专利名称：发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法
技术领域：
发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，属于生物酶制备技术领域。本发明涉及一种通过控制发酵过程中氧气在发酵液中的传递速度-体积溶氧系数KLa值，提高碱性果胶酶酶活的方法，获得高酶活的碱性果胶酶。
背景技术：
果胶酶(pectinases)是一类能分解植物组织中的果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶系，碱性果胶酶则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，PGL)。
目前，酸性果胶酶已广泛应用于果胶的提取和酒类的澄清中，而碱性果胶酶除在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外，特别已成为棉织物处理过程中至关重要的生物制剂。由于棉纤维中存在的天然杂质，在传统工艺中，一般使用高温强碱对棉织物进行处理，一方面棉纤维会因形成氧化纤维素而遭到损伤，棉纤维表面因去除了大量起润滑作用的蜡质而失去应有的手感，更为重要的是其将产生大量的工业废水，对环境所产生的负面影响，因此传统工艺已不再适应整个社会的发展。解决这一问题的方法就在于发展环境友好型染整工艺，即绿色染整工艺，其中应用生物技术是重要途径之一。
目前，欧洲倡导的3E系统(效能Efficient、经济Economy、生态Ecology)、3R生产机制(一次准确性Right first time、快速反应性Rapid responsible、重现Reproducibility)、4R原则(节省Reduction、回收Recovery、回用Reuse、循环Recycle)已成为世界纺织染整工业技术发展的主流，未来社会对纺织业的要求除了产品质量这个永恒不变的内容之外，更强调生态平衡和对环境的亲和性。目前，酶制剂的应用是绿色染整加工中最成熟也是最普及的技术。酶已在染整加工的多个工艺流程中发挥着重要作用，而其应用技术仍在不断提高，应用领域继续扩展。可以相信，随着绿色环保意识与要求的不断加强，在未来的纺织加工业中，酶必将有其更广阔的发展空间与更积极的发展前景。
自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来，至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶，但其中能应用于工业化生产的为数不多，仅Novo Nordisk公司曾在1999年研制出用基因工程改造菌种生产的品牌为‘BioPrep’的碱性果胶酶，随后于2003年又推出一种碱性果胶裂解酶ScourzymeL。但由于成本问题，至今没有得到广泛的应用。因此通过一定的方法来提高酶产量和降低生产成本是开发、应用碱性果胶酶的关键发明内容本发明的目的是提供一种发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，通过控制体积溶氧系数(KLa)来提高碱性果胶酶酶活，该法制得的碱性果胶酶活性高、成本低，同时发酵周期短、操作方法简便、易于工业化。制备的碱性果胶酶以聚半乳糖醛酸裂解酶为主要成分，可用于棉织物的精炼处理。
本发明的技术方案本发明从水果表皮中分离得到一株产碱性果胶酶菌株，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)WSHB04-02，已于2004年11月27日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM204082。
采用芽孢杆菌CCTCC NOM204082为出发菌株，经种子培养和7L发酵罐液体深层发酵制得碱性果胶酶，通过控制发酵液中的体积溶氧系数KLa，，KLa为200h-1-500h-1，获得高酶活的碱性果胶酶。其发酵过程为种子培养取1ml-70℃冷藏的菌悬液，接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中进行种子培养；7L罐发酵按照8％的接种量接入发酵培养基中，在7L发酵罐中进行发酵培养。
种子培养基(g/L)玉米浆30，蔗糖20，蛋白胨20，磷酸氢二钾18.4，磷酸二氢钾6，pH7.0；培养条件培养时间为10h～18h，温度30℃～40℃，摇瓶转速200rpm。
发酵培养基(g/L)玉米淀粉6～10，酵母膏8～12，蛋白胨6～10，磷酸氢二钾8～10，磷酸二氢钾2～4，pH7.0；发酵条件装液量3.5L～4.5L，接种量8％，发酵时间20h～30h，温度30℃～40℃，通气量3.5L/min～4.5L/min，KLa为200h-1～500h-1，以KLa为350h-1最好。
芽孢杆菌CCTCC NOM204082发酵所得碱性果胶酶的应用所制备的碱性果胶酶酶活达到40U/ml，可用于棉纺织品的精练处理。
在线参数测定pH、溶氧(DO)采用电极自动显示，DO为相对溶氧水平，即将培养基未接种时的饱和溶氧水平定为100％，饱和的亚硫酸钠溶液定为0％。
离线参数测定KLa-以溶液中氧浓度差为推动力的体积溶氧系数(h-1)在清水体系中用亚硫酸盐法测定菌体干重取一定量的发酵液，于10000r/min条件下离心5分钟，去上清液，将菌体置于105℃烘箱中烘至恒重，称重。
