专利名称：由源于虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过进行诱导分化从而由源于哺乳类或鸟类的虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞。
背景技术：
近年来，神经干细胞在脑、脊髓中的存在已得到了证实，而且，有报告称ES(Embryonic Stem)细胞能够分化为特定的中枢神经系细胞，因此，人们对中枢神经系再生治疗的期待日渐高涨。另外，作为神经干细胞的分离和选择培养方法，已经确立了neurosphere法(浮游凝集块培养法)。此外，还有下述神经干细胞的诱导分化法，即，利用接触培养法来培养借助于上述浮游凝集块培养法形成神经干细胞的sphere(凝集块)，从而，将神经干细胞诱导分化为神经系细胞。
另外，有报告称，将源于脑、脊髓的神经干细胞或ES细胞移植到活体内，由此，该所移植的细胞就适应环境而分化为特异性的神经细胞(参照非专利文献1Nature 414、112-117，review 2001年)。
哺乳动物的网膜神经细胞一旦变性，将不能再生，并导致机能的降低。并且，如果因网膜变性疾患等而造成视细胞变性，则有可能导致失明。现在，对这种难症尚无有效的治疗方法。如果能够利用上述神经干细胞的诱导分化来生产网膜神经细胞，则将实现极为有效的再生治疗。
作为用于上述网膜神经细胞的诱导分化的神经干细胞，有人提出了使用毛样体上皮细胞和网膜色素上皮细胞的方案。网膜色素上皮细胞和毛样体上皮细胞均来源于神经板。网膜色素上皮细胞由作为网膜的最外侧的细胞层的受容器层所覆盖，该网膜由多个细胞层构成。毛样体上皮是存在于虹彩与网膜的中间位置的组织。
例如，在非专利文献2(Science 287、2032-2035页，2000年)中公开了下述方法，即，利用浮游凝集块培养法来培养毛样体上皮细胞并形成sphere(凝集块)，然后，使用接触培养法来培养该凝集块，从而对分化实施诱导。在非专利文献3(Biochem.And Biophys.Res.Commun.270、517-521页，2000年)中也揭示了能够由毛样体上皮细胞诱导分化网膜神经细胞的可能性。
此外，在非专利文献4(Brain Res.677(2)、300-310页，1995年)中，通过培养实验揭示出，虽然是胚胎期的有限的时间，哺乳动物的网膜色素上皮细胞具有向神经细胞分化转换的能力。在非专利文献5(DNA Cell Biol 12(8)、667-673页，1993年)中也揭示了能够由网膜色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞的可能性。
源于脑、脊髓的神经干细胞与ES细胞在再生治疗中的应用存在下述诸多问题，例如，因细胞移植带来的免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡问题等。如果能够将源于移植对象个体自身的细胞用作中枢神经系再生的材料，则自身移植将成为可能，而上述问题也能够得以解决。
但是，在应用于治疗时，由于很难获得患者本人的毛样体上皮细胞，所以，要想将毛样体上皮细胞用作中枢神经系再生的材料并非现实。
此外，在非专利文献4中，揭示出只有在各组织中存在较多相对未分化的细胞的哺乳类的胚胎期的有限的时间内的网膜色素上皮细胞才具有向神经细胞分化转换的能力。也就是说，在哺乳动物成体的各组织中极少存在相对未分化的细胞，网膜色素上皮细胞在成体中也已经高度分化，所以，难以对细胞实施分离、培养。因此，就现阶段而言，不能够将哺乳动物成体的网膜色素上皮细胞用作中枢神经系再生的材料。
另外，在非专利文献6(Biochem.and Biophys.Res Commun.297，177-184页，2002年)中揭示了由ES细胞生产网膜神经细胞的方法，但是，其效率极其低下。
鉴于上述情况，眼球的虹彩色素上皮细胞就成为可望用作中枢神经系再生的材料的细胞的一种。虹彩色素上皮细胞是构建虹彩的细胞的一种，而该虹彩是用于根据光量来开闭瞳孔从而对到达网膜的光量进行调节的组织。关于虹彩色素上皮细胞的发生起源，与网膜色素上皮细胞和毛样体上皮细胞同样地，其也来源于神经板。由于能够从患者本人身上采集其一部分的虹彩色素上皮细胞，所以，可将上述虹彩色素上皮细胞作为可自身移植的再生材料来进行有效的利用。
另外，虹彩色素上皮细胞的组织少，其细胞数量也较少，所以，难以对该虹彩色素上皮细胞进行分离培养。本申请发明人此前曾公开了成功地分离培养出鸡雏的虹彩色素上皮细胞的情况(参照非专利文献7(Experimental Cell Res.245，245-251页，1998年)。在该非专利文献7中，通过在一定培养条件下的实验，揭示出鸡雏的虹彩色素上皮细胞具有向晶体分化转换的能力。
进而，本申请发明人通过改变上述非专利文献7的方法，使得对哺乳动物(小鼠、大鼠、人胎儿)的虹彩细胞的分离培养成为可能(参照非专利文献8(Nature Neuroscience 4<12>，1163页，2001年)。
在上述非专利文献8中，在分离成体大鼠的虹彩组织并对其实施原代培养(Primary Culture)后，虽然确认了一部分细胞表达神经标记(Neural Marker)，但是，并未检测出特异性分化了的神经标记。为了得到网膜的视细胞，如果使所培养的虹彩细胞强制性表达用于暗示在视细胞的发育时期发挥重要作用的Crx基因，则可以确认所培养的虹彩细胞产生了感光功能所必需的视紫红质(Rhodopsin)蛋白质。
根据上述非专利文献8，仅仅在使得强制性表达作为特异性基因的Crx基因的情况下，才诱导其向视细胞分化。但是，如果考虑到在治疗中的应用，借助于基因的强制性表达而实施的诱导分化会带来损伤DNA等的风险，所以，并非理想的方案。
因此，就目前的现状而言，由源于虹彩组织的神经干细胞(虹彩色素上皮细胞)诱导分化网膜神经细胞，由此生产能够有效地用于再生治疗的网膜神经细胞的方法尚未被确立。
如上上述，由于能够从患者本人身上采集其一部分细胞，所以，如果能够得到由虹彩色素上皮细胞诱导分化的网膜神经细胞，利用患者自身的细胞的再生治疗就能得以实现。并且，可以期待将会给现今尚无有效治疗方法的网膜变性疾患的治疗方法的确立作出重要的贡献。
本发明是鉴于上述问题而进行开发的，目的是提供一种通过由具有能够有效地用于再生治疗的可能性的虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞而无需导入基因来生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞。
发明内容
本申请的发明人对上述课题进行潜心研究的结果，发现通过共同培养胚胎网膜干细胞及虹彩色素上皮细胞，或者，通过在培养基上对虹彩色素上皮细胞实施接触培养，无需导入基因就能诱导从虹彩色素上皮细胞向网膜神经细胞的分化，从而完成了本发明。
本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于共同培养胚胎网膜干细胞和虹彩色素上皮细胞，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。
根据本发明的网膜神经细胞的生产方法，通过共同培养胚胎网膜干细胞及虹彩色素上皮细胞，无需象现有技术(参照非专利文献8)那样地导入基因，就能进行向网膜神经细胞的诱导分化。因此，在将通过本发明的生产方法所得到的网膜神经细胞用作再生治疗的材料时，不会带来诸如损伤DNA等的危险，所以，具有可有效地用于再生治疗的可能性。
另外，关于上述虹彩色素上皮细胞，如上上述，可从患者本人身上采集其一部分细胞，因此，通过本发明的生产方法，可由源于患者的虹彩色素上皮细胞得到网膜神经细胞，从而实现采用了患者自身细胞的再生治疗。由此，能够克服诸如免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡等的再生治疗中的问题，并有望对现在尚无有效治疗方法的网膜变性疾患的治疗方法的确立做出贡献。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述的生产方法中，上述虹彩色素上皮细胞来源于哺乳类。
根据上述方法，能够生产在过去尚未发现有效的诱导分化方法的哺乳类的网膜神经细胞。本方法可广泛应用于医疗、生物技术等领域。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述的生产方法中，上述胚胎网膜干细胞来源于鸟类。
