专利名称：基于CD8α链的具有降低的免疫原性的基因治疗载体的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及基因治疗领域，更特别地，提供用于降低基因治疗载体的免疫原性的方法和组合物。
背景技术：
基因送递或基因治疗是一种用于治疗后天和遗传性疾病的很有前途的方法。一组不断扩增的基因被克隆和识别，所述基因的异常表达与威胁生命的人类疾病相关。在人体内表达这些克隆基因的能力将最终使预防和/或治愈许多重要的人类疾病成为可能，对于这些疾病目前的治疗方法是不够的或者根本不存在治疗方法。例如，在人类病人中体内表达胆固醇调节基因，选择性阻断HIV复制的基因或肿瘤抑制基因将分别显著地改善心脏病、HIV、和癌症的治疗。
然而不幸的是，迄今为止所述的基因治疗方案仍被种种问题所困扰，特别包括基因从载体上表达的周期短，以及不能有效地再度使用相同的载体，这两者都是由针对与载体及其治疗运载物(payload)相关的抗原的寄主免疫应答引起。加入病毒和/或治疗性基因的组织最初被通过CD8+细胞毒性T细胞以及CD4+辅助T细胞介导的寄主细胞免疫应答所攻击，所述反应极大限制了从载体上基因表达的持续性。此外，通过CD4+T细胞介导的寄主体液免疫应答通过抑制相同载体的成功的再度使用，进一步限制了现行基因治疗方案的有效性。
例如，在一开始使用腺病毒载体之后，产生了针对主要病毒衣壳(capsid)蛋白，即五临体、六临体和尾丝的抗原决定簇的血清特异性抗体。假设这些衣壳蛋白是腺病毒将其自身黏附到细胞上并随后侵染细胞的工具，那么这些抗体便能够阻断或“中和”细胞被同样血清型腺病毒再感染。这需要使用不同血清型腺病毒来提供一种或多种随后剂量的在基因治疗范围内的外源治疗性DNA。此外，治疗性和病毒基因产物在靶细胞上被表达，使得他们对细胞免疫应答敏感。因此，他们被拒绝，基因治疗的有益效果被打消，靶器官或组织被破坏。由于这些与免疫相关的障碍，因此基因治疗方案的进展被完全妨碍。
因此，本领域对特异性抑制针对基因治疗表达载体以及用这些载体转染的细胞的免疫应答的有效方法存在极大的需求。此外，对用于给予或输送基因治疗运载物的改进的方法和组合物存在需求。因此本发明的一个目标是特异性抑制针对基因治疗载体及他们的治疗产物的细胞和体液免疫应答，从而提高来自用这些载体转染的细胞的外源基因的表达。
相关文献概述已知，当通过其T细胞受体复合物已接收到信号的CTL也通过其I类MHC分子的α3区域接收到信号时，MHCI类-限制性T细胞(如，CD8+CTLs)的活性能被抑制。这种所谓的否定(veto)信号能被刺激物(stimulator)或“否定(veto)”细胞所表达的CD8分子传送。Sanbhara和Miller，Science 2521424-1427(1991)。由此引起的免疫抑制是抗原特异性的和MHC-限制性的，并由通过应答CTL的否定细胞单向识别产生，但并非反之亦然。Rammensee et al.，Eur.J.Immunol.12930-934(1982)；Fink et al.，J.Exp.Med.157141-154(1983)；Rammensee et al.，J.Immunol.132668-672(1984)。既然否定活性已被与CD8α链的存在相联系，那么如果当CD8α链被表达时，如果CD8的表达被删除(deleted)并加以确定，否定功能便消失。Hambor et al.，J.Immunol.1451646-1652(1990)；Hambor et al.，Intern.Immunol.28856-8879(1990)；Kaplan et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA868512-8515(1989)。
为开发这种抗原特异性抑制路径来消除不必要的细胞毒性T细胞应答，多种策略已被建议。这种策略之一包括使用多肽共轭物，所述共轭物将CD8或其功能性区域共价连接到指导CD8针对特异性靶细胞的否定活性的二级配体上。见，如，美国专利号5,242,687，5,601,828和5,623,056。可选择地，具有对连接到CD8α链的细胞外区域的MHCI类分子具有特异性的单克隆抗体结合位点的杂交抗体分子已被研究。Qi et al.，J.Exp.Med.1831973-1980(1996)。然而，这样的分子具有几个缺点，仍未发现实际临床用途。