还原糖3，5-二硝基水杨酸钠(DNS)法，取一定量的发酵液，于10000r/min条件下离心5分钟，去沉淀，取去离子水稀释后的上清液2ml，向其中加入DNS试剂1.5ml，立即在沸水浴中加热反应5分钟，然后立即用流动冷水冷却至室温，再向其中加入蒸馏水21.5ml，混匀后在分光光度计520nm处测定其吸光度值。
碱性果胶酶(PGL)活性取一定量的发酵液，于10000r/min条件下离心5分钟，去沉淀，取去离子水稀释后的上清液20μl加入到2ml含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(pH9.4)，45℃反应15min，用3ml 0.03M的磷酸溶液终止酶反应，在分光光度计235nm处测定其吸光度值。
一个标准酶活单位(1U)定义为每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol不饱和半乳糖醛酸的酶量。采用不饱和半乳糖醛酸在235nm处的特征吸收来确定。
本发明的有益效果筛选得到了一种碱性果胶酶的高产菌，通过改变不同的搅拌转速，达到不同的体积溶氧系数，经液体深层发酵，从而制备得到高酶活的碱性果胶酶，酶活达到40U/ml(国内未见报道)；同时通过改变不同的搅拌转速，使得发酵周期大大缩短，从酶活和发酵周期两个方面同时节约了生产成本，操作方法简便，易于工业化，为工业化生产奠定了基础。发酵制备的碱性果胶酶可用于棉纺织品的精练处理，有效地改变现有传统的棉纺织品精练处理工艺，改善环境和棉纺织产品品质。
图1为碱性果胶酶发酵中体积溶氧系数KLa对酶活和发酵周期的影响生物材料样品保藏芽孢杆菌，保藏日期2004年11月27日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为NOM204082。
具体实施例方式
实施例1将1ml-70℃保藏的菌悬液接种到种子培养基中，种子培养基装液量为500ml的三角瓶装50ml种子培养基，经37℃，200rpm的回转式摇床培养14小时后，按照8％的接种量接种到7L发酵罐中，发酵培养基装液量为7L的发酵罐装4L发酵培养基。发酵条件为发酵温度37℃，通气量4L/min，以搅拌转速600rpm控制KLa为350h-1，发酵装置采用自动消泡体系。全过程采用定时取样的方法离线分析发酵液的各种参数，包括酶活、菌体干重以及还原糖的量等参数。在该条件下，其发酵周期为8小时，发酵最终酶活达到40U/ml，发酵过程见图1。
实施例2改变搅拌转速为500rpm控制KLa为200h-1，其余条件同实施例1，在此操作条件下，发酵周期为12小时，发酵最终酶活为39U/ml，发酵过程见图1。
实施例3改变搅拌转速为700rpm控制KLa为500h-1，其余条件同实施例1，在此操作条件下，发酵周期为12小时，发酵最终酶活为34U/ml，发酵过程见图1。
对比实施例4改变搅拌转速为400rpm控制KLa为100h-1，其余条件同实施例1，在此操作条件下，发酵周期为16-24小时，发酵最终酶活为30U/ml，发酵过程见图1。
权利要求
1.一种产碱性果胶酶菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WSHB04-02，保藏编号为CCTCC NOM204082。
2.在发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，其特征是通过控制发酵液中的体积溶氧系数KLa，获得高酶活的碱性果胶酶，KLa为200-h-1-500h-1，其发酵过程为发酵菌株芽孢杆菌CCTCC NOM204082；种子培养取1ml-70℃冷藏的菌悬液，接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中进行种子培养；7L罐发酵按照8％的接种量将种子液接入发酵培养基中，在7L发酵罐中进行发酵培养。
3.根据权利要求2所述的提高碱性果胶酶酶活的方法，其中的KLa为350h-1。
4.根据权利要求2所述的提高碱性果胶酶酶活的方法，其中的种子培养，种子培养基组成以g/L计玉米浆30，蔗糖20，蛋白胨20，磷酸氢二钾18.4，磷酸二氢钾6，pH7.0；培养条件培养时间为10h～18h，温度30℃～40℃，摇瓶转速200rpm。
5.根据权利要求2所述的提高碱性果胶酶酶活的方法，其中的发酵培养，发酵培养基组成以g/L计玉米淀粉6～10，酵母膏8～12，蛋白胨6～10，磷酸氢二钾8～10，磷酸二氢钾2～4，pH7.0；发酵条件装液量3.5L～4.5L，接种量8％，发酵时间20h～30h，温度30℃～40℃，通气量3.5L/min～4.5L/min，KLa200h-1～500h-1。
6.芽孢杆菌CCTCC NOM204082发酵所制备碱性果胶酶的应用，其特征是用于棉纺织品预处理的精练处理。
全文摘要
发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，属于生物酶制备技术领域。本发明通过控制氧气在发酵液中的传递速度体积溶氧系数(K
文档编号C12N1/20GK1648236SQ20041006580
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者陈坚, 张健红, 堵国成 申请人:江南大学