根据上述方法，关于虹彩色素上皮细胞，鸟类细胞和哺乳类细胞具有相同的与因子响应的性质，因此，在由哺乳类的虹彩色素上皮细胞生产网膜神经细胞时，能够进行良好的诱导分化。另外，与哺乳类的胚胎网膜干细胞相比，鸟类的胚胎网膜干细胞易于分离，可得到较多的数量，因此，其具有便于利用的优点。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述的生产方法中，上述虹彩色素上皮细胞是在从眼球分离后用浮游凝集块培养法进行了选择性培养的虹彩色素上皮细胞。
根据上述方法，用浮游凝集块培养方法对所分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养，可得到与形成神经干细胞的凝集块(sphere)非常相似的凝集块。因此，适于通过诱导分化上述虹彩色素上皮细胞来生产网膜神经细胞。
另外，关于上述虹彩色素上皮细胞，如后所述，可以用现有公知的添加了生长因子等的培养基对其实施培养，从而诱导向神经细胞的分化。即，可以说上述虹彩色素上皮细胞为相对未分化状态。另外，上述虹彩色素上皮细胞也可以被称为”源于虹彩组织的神经干细胞”。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述的生产方法中，通过从眼球取出虹彩组织的虹彩组织取出工序以及从所取出的上述虹彩组织分离虹彩色素上皮的虹彩色素上皮分离工序来分离上述虹彩色素上皮细胞。
根据上述方法，能够可靠地分离虹彩色素上皮细胞，可有效地用于网膜神经细胞的诱导分化。
另外，本发明的网膜神经细胞是通过上述任一生产方法所得到的网膜神经细胞。
上述网膜神经细胞是利用可从患者本人身上采集一部分细胞的虹彩色素上皮细胞来生产的，因此，能够实现采用患者自身的细胞的再生治疗。并且，能够克服诸如免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡等的再生治疗中的问题。
此外，上述网膜神经细胞是无需进行基因的导入而诱导分化了的网膜神经细胞，所以，不存在诸如损伤DNA等的危险性，并可确保被用于治疗时的安全性。
进而，本发明的另一网膜神经细胞的生产方法是采用了接触培养的生产方法，其特征在于，该方法由下述步骤构成从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；以及在无血清培养基上对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
根据本发明的网膜神经细胞的生产方法，通过在无血清培养基上对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，无需象现有技术(参照非专利文献8)那样地导入基因，就能进行向网膜神经细胞的诱导分化。因此，在将通过本发明的生产方法所得到的网膜神经细胞用作再生治疗的材料时，也不会带来诸如损伤DNA等的危险，所以，具有可有效地用于再生治疗的可能性。
另外，关于上述虹彩色素上皮细胞，如上上述，可从患者本人身上采集其一部分细胞，因此，通过本发明的生产方法，可由源于患者的虹彩色素上皮细胞得到网膜神经细胞，从而实现采用了患者自身细胞的再生治疗。从而能够克服诸如免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡等的再生治疗中的问题。由此，本方法有望对现在尚无有效治疗方法的网膜变性疾患的治疗方法的确立做出贡献。
此外，上述采用了接触培养的生产方法的特征在于上述虹彩色素上皮细胞来源于鸟类或哺乳类。
根据上述方法，也如下述实施例所示，可得到诸如网膜视细胞、双极细胞、Müller神经胶质细胞等的各种网膜神经细胞。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述采用了接触培养的的生产方法中，在上述接触培养中的培养开始时的上述无血清培养基中，以1-100ng/ml的浓度含有FGF2、FGF9、CNTF中的至少一种。
根据上述方法，在上述无血清培养基中以1-100ng/ml的浓度含有上述因子，由此，能够更可靠地诱导向网膜神经细胞的分化，并能提高网膜神经细胞的生产效率。另外，在本发明中，可以含有多种上述各因子。在该情况下，各因子的浓度也优选为1-100ng/ml。
此外，本发明的网膜神经细胞的生产方法的特征在于在上述采用了接触培养的的生产方法中，在培养开始时上述虹彩色素上皮细胞在无血清培养基上的细胞密度(每cm2的细胞数量)为小于或等于1×105个/cm2。
根据上述方法，在培养开始时上述虹彩色素上皮细胞在无血清培养基上的细胞密度为小于或等于1×105个/cm2，由此，能够更可靠地诱导向网膜神经细胞的分化，并能提高网膜神经细胞的生产效率。
进而，本发明的另一网膜神经细胞的生产方法是采用了接触培养的生产方法，其特征在于，该方法由下述步骤构成从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；将上述虹彩色素上皮细胞植入含有FGF2和/或FGF9的培养基上并开始接触培养的步骤；以及在上述开始接触培养的步骤后，从上述培养基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培养基中添加CNTF，对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
根据上述另一采用了接触培养的生产方法，除由上述采用了接触培养的生产方法所得到的效果外，还能够更快地诱导向网膜神经细胞的分化。
在上述采用了接触培养的另一生产方法中，在上述开始接触培养的步骤中上述培养基为无血清培养基的情况下，可在上述诱导向网膜神经细胞分化的步骤中，进而在上述培养基中添加血清。
另外，本发明的网膜神经细胞是根据上述采用了接触培养的生产方法中的任意一种方法所得到的。
上述网膜神经细胞是利用可从患者本人身上采集一部分细胞的虹彩色素上皮细胞来生产的，因此，能够实现采用患者自身的细胞的再生治疗。由此，能够克服诸如免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡等的再生治疗中的问题。
此外，上述网膜神经细胞是无需进行基因的导入而诱导分化了的网膜神经细胞，所以，不存在诸如损伤DNA等的危险性，在应用于治疗时可确保安全性。
本发明的其他目的、特征和优点在以下的描述中会变得十分明了。此外，以下参照附图来明确本发明的优点。
图1是表示本发明的网膜神经细胞的生产方法的一个实施方式的概略步骤图。
图2是表示在图1所示的网膜神经细胞的生产方法的共同培养步骤中使用的共同培养系统的示意图。
图3是表示本发明的网膜神经细胞的生产方法的其他实施方式的概略步骤图。
图4(a)是表示来源于小鼠的虹彩色素上皮细胞的视紫红质阳性细胞的示意图。其中，箭头所示的地方是本实施例中被抗体染色了的视紫红质。图4(b)是表示来源于小鼠的虹彩色素上皮细胞的波形蛋白(Vimentin)阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的波形蛋白。
图5(a)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的视紫红质阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的视紫红质。图5(b)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的视紫蓝质(Iodopsin)阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的视紫蓝质。图5(c)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的PKC阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的PKC。
图6是表示来源于小鼠的虹彩色素上皮细胞的凝集块(Sphere)的示意图。