最近，WO02/102852描述了使用具有被设计成对MHCI类亲和力增强的氨基酸修饰的可溶性C8α链变异体的CTL抑制。值得注意的是，其中教导了所主张的CD8α组合物对I类MHC分子是特异性的，并因此被期望只抑制CTL的应答，并进一步教导了与其它免疫抑制剂的组合将在涉及细胞和体液免疫应答其它因素的情况下被需要，如，MHCII类限制性T细胞例如CD4+T细胞。Id.pp.27-28。
发明概述本发明基于这一惊人的发现，即通过免疫调节分子如CD8的靶向表达所介导的否定效应能有效地和特异性地抑制直接针对与表达载体包括其外源遗传运载物相关的抗原，以及针对与转染的靶细胞相关的抗原的宿主免疫应答。本发明还基于另外一惊人的发现，即通过CD8α的靶向表达所介导的否定效应能有效地和特异性地抑制应答的CD4+T细胞(II类-限制性MHC)以及CD8+T细胞(I类-限制性MHC)，并且作为结果产生的直接针对这些载体相关抗原的寄主免疫应答的细胞和体液成分能被抑制。因此，通过使用本发明所描述的方法和组合物，可通过抑制针对载体相关抗原的寄主免疫应答来协同增强基因治疗方案，这些免疫应答目前限制基因从载体上表达并阻止基因治疗达到其全部潜能。
因此，本发明提供了用于特异性抑制直接针对表达载体以及用这些表达载体转染的靶细胞的寄主免疫应答的组合物和方法，其中该载体包括为能引发否定效应的免疫调节分子编码的核酸序列，优选CD8多肽，更优选CD8α-链，最优选CD8α-链的细胞外和跨膜区域。出于目标组合物和方法的性质，以及上述现有技术中CD8α-链的可溶形式的明显缺陷，CD8α-链跨膜区域或合适的可替换的跨膜区域的存在被认为是必要的。
一方面，本发明提供了用于抑制针对表达载体的免疫应答的方法，包括在体内或体外将寄主靶细胞与编码CD8多肽，优选CD8α-链，最优选CD8α-链的细胞外和跨膜区域的全部或功能部分的表达载体接触，其中所述的CD8多肽表达于靶细胞的表面上，并且由此针对表达载体和靶细胞的免疫应答被特异性抑制。重组载体优选进一步包括一个或多个额外的编码目标治疗蛋白或分子的转基因。正如本文中所描述和例证的，使用本发明的方法和组合物时，免疫应答的体液和细胞成分被抑制。
另一方面，本发明还提供了用于特异性抑制直接针对载体相关抗原的寄主免疫应答的方法，包括在体内或体外将寄主靶细胞与包括编码CD8多肽，优选CD8α-链，最优选CD8α-链的细胞外和跨膜区域的全部或功能部分的核酸的表达载体接触，其中所述的CD8多肽表达于靶细胞的表面，并且从而针对载体相关抗原的免疫应答被特异性抑制。
本发明进一方面提供了用于提高治疗性转基因在寄主内表达的方法，包括给予寄主表达载体，该表达载体包括为CD8多肽，优选CD8α-链，最优选CD8α-链的细胞外和跨膜区域的全部或功能部分编码的核酸序列，其中的CD8多肽表达于靶细胞的表面，并且从而针对载体相关抗原的寄主免疫应答被特异性抑制。在一具体实例中，治疗性转基因与CD8多肽被包含于同一载体上。在一可选择的具体实例中，CD8多肽和治疗性分子被分别的表达载体所编码。如本发明中所描述的，目标方法通过抑制针对载体相关抗原的寄主免疫应答的细胞和体液成分提高了治疗性转基因的表达，从而增加了治疗性转基因在寄主内的持久性，并使在转基因表达的随后循环中再度使用表达载体成为可能。
进一方面，本发明提供了具有降低免疫原性的改进的病毒表达载体，其中该表达载体包括基本由为本发明中所披露的CD8多肽编码的核酸序列和为至少一种目标治疗性转基因编码的核酸序列组成的非病毒核酸。在一具体实例中，治疗性转基因不同于免疫调节分子。在一优选的具体实例中，该CD8多肽包括CD8α-链的全部或功能部分。优选地，该CD8α-链的功能部分包括CD8α-链的至少胞外区域，更优选CD8α-链的胞外区域和跨膜区域。一般来说，本发明中提供的免疫调节分子与靶细胞表面膜相关联，如在转染靶细胞后，插入到膜内或共价或非共价地结合到那里。
