℃30秒钟，延伸68℃30秒钟。试验结果示于表10。
表10.实施例3试验结果
结果表明引物对G2正野/G2反在31至45℃范围内均得到目标扩增产物，而引物对G2正突/G2反在同样条件下没有目标扩增产物形成。
权利要求
1.一种单管嵌套式等位专一聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用外套引物扩增10-30循环；(2)用内套引物扩增10-30循环；其特征在于外套引物是与模板严谨配对的引物，内套引物之一是长度为6-14碱基的超短引物或含1-30个错配碱基的错配引物。
2.根据权利要求1所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于超短引物的长度为8-12碱基。
3.根据权利要求1所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于超短引物的等位专一突变设计于引物3’端数起的第1-6位，同时在引物中引进0-6个错配碱基。
4.根据权利要求3所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于超短引物引进0-2个错配碱基。
5.根据权利要求1所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于错配引物长15-50碱基，等位专一突变设计于引物3’端数起的第1-6位，同时在引物中引进1-30个错配碱基，错配碱基可集中或分散。
6.根据权利要求5所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于错配引物长15-30个碱基，引物中引进2-10个错配碱基，且每间隔5-8个碱基引进一个错配碱基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于超短或错配引物与匹配模板的结合强度大于250点，而与等位专一突变模板的结合强度小于160点。
8.根据权利要求8所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于超短或错配引物与匹配模板的结合强度大于300点，而与等位专一突变模板的结合强度小于120点。
9.根据权利要求1所述的等位专一聚合酶链式反应方法，其特征在于外套引物的扩增产物的解链温度比内套引物的扩增产物的解链温度高2-10℃，且PCR反应步骤依此为(1)用高于内套引物最高允许退火温度以上的退火温度扩增10-30循环；(2)控制退火温度在内套引物的解链温度以下，并且控制变性温度为低于外套扩增产物的变性温度而高于内套扩增产物的解链温度，继续扩增10-30循环。并且，在第一阶段外套和和第二阶段内套反应之间有2-3个循环的过渡阶段，该阶段变性温度与第一阶段相同，而退火温度与第二阶段相同。
10.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于设计三重嵌套式引物并将超短引物作为最内套的引物。
全文摘要
本发明提供一种用超短引物或含若干错配碱基引物检测碱基突变的单管嵌套式聚合酶链式反应方法，即利用长度为6－14碱基的超短引物或含若干错配碱基通常长度引物进行等位专一扩增，使“野生型等位专一引物”完全失去与突变型模板结合的能力，使“突变型等位专一引物”完全失去与野生型模板结合的能力，从而克服检测的假阳性，改善检测的可靠性。适用于分子生物学实验室对单碱基突变的核酸检测和医学临床检测，特别是遗传性疾病、变异病毒感染、耐药性细菌感染和单碱基突变引起的代谢病的核酸分析。
文档编号C12P19/00GK1654671SQ20041001628
公开日2005年8月17日 申请日期2004年2月13日 优先权日2004年2月13日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