图7(a)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的视紫红质阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的视紫红质。图7(b)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的视紫蓝质阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的视紫蓝质。图7(c)是表示来源于鸡雏的虹彩色素上皮细胞的HPC-1阳性细胞的示意图。其中，白色区域是本实施例中被抗体染色了的HPC-1。
具体实施例方式以下，参照图1、图2、图4(a)和图4(b)来说明本发明的实施方式1。另外，本发发明并不限于该描述。
在本实施方式1中，对下述方法进行说明，即，通过共同培养胚胎网膜干细胞和虹彩色素上皮细胞并由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞，来生产网膜神经细胞的方法。
图1表示本实施方式的网膜神经细胞的生产方法的概略步骤。如图1所示，本实施方式的网膜神经细胞的生产方法大致由3个步骤构成。第1个步骤为虹彩色素上皮细胞分离步骤，即，从动物的眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤(S1)。第2个步骤为选择培养步骤，即，利用浮游凝集块培养方法，来选择性地培养所分离的虹彩色素上皮细胞的步骤(S2)。第3个步骤为共同培养步骤，即，对所选择培养的上述虹彩色素上皮细胞和胚胎网膜干细胞进行共同培养的步骤(S3)。
换言之，根据本实施方式的网膜神经细胞的生产方法，通过实施共同培养步骤(S3)，虹彩色素上皮细胞向网膜神经细胞分化，其结果，能够得到网膜神经细胞，其中，在该共同培养步骤(S3)中，对借助于虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)及后续实施的虹彩色素上皮细胞的选择培养步骤(S2)所得到的虹彩色素上皮细胞和胚胎网膜干细胞进行共同培养。另外，通过上述选择培养步骤(S2)培养的虹彩色素上皮细胞为相对未分化状态，具有分化为各种神经细胞的可能性，因此，也可以称之为”源于虹彩组织的神经干细胞”。
此外，在本实施方式中，对用于网膜神经细胞生产的虹彩色素上皮细胞，在从哺乳类的眼球将其分离后，如上上述，通过浮游凝集块培养方法对其实施选择性培养。由此，可以得到与形成源于脑或脊髓的神经干细胞的凝集块非常类似的凝集块(Sphere)，能够有效地用于神经细胞的诱导分化。
在此，对本方法所用的胚胎网膜干细胞进行说明。
所称的胚胎网膜干细胞，在参考文献1(Turner DL&Cepko，Nature(1987年)328131-136页)中已经得到证实，是在分化后成为网膜神经细胞的未分化的细胞。可以通过现有公知的方法从胚胎的网膜组织分离上述胚胎网膜干细胞。关于上述分离，例如，可以通过在参考文献2(Akagi T.et.al.，Neurosci Lett.，2003年5月8日，341(3)213-216页)中记载的方法来实施之。
关于采集上述胚胎网膜干细胞的动物种类，对此并不作特别的限制。但在利用源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞来生产网膜神经细胞时，优选从哺乳类或鸟类的网膜组织中采集并进行分离。进而，由于可从发育中的卵中采集，所以，分离相对容易并且廉价，还能得到相对多的数量，鉴于此点，优选使用源于鸟类的胚胎网膜干细胞，并且，在鸟类中优选使用源于鸡的胚胎网膜干细胞。
此外，关于要采集在本实施方式的网膜神经细胞的生产方法中所用的虹彩色素上皮细胞的动物种类，也并没有特别的限制。但是，由于希望将本生产方法适用于过去尚未发现有效的网膜神经细胞的诱导分化方法的哺乳类，所以，上述虹彩色素上皮细胞优选来源于哺乳类。并且，考虑到作为实验动物的利用价值，进一步优选小鼠、大鼠、仓鼠(Hamster)、小家鼠(Mus Musculus)等的啮齿类，或者，如果考虑到临床应用，则进一步优选利用来源于视觉功能更发达的动物(雪貂、猴子)或人的虹彩色素上皮细胞。
接着，进一步详细说明分离、培养虹彩色素上皮细胞的方法，即，虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)和选择培养步骤(S2)。
如图1所示，可利用至少包括从眼球分离虹彩色素上皮细胞的虹彩色素上皮细胞分离步骤(步骤1，以下将步骤简称为S)和借助于浮游凝集块培养方法选择性地培养所分离的虹彩色素上皮细胞的选择培养步骤(S2)，来实施虹彩色素上皮细胞的分离、培养。根据该方法，能够获得与形成源于脑、脊髓的神经干细胞的凝集块(Sphere)非常类似的凝集块。
这里，分离虹彩色素上皮细胞的哺乳类可以是从胚胎到成体的任何时期的个体。即，在本实施方式的网膜神经细胞的生产方法中，作为其材料，不但能够使用源于哺乳类胚胎的虹彩色素上皮细胞，还可以使用源于哺乳类成体的虹彩色素上皮细胞。
关于S1的虹彩色素上皮细胞分离步骤，只要能够分离虹彩色素上皮细胞即可，并不对其具体方式进行限制。一般而言，利用现有公知的方法，从哺乳类的眼球取出虹彩组织，并从取出的虹彩组织中分离虹彩色素上皮细胞即可。作为从哺乳类的眼球取出虹彩组织的方法，优选采用上述非专利文献8所记载的方法。
关于S2的选择培养步骤，只要能够仅对从哺乳类的眼球分离的虹彩色素上皮细胞实施选择性的培养即可，并不限定其具体的方式。一般而言，利用现有公知的方法，仅对从哺乳类的眼球分离的虹彩色素上皮细胞实施选择性的培养即可。
上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)，至少包括作为工序1(以下，将工序简称为P)的虹彩组织取出工序；以及作为P2的虹彩色素上皮分离工序。
此外，上述虹彩组织取出工序(P1)，如图1所示，至少包括作为P3的仅从哺乳类的眼球切除虹彩组织的虹彩组织切除阶段；作为P4的对所切除的虹彩组织实施酶处理的酶处理阶段；以及作为P5的使酶处理后的虹彩组织恢复的虹彩组织恢复阶段。
另外，上述选择培养步骤(S2)，至少包括作为P6的细胞解离阶段，用于将在上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)中分离的虹彩色素上皮细胞从凝集状态解离为一个一个的细胞；以及作为P7的细胞培养阶段，仅仅对所分离的虹彩色素上皮细胞实施选择性的培养。
以下，详细地说明上述虹彩组织取出工序(P1)中的各阶段P3至P5。首先，关于P3的虹彩组织切除阶段，只要从哺乳类的眼球仅仅切除虹彩组织即可，并不特别限制其具体的方式。一般而言，利用现有公知的方式，从哺乳类的眼球仅仅切除虹彩组织即可。例如，可以用市面上销售的微型手术剪来实施P3的虹彩组织切除阶段中的虹彩组织切除。
关于P4的酶处理阶段，为了使虹彩色素上皮易于从虹彩组织分离而对虹彩组织实施酶处理，并不特别限制其具体的方式。一般而言，利用现有公知的方式实施即可。
例如，可以用含有在市面上销售的分散酶(Dispase)的分散酶溶液使虹彩组织反应15-40分钟，然后，用含有在市面上销售的EDTA(乙二胺四乙酸)的EDTA溶液使其反应20-30分钟，由此，来实施P4的酶处理阶段。另外，关于在P4的酶处理阶段中使用的酶和试剂，对此并不进行特别的限定，可以使用现有公知的能够对虹彩组织进行处理以使得虹彩色素上皮易于从虹彩组织分离的酶和试剂。
在P5的虹彩组织恢复处理阶段中，恢复因酶处理而衰弱了的虹彩组织。关于其具体的方式，在此并不进行特别的限定，利用现有公知的方式实施即可。
例如，可以在酶处理阶段的反应后，使虹彩组织在含有市面上销售的牛胚胎血清的培养液中反应30-60分钟，由此，来实施P5的虹彩组织恢复处理阶段。另外，关于在P5的虹彩组织恢复处理阶段中使用的含有血清的培养液和试剂，对此并不进行特别的限定，可以使用现有公知的能够恢复衰弱的虹彩组织的含有血清的培养液和试剂。
此外，在上述虹彩组织取出工序(P1)中，P4的酶处理阶段和P5的虹彩组织恢复处理阶段的反应时间特别重要。通过调整P4的酶处理阶段的虹彩组织在分散酶溶液中的反应时间及在EDTA溶液中的反应时间、P5的虹彩组织恢复处理阶段的在含有牛胚胎血清的培养液中的反应时间，不但能够从鸡的眼球分离虹彩色素上皮，而且，还能够从诸如小鼠、大鼠、人等的哺乳类的眼球分离虹彩色素上皮。