本发明预期使用的合适的载体包括重组和非重组载体，和病毒(例如，腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒载体等等)以及非病毒(如，细菌质粒、噬菌体、脂质体等等)载体。优选病毒载体，最优选腺病毒载体。
虽然披露了多种实施例，但从下面的显示和描述了本发明的说明性具体实例的描述来看，仍然有其它的本发明实施例对本领域技术人员来说是显而易见的。正如将被意识到的那样，本发明能在多个明显的方面被改变，所有这些都没有背离本发明的主旨和范围。因此，附图和详细描述在本质上被认为是说明性而非限制性的。
附图简要说明
图1描述了来源于不同物种的CD8α-链蛋白和核酸序列。还包括记录序列的入藏登记号。
图2A-B描述了野生型CD8α-链的氨基酸和核酸序列，包括为人和小鼠蛋白不同区域的划分。
图3描述了用C57B/6脾细胞刺激的Balb/c脾细胞。用正常成纤维细胞(●)，培养基(■)，或带有小鼠(A)或人(B)来源的CD8的成纤维细胞(▲)补充培养物。收集培养物并测试他们对C57BL/6-来源的靶细胞的裂解能力。
图4描述了被注射了对照的成纤维细胞(■和▲)或mCD8转染的C57BL/6-(H-2b)来源的(○和●)成纤维细胞的Balb/c(H-2d)小鼠。两周后杀死动物，收集脾细胞，用C57BL/6(H-2b)(■和○)或CBA/J(H-2k)(●和▲)脾细胞刺激并测试他们对EL4(H-2b)(■和○)或S.AKR(H-2k)(●和▲)靶细胞的裂解能力。
图5描述了靶细胞(▲)或表达CD8的靶(■)，通过同种异体反应的(alloreactive)T细胞或通过抗原特异性的CTLs(B)来测试他们对裂解的易感性。
图6描述了在正常的成纤维细胞(●)和转导了mAdCD8(A，▲)或HAdCD8(B，▲)的成纤维细胞存在的情况下建立的MLCs(Balb/canti-C57B/6)。对照培养(■)中没有加入成纤维细胞。这些培养物对C57BL/6-来源的靶的裂解活性在培养结束时被测定。
图7描述了用腺病毒否定转移载体，mAdCD8的免疫。用上面指示的载体感染C57BL/6小鼠。10天后，收集脾细胞并在Adβgal病毒的存在下培养。给出了胚细胞(blast cell)的数量。
图8描述了用mAdCD8的否定免疫(A)用Adβgal或mAdCD8免疫C57BL/6小鼠一次。(B)5天后用Adβgal再次免疫像(A)那样处理的动物。在最后一次注射7天后杀死动物，在Adβgal存在下培养他们的脾细胞。培养5天后，测试细胞对Adβgal感染的同系(syngeneic)靶细胞的裂解能力。
图9描述了用1×106(或没有)刺激物细胞培养的3×106C7B1/6脾细胞，按所示转导。4天后，通过免疫荧光分析培养物中CD4+T淋巴母细胞的存在。
图10A-D描述了用不同病毒构建物感染后，小鼠和人CD8α-链的表面表达。A.感染的细胞Mc57T成纤维细胞；第1栏模拟感染；第2栏用hAdCD8感染；B.感染的细胞MC57T成纤维细胞；第1栏模拟感染；第2栏用mAdCD8感染。C.感染的细胞Balbc未经选择的骨髓细胞；第1栏用lacZ腺病毒载体(AdlacZ)感染；第2栏用mAdCD8感染。D.感染的细胞MC57T成纤维细胞；第1栏模拟感染；第2栏用pAAV-mCD8感染；第3栏用pAAV-hCD8感染。
图11描述了在加入到MLCs之前已被转导后培养0或5小时的成纤维细胞的存在下建立MLCs(Balb/c抗-C57BL/6)。培养结束时，在荧光活化的细胞分析仪上测定淋巴母细胞的数量。
图12描述了否定转移载体的体外抑制。在未感染或感染了mAdCD8的MC57成纤维细胞(H-2b)存在或不存在的情况下建立了BALB/c抗-C57BL/6混合淋巴细胞培养(MLC)(X)。在EL4(H-2b)靶细胞中测量CTL应答。
图13描述了用AdLacZ或mAdCD8免疫的Balb/c小鼠。在AdLacZ的存在下培养它们的脾细胞，并测定针对感染了AdLacZ的同系P815靶细胞的特异性裂解活性。