以下，详细说明对各动物的上述各条件。
在从小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用25-37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应15-40分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05-0.1％使其反应16-40分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应30-120分钟。
另外，在从出生后10天的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应16分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应20分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应90分钟。
此外，在从出生后12天的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应20分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应25分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
此外，在从出生后2个月的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应40分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应30分钟。
在从大鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应15-40分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应15-60分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应30-120分钟。
在从人胎儿的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用25-37℃的上述分散酶溶液500-1000U/ml使虹彩组织反应15-30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05-0.1％中使其反应15-40分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应10-60分钟。
另外，在从出生后19周的人胎儿的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应30分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
此外，作为上述培养液，例如，可以使用由INVITROGEN公司生产的”DMEM培养基”，再适量添加在市面上销售的牛胚胎血清即可。
在P2的虹彩色素上皮分离工序中，只要能够从在虹彩组织取出工序(P1)取出的虹彩组织中仅仅分离虹彩色素上皮即可，并不对其具体的方式进行限定，其中，上述虹彩组织是由虹彩基质和虹彩色素上皮构建的。一般而言，利用现有公知的方式，从虹彩组织中仅仅分离虹彩色素上皮即可。
例如，可以利用在市面上销售的微型镊子，从恢复后的虹彩组织中仅仅剥离并收集虹彩色素上皮，由此，来实施P2的虹彩色素上皮分离工序。
接着，详细说明上述选择培养步骤(S2)的各阶段P6、P7。首先，在P6的细胞解离阶段中，只要能够将所分离的虹彩色素上皮的片状的细胞解离为一个一个的细胞即可，并不对其具体的方式进行限制。一般而言，利用现有公知的方式，将所分离的虹彩色素上皮的片状的细胞解离为一个一个的细胞即可。
例如，在P6的细胞解离阶段中，利用在市面上销售的胰蛋白酶(Tripsin)溶液，将所分离的虹彩色素上皮的片状的细胞解离为一个一个的细胞。另外，例如，在P6的细胞解离阶段中，还可以不使用胰蛋白酶溶液，而是借助于使用了在市面上销售的微型移液器(MicroPipette)的移液操作，将所分离的虹彩色素上皮的片状的细胞解离为一个一个的细胞。
另外，关于在P6的细胞解离阶段中所用的试剂和器材，在此并不对其进行特别的限定，可以使用现有公知的能够将所分离的虹彩色素上皮从凝集状态解离为一个一个的细胞的试剂和器材。
在P7的细胞培养阶段中，只要能够仅对所分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养即可，而并不对其具体的方式进行限制。一般而言，利用现有公知的方式，仅对所分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养即可。优选的是，使用参考文献3(Science 1992225；1707-1710)所记载的Neurosphere法(浮游凝集块培养法)，仅仅对从哺乳类的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养。
例如，在P7的细胞培养阶段中，将在市面上销售的N2添加剂(Supplement)添加到在市面上销售的无血清培养基中，并将其用作浮游凝集块培养用的培养液。一边用在市面上销售的摇床(Shaker)进行旋转，一边在浮游凝集块培养用的培养液中培养在P6的细胞解离阶段中解离的虹彩色素上皮细胞。由此，能够得到与形成源于脑、脊髓的神经干细胞的凝集块(Sphere)非常类似的凝集块。
另外，关于在上述P7的细胞培养阶段中所用的培养液和试剂，在此并不对其进行特别的限定，可以使用现有公知的能够得到与形成源于脑、脊髓的神经干细胞的凝集块(Sphere)非常类似的凝集块的培养液和试剂。
通过上述方法得到的源于虹彩色素上皮细胞的凝集块被用来和胚胎网膜干细胞进行共同培养。
下面，对共同培养步骤(S3)进行说明，在该共同培养步骤(S3)中共同培养上述胚胎网膜干细胞和通过上述选择培养步骤(S2)选择培养了的虹彩色素上皮细胞。
例如，可以根据参考文献4(Semin Cell Dev Biol(1998)，9(3)，257-262，review)所记载的方法来实施上述共同培养步骤(S3)。即，在置入例如来源于鸡等的鸟类的胚胎网膜干细胞时，也一并置入通过上述方法从哺乳类的眼球分离的虹彩色素上皮细胞(源于虹彩组织的神经干细胞)，从而共同培养胚胎网膜细胞和虹彩色素上皮细胞。由此，可由源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。
具体而言，例如，在从小鼠的眼球分离虹彩组织并培养虹彩色素上皮细胞时，按照上述步骤(即，虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)、选择培养步骤(S2))实施该分离和培养即可。然后，在培养3-6天后，用分散酶、胰蛋白酶混合溶液来解离细胞。进而，将所解离的虹彩色素上皮细胞与源于鸟类的胚胎网膜干细胞同时投入共同培养系统(参照参考文献4)，并进行旋转培养，从而可以得到由虹彩色素上皮细胞分化的网膜神经细胞。
图2表示在本实施方式中使用的共同培养系统的示意图。如图2所示，本共同培养系统的主要构成要素为培养皿1；以及配置在其内部并可沿着例如箭头A的方向旋转的内部容器(Inner Well)2。在上述共同培养步骤(S3)中，在培养皿1的底部置入源于鸟类的网膜色素上皮细胞5，在内部容器2的内部注入源于鸟类的胚胎网膜干细胞3和源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞3，进行旋转培养。
另外，上述旋转培养优选下述实施条件，即，培养温度36.5-37.5℃，培养天数10-30天，旋转的旋转次数50-70rpm。
在上述培养条件下共同培养的细胞是否被诱导向网膜神经细胞分化，并生产出网膜神经细胞，例如，可以通过下述来确认，即利用各特异抗体对网膜神经细胞进行染色，来检测作为特异形质的标记蛋白质。