图14描述了(A)用AdLacZ(■)或mAdCD8(▲)免疫的C57BL/6动物。测试它们的脾细胞对同系的AdLacZ EL4靶细胞的裂解活性。(B)在测试它们针对感染AdLacz的EL4靶细胞的溶解活性之前，用AdLacZ再次免疫这些动物。
图15描述了血红蛋白β的mRNA序列。
图16描述了GATA结合蛋白的mRNA序列。
图17描述了δ-氨基乙酰丙酸(d-aminoevulinate)合酶的mRNA序列。
图18描述了葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的mRNA序列。
图19描述了鸟氨酸氨基甲酰转移酶的mRNA序列。
图20描述了α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)的mRNA序列。
图21描述了β-葡萄糖苷酶的mRNA序列。
图22描述了α-半乳糖苷酶的mRNA序列。
发明详述直接针对与表达载体相关的蛋白的寄主免疫应答一直干扰着基因治疗技术的发展，其中应答的细胞成分严重限制了包含于该载体内的基因表达，应答的体液成分使得在有免疫能力的动物体内再度使用相同的载体变得复杂。本发明的成功源于这一惊人的发现，即在转染了表达载体的靶细胞上表达免疫调节分子如CD8抑制了应答的CD4+T细胞和CD8+T细胞，因此有效地和特异性地抑制了直接针对载体相关抗原的寄主免疫应答的体液和细胞成分。
因此，本发明中所描述的组合物和方法能通过增加表达载体在寄主细胞内的持续性极大地改进体内和体外的基因治疗方案，并因此提高了包含于载体内的治疗性转基因的表达，以及使寄主细胞再度成功使用同一载体(如相同血清型的重组腺病毒载体)成为可能。在一具体实例中，提供了包括为免疫调节分子，优选CD8多肽，更优选CD8α-链，最优选CD8α-链的细胞外和跨膜区域编码的核酸序列，以及为一个或多个目标治疗性分子编码的核酸序列的表达载体。在一可选的具体实例中提供了为在寄主中共同使用的分别的表达载体，其中之一为CD8多肽编码，另外其中之一为期望的治疗性分子编码本发明还提供了抑制针对表达载体，特别是重组载体，如腺病毒载体，腺相关病毒载体，疱疹病毒载体或逆转录病毒载体的免疫应答的方法，包括将靶细胞与为免疫调节分子和一个或多个目标治疗性分子，例如在体内和体外基因治疗上下文中的治疗性分子编码的表达载体接触。正如本文中所描述和例证的，通过本发明获得的寄主免疫应答的抗原特异性抑制使表达载体在细胞中能更持久的存在，包含于载体内的治疗性转基因能伴随提高表达，以及为继续基因治疗能再度成功使用同一载体。
相应地，本发明提供了用于基因治疗的组合物和方法，其中针对与基因治疗送递载体相关的抗原的细胞和体液免疫应答被取消或减少了。一般来说，本发明针对于降低或减少针对表达载体，基因治疗载体，靶细胞或感染了基因治疗载体的靶细胞的后代的细胞和/或体液免疫应答的方法和组合物。
“体内基因治疗”和“体外基因治疗”意指包含所有过去的、现在的和未来的被本领域那些普通技术人员作为“基因治疗”所公知的并被提及的变异和修饰，包括回体(ex vivo)的应用。
“表达载体”意指任何用于将核酸运送入靶细胞的载体。表达载体通常被分为病毒载体和非病毒载体。病毒表达载体指的是，但不限于，腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，等等。非病毒载体指的是质粒载体，裸DNA，偶联到不同运载体上的裸DNA，或者与脂质体或其它脂质制品相关的裸DNA。通常，表达载体是重组的，尽管在一些具体实例中，例如当脂质体或细胞消融(ablation)，如生物射弹技术被使用时，他们不是重组的。优选用于本发明的重组载体是质粒载体以及选自腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在一些使用重组病毒载体，特别是腺病毒载体的具体实例中，衣壳蛋白如，腺病毒衣壳的六邻体蛋白的免疫原性，可根据本领域公知的方法被降低，尽管这些修饰根据本发明中详述的改进不再是必需的。