作为上述标记蛋白质，例如，可以列举出用于发挥感光功能的极其特异的作为蛋白质的视紫红质或视紫蓝质。视紫红质是网膜视细胞发挥感光功能所需的蛋白质，其在形成网膜视细胞的视杆细胞(Rod)中进行特异性表达，其中，该网膜视细胞为网膜神经细胞中的一种。视紫蓝质也是网膜视细胞发挥感光功能所需的蛋白质，是在形成网膜视细胞的视锥细胞(Cone)中进行特异性表达的蛋白质。另外，作为其他的标记蛋白质，还可以利用诸如检测作为网膜神经细胞的一种的Müller神经胶质细胞(Müller Glia Cell)的波形蛋白等。
如果从上述共同培养的细胞中检测出了视紫红质(或者视紫蓝质)(参照图4(a))，则可以确认该培养细胞被诱导分化成了网膜神经细胞(更具体地说，为网膜视细胞)。此外，如果从上述共同培养的细胞中检测出了波形蛋白(参照图4(b))，则可以确认该培养细胞被诱导分化成了网膜神经细胞(更具体地说，为Müller神经胶质细胞)。
根据本实施方式的方法，也如后述的实施例所示，能可靠地由哺乳类的虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞，从而生产网膜神经细胞。
另外，在本实施方式中，说明了利用源于鸟类的网膜色素上皮细胞及胚胎网膜干细胞和源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞进行共同培养的示例。但是，本发明并不限于此。即，例如，还可以全部采用源于哺乳类的细胞来实施共同培养，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。
根据上述方法，可以通过由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞来生产网膜神经细胞。由此，本方法具有能够用于下述极为有效的再生治疗的可能性，即，采集网膜疾病患者自身的一部分虹彩组织，并由该虹彩组织生产网膜神经细胞的再生治疗。
以下，参照图3、图5(a)至图5(c)来说明本发明的实施方式2。另外，本发发明并不限于该描述。
在本实施方式2中，对包括下述步骤的网膜神经细胞的生产方法进行说明，即从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；以及在无血清培养基上对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，并诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
本实施方式的网膜神经细胞的生产方法，如图3所示，主要由下述步骤构成，即虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)，从眼球分离虹彩色素上皮细胞；以及接触培养步骤(S13)，对虹彩色素上皮细胞进行接触培养。
关于虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)，由于是利用与上述实施方式1所述的虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1参照图1)相同的方式来实施的，所以，在本实施方式2中，省略其说明。
并且，在本实施方式的网膜神经细胞的生产方法中，在上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)和接触培养步骤(S13)之间，包括有相当于上述实施方式1所述的选择培养步骤(S2参照图1)的选择培养步骤(S12)。关于选择培养步骤(S12)，由于是利用与实施方式1所述的选择培养步骤(S2)相同的方式来实施的，所以，在本实施方式2中，也省略其说明。
并且，在上述选择培养步骤(S12)中，选择性地培养源于虹彩组织的神经干细胞(即，虹彩色素上皮细胞)，在后续进行的接触培养步骤(S13)中，所培养的虹彩色素上皮细胞被诱导分化为网膜神经细胞。
另外，通过上述选择培养步骤(S12)培养的虹彩色素上皮细胞处于相对未分化状态，具有向各种神经细胞分化的可能性。这里所说的上述各种神经系细胞，包括神经元(神经细胞)、作为非神经细胞的神经胶质细胞。上述神经胶质细胞不显示作为神经元的一个特征的能动的电响应，是对神经元承担各种功能的细胞，例如，支撑神经元、或者向神经元提供营养等。就脊椎动物而言，上述神经胶质细胞，根据其功能和特征，被分为下述四种，即，星形胶质(星形胶质细胞)、神经小胶质(神经小胶质细胞)、少突胶质(少突胶质细胞)、施万细胞(Schwann Cell)。
并且，本实施方式的网膜神经细胞的生产方法为，通过上述接触培养步骤(S13)，由虹彩色素上皮细胞诱导分化上述神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，进而，其中的一部分被诱导分化为网膜神经细胞。
关于采集本实施方式2的诱导分化所使用的虹彩色素上皮细胞的动物种类，在此并不作特别的限制。例如，可以列举出鸡(包括鸡雏)、鹌鹑等的鸟类，或者，小鼠、大鼠、人等的哺乳类。如果利用源于鸟类或哺乳类的虹彩色素上皮细胞并按照本实施方式2的生产方法来生产网膜神经细胞，则如后述的实施例所述，可得到诸如网膜视细胞、双极细胞、Müller神经胶质细胞等的各种网膜神经细胞。
特别是就现状而言，关于哺乳类的网膜神经细胞，由于尚未发现有效的诱导分化方法，因此，可以说，在网膜神经细胞的再生治疗中，能够利用源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞来诱导网膜神经细胞的本实施方式的方法具有较高的可利用性。
此外，在实施方式1中，采用了由上述虹彩色素上皮细胞分离步骤及选择培养步骤构成的方法来实施哺乳类的虹彩色素上皮细胞的分离、培养。也可以采用与之相同的方法来实施鸟类的虹彩色素上皮细胞的分离、培养。
另外，在从眼球分离虹彩色素上皮细胞时，在虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)中，如实施方式1所述，利用虹彩组织取出工序(P1参照图1)来实施酶处理和虹彩组织恢复处理。
这里，关于上述酶处理和虹彩组织恢复处理的各条件，在从鸟类的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用36.5-37.5℃的分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应10-40分钟，在室温下用EDTA溶液0.05-0.1％使其反应20-50分钟。
另外，在从鸡雏的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，更为优选的是，用36.5-37.5℃的分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，在室温下用EDTA溶液0.05-0.1％使其反应20-40分钟，用含有5-10％牛胚胎血清的培养液使其反应5-10分钟。
接着，具体说明对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养的接触培养步骤(S13)。
在上述接触培养步骤(S13)中，在无血清培养基上对虹彩色素上皮细胞进行接触培养。上述接触培养可以采用现有公知的接触培养法，例如，上述参考文献3所述的接触培养法。该接触培养步骤(S13)所用的培养基为无血清培养基，除此之外并不作特别的限制，可以使用能够将源于虹彩色素上皮细胞的神经干细胞诱导分化为神经系细胞的现有公知的培养基。
作为上述接触培养用的培养基，例如，可以使用DMEM/F12培养基、DMEM培养基、EMEM培养基(均为INVITROGEN公司生产)等。
另外，关于在上述接触培养步骤(S13)中所用的培养皿和所添加的因子，在此并不作特别的限制，可以使用能够将源于虹彩色素上皮细胞的神经干细胞诱导分化为神经系细胞的现有公知的培养皿和因子。
此外，在上述接触培养用的培养开始时的无血清培养基中，优选的是，以1-100ng/ml浓度含有FGF2(Fibroblast Growth Factor2成纤维细胞生长因子)、FGF9(Fibroblast Growth Factor 9成纤维细胞生长因子)及CNTF(毛样体神经节神经营养因子)中的至少一种因子，更为优选的是，以10-40ng/ml浓度含有FGF2、FGF9及CNTF中的至少一种因子。