“基因治疗送递载体”指的是包括上述表达载体的组合物，其包括但不限于病毒载体和非病毒载体。
“抑制”指的是直接的或间接的，局部的或全部的，无论是细胞的((如白血球动员))还是体液的，针对载体相关抗原和/或靶细胞特异性抗原的先天或后天免疫应答的抑制和/或降低。载体相关抗原包括，如来源于核酸载体或包膜(envelope)(如病毒外壳(coat)蛋白等等)的抗原以及来源于载体基因(如细菌或病毒核酸和蛋白)和/或包含于载体内的任何治疗性转基因(如哺乳动物核酸和/或蛋白)的抗原。
“特异性免疫抑制”或“抗原特异性免疫抑制”指的是直接针对抗原如载体相关抗原的免疫应答的抑制，和不是抗原特异性的常规免疫抑制相反。因此，举例来说，寄主细胞和/或体液对载体相关抗原的免疫应答的缺乏，结合体内对其它外源抗原的免疫能力的证据，将证明载体相关抗原的特异性免疫抑制。
“免疫应答”优选指的是后天的免疫应答，如细胞或体液的免疫应答。
“接触”指的是将基因治疗表达载体以使载体和细胞之间产生物理接触的方式和数量给予细胞。如果载体是重组病毒颗粒，那么，期望地，细胞被病毒载体的附着和感染通过这种物理接触达到。如果病毒载体不是重组病毒颗粒，如未被包膜包起来的病毒核酸或其它的核酸，那么，期望地，达到细胞被核酸感染。
这种“接触”能被本领域那些技术人员以任何方式来实现，并被描述于本文中，通过它们能达到载体与靶细胞间的明显接触和相互接触。任选地，载体，如腺病毒载体，能与双特异性或多特异性分子(如，抗体或其片段)进一步复合，其中“接触”涉及载体和双特异性或多特异性分子的复合体与靶细胞的明显接触或相互接触。例如，载体和双特异性(多特异性)分子能被共价连接，如通过本领域技术人员公知的化学方式，或其它方式。优选，载体和双特异性(多特异性)分子能通过非共价作用(如离子键、氢键、范德华力、和/或非极性相互作用)的方式被连接。尽管载体和双特异性(多特异性)分子能通过在少量体积的相同溶液中混合而开始接触，但靶细胞和复合物不必在少量体积中开始接触，例如，在复合体被给予寄主(如，人)的情形中，复合体通过血流到达靶细胞，它选择性地结合到靶细胞上并进入其内。载体和双特异性(多特异性)分子的接触优选在靶细胞与载体和双特异性(多特异性)分子的复合物接触之前进行。
“转基因”指的是基因，其能在与包含该转基因的表达载体接触的细胞中被表达，并且其表达对细胞是其一部分的细胞或组织、器官、器官系统、有机体或细胞培养物来说具有所期望的预防或治疗效益。因此，转基因可以是治疗性基因，如目标治疗性基因。治疗性基因可以是在RNA或蛋白水平发挥其效应的基因。例如，被治疗性基因编码的蛋白能被应用于遗传病的治疗，如使用编码囊纤维化跨膜传导调节子编码的cDNA来治疗囊性纤维化。
此外，治疗性基因能在RNA水平上发挥其效应，例如，通过编码反义信息或核酶，本领域公知的siRNA，可选择的RNA剪接受体或供体，影响剪接或3’加工(如多聚腺苷酸化)的蛋白，或影响细胞内(也就是，此处的基因表达被广泛认为包括从转录起始到经过加工的蛋白产生的所有步骤)另一基因表达水平的蛋白，或许除其它途径之外，通过介导mRNA积累率的改变，mRNA转移的改变，和/或转录后调节的改变。
根据本发明优选的方面，表达载体任选地包括一种或多种编码目标治疗性分子连同本发明所述的CD8多肽的转基因。能被本发明治疗的疾病包括，但不限于，普遍的遗传病如苯丙酮酸尿症(苯基丙氨酸-L-单氧酶)，囊性纤维化(囊性纤维化传导调节子)(cystic fibrosis conductance regulator)，鸟氨酸caramyl transferase缺乏(OTC)，血友病(因子XI缺乏，因子VIII缺乏)，家族黑蒙性白痴(N-乙酰氨基己糖苷酶A)和其它脂质积累病，等。此外，能使用编码促红细胞生成素(EPO)的基因。EPO是一种产生于胎儿肝脏和成人肾脏内的糖蛋白激素，其作用于骨髓和其它造血组织内的祖细胞来刺激红细胞的形成。编码人和其它哺乳动物EPO的基因已被克隆，测序和表达，并在种间在编码区域显示出高度的序列同源性。Wen et al.(1993)Blood 821507-1516。编码天然的人EPO的基因序列，以及获得它的方法，已被描述于美国专利号4,954,437和4,703,008中，在本发明中一并全文结合作为参考。使用EPO的基因治疗方法披露于美国专利号6,610,290中，其在本发明中明白地引入做为参考。