并且，优选的是，在开始培养2-5天后，停止添加上述因子中的FGF2、FGF9。即，优选的是，从培养开始到最迟经过5天为止的时间里，使用不含FGF2及FGF9的无血清培养基。关于CNTF，优选的是，从培养开始时到结束时持续添加之。由此，从培养开始时起用约2周的时间能够可靠地诱导其向网膜神经细胞的分化。另外，优选的是，进而在上述无血清培养基中添加在市面上销售的N2添加剂。
此外，作为向上述接触培养步骤(S13)所用的无血清培养基中添加的生长因子，并不限于上述，除上述之外，例如，可以列举出FGF2、FGF9之外的FGF-family组、EGF(Epidermal Growth Factor上皮生长因子)、BDNF(Brain Derived Nutritional Factor源于脑的神经营养因子)、EGF(Epidermal Growth Factor上皮生长因子)、NT-3(Neurotrophin-3神经营养素)、NT-4(Neurotrophin-4神经营养素)、RA(Retinoic Acid维生素A)、PDGF(PlateletDerived Growth Factor源于血小板的生长因子)、T3(Triiodothyronine三碘甲状腺氨基酸)等。
另外，作为上述接触培养用的培养皿，优选由层粘连蛋白(Laminin)、胶原蛋白(Collagen)等的细胞外基质成分所包被的培养皿，或者优选多聚赖氨酸(Poly-D-Lysine)包被的培养皿，但是，并不限于此。
此外，向上述接触培养开始时的上述无血清培养基上植入的虹彩色素上皮细胞的细胞密度(每1cm2的细胞数量)优选的是小于或等于1×105个/cm2。由此，能够有效地诱导向网膜神经细胞的分化。并且，为了更为有效地诱导向网膜神经细胞的分化，将上述虹彩色素上皮细胞的细胞密度设定为1×104-5×104个/cm2即可。
另外，关于上述接触培养步骤(S13)中的上述之外的各培养条件，按照现有公知的神经干细胞的培养条件来实施即可。
利用现有公知的一般的神经标记来实施神经细胞的检测，可由此确认在上述的培养条件下接触培养的细胞是否被诱导分化为诸如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的各种神经细胞。另外，在神经元的检测时，作为标记而使用微管蛋白(Tubulin)、神经丝蛋白(Neurofilament)等，在星形胶质细胞的检测时，作为标记而使用GFAP等，在少突胶质细胞的检测时，作为标记而使用O4等。
然后，在检测出神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞后，例如，利用各特异抗体对网膜神经细胞进行染色，从而来检测作为特异形质的标记蛋白质，由此，可确认是否被诱导向网膜神经细胞分化，结果是否生产了网膜神经细胞。此外，在上述标记蛋白质的抗体染色之外，从细胞提取RNA，并用RT-PCR法等来确认标记基因的表达，由此，也能够确认是否生产了网膜神经细胞。
作为上述标记蛋白质，例如，可以列举出实施方式所述的视紫红质和视紫蓝质。这些蛋白质在作为网膜神经细胞的一种的网膜视细胞中进行特异性表达。另外，作为网膜视细胞之外的网膜神经细胞，例如，可以列举出双极细胞、Müller神经胶质细胞、无长突细胞(amacrine)等。关于双极细胞，将PKC(phosphokinase)用作特异性标记蛋白质，关于Müller神经胶质细胞，将波形蛋白用作特异性标记蛋白质，关于无长突细胞，将HPC-1用作特异性标记蛋白质。
如果从上述接触培养的细胞中检测出了视紫红质和视紫蓝质(参照图5(a)、图5(b))，则可以确认该培养细胞已被诱导分化为网膜视细胞。另外，如果从上述接触培养的细胞中检测出了PKC(phosphokinase)(参照图5(c))，则可以确认该培养细胞已被诱导分化为双极细胞；如果从上述接触培养的细胞中检测出了波形蛋白，则可以确认该培养细胞已被诱导分化为Müller神经胶质细胞；如果从上述接触培养的细胞中检测出了HPC-1，则可以确认该培养细胞已被诱导分化为无长突细胞。
根据上述方法，可以通过由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞来生产网膜神经细胞。由此，本方法具有能够用于下述极为有效的再生治疗的可能性，即，采集网膜疾病患者自身的一部分虹彩组织，并由该虹彩组织生产网膜神经细胞的再生治疗。
以下，说明本发明的实施方式3。另外，本发发明并不限于该描述。
在本实施方式3中，对包括下述步骤的网膜神经细胞的生产方法进行说明，即从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；在含有FGF2和/或FGF9的培养基上对上述虹彩色素上皮细胞开始接触培养的步骤；以及在开始上述接触培养的步骤之后，从上述培养基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培养基中添加CNTF，对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，并诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
本实施方式的网膜神经细胞的生产方法，与实施方式2同样地，主要由下述步骤构成，即虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)，从眼球分离虹彩色素上皮细胞；以及接触培养步骤(S13)，对虹彩色素上皮细胞进行接触培养。另外，与实施方式2同样地，在本实施方式3的网膜神经细胞的生产方法中，在上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S11)和接触培养步骤(S13)之间，包括有选择培养步骤(S12)(参照图3)。
并且，在本实施方式3的网膜神经细胞的生产方法中，上述接触培养步骤(S13)由下述构成，即在含有FGF2和/或FGF9的培养基上对上述虹彩色素上皮细胞开始接触培养；在上述接触培养开始后，从上述培养基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培养基中添加CNTF，对上述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，并诱导其向网膜神经细胞分化。
另外，在本实施方式3的网膜神经细胞的生产方法中，在接触培养步骤(S13)中使用的培养基和向该培养基添加各因子的方法不同于实施方式2。因此，在本实施方式3中，关于上述接触培养步骤(S13)之外的方式，由于能够以和实施方式2相同的方式来实施，所以，在此省略其说明。
在本实施方式3中，在开始接触培养的步骤中所用的培养基可以是无血清培养基，但是并不限于此，也可以使用含有血清的培养基。作为上述接触培养用的培养基，可以使用DMEM/F12培养基、DMEM培养基、EMEM培养基(均为INVITROGEN公司生产)等。此外，这里所使用的血清，例如，可以列举出牛胚胎血清(FCS)。上述血清在培养基中的含量优选1-10％(W/V)。
另外，在上述接触培养开始时的培养基中还含有FGF2和/或FGF9。该FGF2(或FGF9)在培养基中的浓度优选为10-40ng/ml。
此外，在上述接触培养开始时的培养基中所添加的生长因子并不限于上述，除上述之外，例如，可以列举出FGF2、9之外的FGF-family组、EGF、BDNF、EGF、NT-3、NT-4、RA、PDGF、T3等。
另外，作为上述接触培养用的培养皿，优选由层粘连蛋白(laminin)、胶原蛋白(collagen)等的细胞外基质成分所包被的培养皿，或者优选多聚赖氨酸(poly-D-lysine)包被的培养皿，但是，并不限于此。
此外，向上述接触培养开始时的上述无血清培养基上植入的虹彩色素上皮细胞的细胞密度(每1cm2的细胞数量)优选的是小于或等于1×105个/cm2。由此，能够更有效地诱导向网膜神经细胞的分化。
在上述接触培养开始后，在经过1-3天后，从上述培养基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培养基中添加CNTF作为因子。通过在该培养基上持续培养上述虹彩色素上皮细胞，可诱导其向网膜神经细胞分化。
另外，在上述开始接触培养的步骤中，在采用了无血清培养基的情况下，可以在向培养基中添加CNTF时，同时添加血清(例如FCS)使得其浓度达到1-10％(W/V)。
此外，关于上述接触培养步骤(S13)中的上述之外的各培养条件，按照与实施方式2的接触培养步骤(S13)中的培养条件相同的培养条件来实施即可。
与实施方式2同样地，利用现有公知的一般的神经标记来实施神经细胞的检测，可由此确认在上述的培养条件下接触培养的细胞是否被诱导分化为诸如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的各种神经细胞。
进而，与实施方式2同样地，例如，利用各特异抗体对网膜神经细胞进行染色，从而来检测作为特异形质的标记蛋白质，由此，可确认是否被诱导向网膜神经细胞分化，结果是否生产了网膜神经细胞。此外，在上述标记蛋白质的抗体染色之外，从细胞提取RNA，并用RT-PCR法等来确认标记基因的表达，由此，也能够确认是否生产了网膜神经细胞。
根据上述方法，可以通过由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞来生产网膜神经细胞。进而，根据本实施方式3的方法，能够更快地诱导分化网膜神经细胞，所以，和实施方式2的方法相比较而言，能够以更短的时间来生产网膜神经细胞。
<实施例>
以下，通过实施例对本发明进行更为具体的说明。但本发明并不限于该描述。
(从哺乳类分离虹彩色素上皮细胞的情况)从下述哺乳类即出生后10天、出生后12天及出生后2个月的小鼠(“C57BL6”，从SLC公司或CLEA Japan公司获取)、出生后9-12天、出生后3周及出生后2个月的大鼠(“DA大鼠”，从SLC公司获取)、出生后19周的人胎儿(由仓敷成人病中心院长提供，并已经得到该中心伦理委员会的认可)取出虹彩色素上皮细胞。
使用市面上销售的微型手术剪从上述哺乳类的眼球仅切除虹彩组织。使该虹彩组织在37℃的分散酶溶液(“デイスパ一ゼ(dispase)”，合同清酒公司生产)1000U/ml中反应15-40分钟，然后，在室温下使其在0.05％EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸)溶液中反应20-30分钟。在反应后，使上述虹彩组织在含有8％牛胚胎血清的培养液(“DMEM培养基”，INVITROGEN公司生产)中反应30-60分钟，使上述虹彩组织恢复。之后，利用在市面上销售的微型镊子，从上述虹彩组织中仅仅剥离并收集虹彩色素上皮，从而分离虹彩基质和虹彩色素上皮。
在为出生后10天的小鼠的情况下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应16分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应20分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应90分钟。
在为出生后12天的小鼠的情况下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应20分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应25分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
在为出生后2个月的小鼠的情况下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应40分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应30分钟。
在为出生后11天的大鼠的情况下，用上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应20分钟，用上述EDTA溶液0.05％使其反应25分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应90分钟。
在为出生后19周的人胎儿的情况下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应30分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
(从鸟类分离虹彩色素上皮细胞的情况)从下述鸟类即出生后1-3天的鸟雏(鸡雏)(从GLOBALCHICK公司(歧阜县)获取)取出虹彩色素上皮细胞。关于取出的基本方法，与上述哺乳类的情形时相同。
在为出生后2天的鸡雏的情况下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩组织反应30分钟，用上述EDTA溶液0.05％使其反应30分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应5分钟。另外，关于利用牛胚胎血清进行的反应处理，也可以省略之。
(浮游凝集块培养法)使用市面上销售的胰蛋白酶溶液将上述分离的哺乳类或鸟类的虹彩色素上皮组织解离为细胞。然后，按照上述参考文献3所述的neurosphere法(浮游凝集块培养法)，对上述所解离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养。浮游凝集块培养的培养基为，在无血清培养基(“DMEM/F12培养基”，INVITROGEN公司生产)中添加1/100量的INVITROGEN公司生产的N2添加剂。一边用在市面上销售的摇床进行旋转，一边在上述浮游凝集块培养液中培养上述进行了胰蛋白酶处理的虹彩色素上皮细胞，由此，能够得到与形成源于脑或脊髓的神经干细胞的凝集块(Sphere)非常类似的凝集块(参照图6)。
(通过共同培养实施从虹彩色素上皮细胞向网膜神经细胞的诱导分化)按照参考文献4所述的方法，在置入鸡的胚胎网膜干细胞时，也一并置入通过上述方法从小鼠的眼球分离、解离的虹彩色素上皮细胞(源于虹彩组织的神经干细胞)。
具体而言，按照上述步骤来实施小鼠虹彩的分离以及虹彩色素上皮细胞的培养。在培养3-6天后，用分散酶、胰蛋白酶混合溶液来解离细胞。将所解离的虹彩色素上皮细胞与鸡胚胎网膜干细胞同时投入内部容器2内，并进行旋转培养(参照图2)。
在经过14天时间的培养后，采集培养细胞。
接着，通过对各网膜神经细胞进行特异性标记蛋白质的抗体染色，来确认上述培养细胞是否被诱导分化为网膜神经细胞。其结果，如图4(a)、图4(b)所示，从上述细胞中检测出了用于发挥感光功能的极其特异的蛋白质视紫红质(图4(a)中箭头所示的位置)、以及在Müller神经胶质细胞中特异的蛋白质波形蛋白(图4(b)中的白色区域)。
在上述培养细胞中检测出了视紫红质，据此可以证实该培养细胞已被诱导分化为网膜神经细胞(更具体地说，为网膜视细胞)。另外，在上述培养细胞中检测出了波形蛋白，据此还可以证实该培养细胞已被诱导分化为网膜神经细胞(更具体地说，为Müller神经胶质细胞)。
(通过接触培养实施向网膜神经细胞的诱导分化的实施例1)在本实施例1中，说明在无血清培养基上对虹彩色素上皮细胞进行接触培养时向网膜神经细胞的诱导分化实验。
将按照上述方法分离、解离的鸡雏的虹彩色素上皮细胞置入由层粘蛋白包被的培养皿。作为培养液，使用了在DMEM/F12培养基中添加N2添加剂、生长因子FGF2(20ng/ml)所得到的培养液。另外，这里，虹彩色素上皮细胞的细胞密度为3.2×104个/cm2。此外，在本实施方式中，采用了生长因子FGF2，但也可以用FGF9代替FGF2来实施之。
从培养开始4-5天后，停止添加FGF2，进而，继续培养2-7天，这时，可以确认神经细胞的形态发生了变化。
在约2周时间的无血清培养之后，采集培养细胞，用一般的神经标记微管蛋白(或神经丝蛋白)、GFAP、O4对神经细胞进行检测。其结果，检测出了上述各神经标记，据此，可以确认上述培养细胞已被诱导分化为神经细胞(具体而言，为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)。
接着，通过对各网膜神经细胞进行特异性标记蛋白质的抗体染色，来确认上述培养细胞是否被诱导分化为网膜神经细胞。其结果，如图5(a)-5(c)所示，从上述细胞中分别检测出了视紫红质(图5(a)中的白色区域)、视紫蓝质(图5(b)中的白色区域)、PKC(图5(c)中的白色区域)。视紫红质、视紫蓝质是在网膜视细胞中进行特异性表达的蛋白质。另外，PKC是在双极细胞中进行特异性表达的蛋白质。