可选择地，可使用编码溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(lysosomal enzymeacid alpha-glucosidase)(GAA)的核苷酸序列。GAA的功能是切割溶酶体糖原的α-1，4和α-1，6连接键来释放单糖。编码人GAA基因的序列，以及获得它的方法先前已被描述(GenBank登录号M34424和Y00893；Martiniuk etal.(1990)DNA Cell Biol.985-94；Martiniuk et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839641-9644；Hoefsloot et al.(1988)Eur.Mol.Biol.Organ.71697-1704)，其在本发明中明白地引入做为参考。
通过本发明披露的方法和组合物能治疗的优选疾病列于下表中。提供登录号的序列在本发明中明白地引入作为参考。
表1
如果免疫调节的CD8分子被包含于一载体内的基因所编码，该载体与包含和表达治疗转基因的载体是分开的，则包含CD8分子的载体能在细胞与包含和表达基因的载体接触之前、同时、或之后开始与细胞接触，只要使用相似或相同类型的载体，并且接触效果的时间选择足够抑制对与细胞接触的载体的免疫应答。
“靶细胞”可以作为单一个体存在，或者可以是一个大的细胞集合体的一部分。这个“大的细胞集合体”可包括，例如，细胞培养物(混合的或纯的)、组织(如，上皮或其它组织)、器官(如，心、肺、肝、胆囊、膀胱、眼或其它器官)、器官系统(如，循环系统、呼吸系统、胃肠系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统或其它器官系统)、或有机体(如，鸟、哺乳动物、特别是人、等等)。优选，作为目标的器官/组织/细胞是循环系统(如，包括，但不限于心、血管、和血液)，呼吸系统(如，鼻、咽、喉、气管、支气管、细支气管、肺、等等)，肠胃系统(如，包括嘴、咽、食道、胃、肠、唾液腺、胰腺、肝、胆囊、和其它的)，泌尿系统(例如，像肾、输尿管、膀胱、尿道、等等)，神经系统(如，包括，但不限于，脑和脊髓、及特殊感觉器官，如眼)和皮肤系统(如，皮肤)。甚至更优选，细胞选自由心、血管、肺、肝、胆囊、膀胱、眼细胞和干细胞组成的细胞。培养和使用干细胞的方法已被更详细披露于美国专利号5,672,346，6,143,292和6,534,052中，其在本发明中结合作为参考。
在一些具体实例中，与表达载体如病毒载体或质粒接触的靶细胞不同于其它细胞之处在于被接触的靶细胞包括能被表达载体靶向的特定的细胞表面结合位点。“特定的细胞表面结合位点”指的是存在于细胞表面的，载体，如，腺病毒载体，能与之相互作用以粘附到细胞上，从而进入该细胞的任何位点(如，分子或分子的联合)。因此，特定的细胞表面结合位点包括细胞表面受体并且，优选，是蛋白(包括修饰的蛋白)，碳水化合物、糖蛋白、蛋白多糖、脂类、粘蛋白分子或黏蛋白等等。潜在的细胞表面结合位点的例子包括，但不限于肝磷脂和发现于粘多糖上的硫酸软骨素部分，发现于粘蛋白上的唾液酸部分，糖蛋白以及神经节苷脂，主要的组织相容性复合体I(MHC I)糖蛋白，发现于膜糖蛋白内的普通碳水化合物分子，包括甘露糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺、海藻糖、和半乳糖；糖蛋白，如ICAM-1、VCAM、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、和整联蛋白分子；以及存在于癌细胞上的肿瘤-特异性抗原，例如，MUC-1肿瘤特异性抗原决定簇。然而，将表达载体如腺病毒靶向细胞不限于任何特定的细胞作用(也就是，与给定的细胞表面结合位点作用)机制。