在上述培养细胞中分别检测出了视紫红质、视紫蓝质和PKC，据此可以证实该培养细胞已被分别诱导分化为作为网膜神经系细胞的网膜视细胞、双极细胞。
另外，在本实施例中，作为用于检测网膜神经细胞的标记而使用了视紫红质及视紫蓝质、PKC，由此确认了网膜视细胞、双极细胞的诱导。但在上述培养细胞中还可能包含有其他的网膜神经细胞。
(通过接触培养实施向网膜神经细胞的诱导分化的实施例2)在本实施例2中，说明在含有血清的培养基上对虹彩色素上皮细胞进行接触培养时向网膜神经细胞的诱导分化实验。
将按照上述方法分离、解离的鸡雏的虹彩色素上皮细胞置入由层粘蛋白包被的培养皿。作为培养液，使用了在DMEM/F12培养基中添加N2添加剂、生长因子FGF2(20ng/ml)和牛胚胎血清(FCS)(1％(W/V))所得到的培养液。另外，这里，虹彩色素上皮细胞的细胞密度为3.2×104个/cm2。此外，在本实施例中，采用了生长因子FGF2，但也可以用FGF9代替FGF2来实施之。
从培养开始1-3天后，停止向培养基添加FGF2，并添加CNTF(10-30ng/ml)，进而，继续培养2-7天，这时，可以确认神经细胞的形态发生了变化。
在约1周时间的无血清培养之后，采集培养细胞，用一般的神经标记、即微管蛋白(或神经丝蛋白)、GFAP、O4对神经细胞进行检测。其结果，检测出了上述各神经标记，据此，可以确认上述培养细胞已被诱导分化为神经细胞(具体而言，为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)。
接着，通过对各网膜神经细胞进行特异性标记蛋白质的抗体染色，来确认上述培养细胞是否被诱导分化为网膜神经细胞。其结果，如图7(a)-7(c)所示，从上述培养细胞中分别检测出了视紫红质(图7(a)中的白色区域)、视紫蓝质(图7(b)中的白色区域)、HPC-1(图7(c)中的白色区域)。视紫红质、视紫蓝质是在网膜视细胞中进行特异性表达的蛋白质。另外，HPC-1是在无长突细胞中进行特异性表达的蛋白质。
在上述培养细胞中分别检测出了视紫红质、视紫蓝质和HPC-1，据此，可以证实该培养细胞已被分别诱导分化为作为网膜神经系细胞的网膜视细胞、无长突细胞。
另外，在本实施例2中，也按照上述方法对幼年小鼠的虹彩色素上皮细胞实施了分离、解离，然后，与鸟雏的情况同样地进行了诱导分化实验。利用各网膜神经标记(PKC、HPC-1、视紫红质)对通过该实验所得到的培养细胞实施了各种细胞的检测。其结果如下述表1所示。
表1源于小鼠虹彩色素上皮细胞的网膜神经细胞的检测
如表1所示，在培养细胞中检测出了PKC、HPC-1、视紫红质。据此，可以证实培养细胞已被分别诱导分化为作为网膜神经细胞的双极细胞、无长突细胞、网膜视细胞。
另外，在用于实施本发明的最佳方式中所说明的具体实施方式
或实施例仅仅是用来阐明本发明的技术内容的示例。本发明并不限于上述具体示例，不应对本发明进行狭义的解释，可在本发明的精神和权利要求的范围内进行各种变更来实施之。
工业可利用性如上上述，根据本发明的方法，能够生产在过去尚未发现有效的诱导分化方法的哺乳类的网膜神经细胞。由于在哺乳类中存在很多以人为代表的具有较高利用价值的动物种类，所以，能够生产哺乳类的网膜神经细胞的本发明的方法有望对医疗、生物技术等领域的发展做出贡献。
本发明的网膜神经细胞是利用可从患者本人身上采集一部分细胞的虹彩色素上皮细胞来生产的，因此，能够实现采用患者自身的细胞的再生治疗。并且，能够克服诸如免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡等的再生治疗中的问题，有望对现在尚无有效治疗方法的网膜变性疾患的治疗方法的确立做出贡献。
另外，由于无需导入基因就能诱导分化本发明的网膜神经细胞，因此，不存在诸如DNA损伤等的危险性，可确保用于治疗时的安全性。
权利要求
1.一种网膜神经细胞的生产方法，其特征在于共同培养胚胎网膜干细胞和虹彩色素上皮细胞，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。
2.根据权利要求1所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于所述虹彩色素上皮细胞来源于哺乳类。
3.根据权利要求1或2所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于所述胚胎网膜干细胞来源于鸟类。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于所述虹彩色素上皮细胞是在从眼球分离后用浮游凝集块培养法进行了选择性培养的虹彩色素上皮细胞。
5.根据权利要求1至4中的任意一项所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于通过从眼球取出虹彩组织的虹彩组织取出工序以及从所取出的所述虹彩组织分离虹彩色素上皮的虹彩色素上皮分离工序来分离所述虹彩色素上皮细胞。
6.一种网膜神经细胞，其特征在于该网膜神经细胞是根据权利要求1至5中的任意一项所述的生产方法所得到的。
7.一种网膜神经细胞的生产方法，其特征在于，该方法由下述步骤构成从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；以及在无血清培养基上对所述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
8.根据权利要求7所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于所述虹彩色素上皮细胞来源于鸟类或哺乳类。
9.根据权利要求7或8所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于在所述接触培养中的培养开始时的所述无血清培养基中，以1-100ng/ml的浓度含有FGF2、FGF9、CNTF中的至少一种。
10.根据权利要求7至9中的任意一项所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于在培养开始时所述虹彩色素上皮细胞在无血清培养基上的细胞密度为小于或等于1×105个/cm2。
11.一种网膜神经细胞的生产方法，其特征在于，该方法由下述步骤构成从眼球分离虹彩色素上皮细胞的步骤；将所述虹彩色素上皮细胞植入含有FGF2和/或FGF9的培养基上并开始接触培养的步骤；以及在所述开始接触培养的步骤后，从所述培养基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在所述培养基中添加CNTF，对所述虹彩色素上皮细胞进行接触培养，诱导其向网膜神经细胞分化的步骤。
12.根据权利要求11所述的网膜神经细胞的生产方法，其特征在于在所述开始接触培养的步骤中所述培养基为无血清培养基的情况下，在所述诱导向网膜神经细胞分化的步骤中，进而在所述培养基中添加血清。
13.一种网膜神经细胞，其特征在于该网膜神经细胞是根据权利要求7至12中的任意一项所述的生产方法所得到的。
全文摘要
本发明提供一种网膜神经细胞的生产方法以及由该生产方法得到的网膜神经细胞。本发明的网膜神经细胞的生产方法为，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞，从而来生产网膜神经细胞。其第1种方法为，对源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞和源于鸟类的胚胎网膜干细胞实施共同培养。其第2种方法为，在分离了鸟类或哺乳类等的虹彩色素上皮细胞后，对该虹彩色素上皮细胞实施接触培养。根据上述方法，能够利用从患者自身采集的虹彩色素上皮细胞来生产网膜神经细胞，所以，可实现非常有效的再生治疗。
文档编号C12N5/0793GK1795266SQ20048001424
公开日2006年6月28日 申请日期2004年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者小阪美津子 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构