如本发明中使用的并在下面进一步定义的，“多聚核苷酸”或“核酸”可以指DNA或RNA，或包含脱氧和核糖核苷酸的分子。核酸包括基因组DNA、cDNA和包括有义和反义核酸的寡核苷酸。这样的核酸也可包括在磷酸核糖骨架上的修饰以提高这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
核酸可以是双链的、单链的、或包含双链或单链序列的部分。正如本领域那些技术人员将理解的那样，单链(“Watson”)的描述也定义了另一链(“Crick”)的序列；因此在图2、4和6中描述的序列也包括该序列的互补链。术语“重组核酸”在本发明中指的是最初在体外，通常，通过核酸内切酶操作以一种非正常存在于自然界中的形式形成的核酸。因此，线形的分离的核酸，或通过连接非正常结合的DNA分子而形成于体外的表达载体，为本发明的目的这两者都被认为是重组的。可以理解，一旦形成重组核酸，再引入寄主细胞或有机体，那么它可以非重组地复制，也就是，使用寄主细胞的体内细胞机制，而非体外或染色体外操作；然而，这样的核酸，一旦重组产生，尽管随后非重组地复制，那么对本发明的目的来说仍然被认为是重组的。
术语“多肽”和“蛋白”能在本申请中被互换使用，指的是至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白，多肽，寡肽和肽。蛋白可由自然发生的氨基酸和肽键，或合成的模拟肽结构组成。因此用于本发明的“氨基酸”或“肽残基”既指自然发生的又指合成的氨基酸。例如，同型苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是为本发明目的的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基如脯氨酸和羟基脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构象。在一优选的具体实例中，氨基酸是(S)或L构象。如果使用非自然发生的侧链，那么可以使用非氨基酸取代，例如为防止或延缓体内降解。为产生变异的蛋白和肽以靶向或作为转基因表达的天然氨基酸序列的改变，例如，能通过本领域那些技术人员公知的各种方法来进行。变异的肽指的是与指定的肽实质上同源，但其具有与所述的肽不同的氨基酸序列的肽。同源性的程度(即，同一性百分比)，例如，能通过使用为这种比较而加以优化的计算机程序(如，使用Devereux et al描述的GAP计算机程序，6.0版本或更高版本(Nucleic AcidsRes.，12，387(1984)，并能从University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)处自由获得)比较序列信息来测定。变异的蛋白和/或肽的活性能使用其它本领域那些技术人员公知的其它方法来测定。
在变异的蛋白(肽)和参考蛋白(肽)之间不相同的氨基酸残基方面，变异的蛋白(肽)优选包括保守的氨基酸取代，也就是指定的氨基酸被相似尺寸、电荷密度、疏水性/亲水性、和/或构象的另一氨基酸取代(如Val取代Phe)。变异的位点特异性突变能通过向表达载体内连接包含修饰位点的合成的寡核苷酸而被导入。可选择地，能使用针对寡核苷酸的位点特异性突变程序，如Walder et al.，Gene，42133(1986)；Bauer et al.，Gene，3773(1985)；Craik，Biotechniques，January 1995，pp.12-19；和美国专利号4,518,584和4,737,462.中披露的那些。
免疫调节分子在本说明书的内容中，“免疫调节分子”是调节，也就是以抗原特异性方式，增加或减少直接针对靶细胞的细胞和/或体液的寄主免疫应答的多肽分子，优选是减少寄主免疫应答的多肽分子。一般来说，根据本发明的教导，免疫调节分子将与靶细胞表面膜相关联，如在从本发明所述的载体中表达后，插入到细胞表面膜内或共价或非共价连接到其上。
在优选的具体实例中，免疫调节分子包含CD8蛋白的全部或功能部分，甚至更优选为CD8α链的全部或功能部分。对于人CD8的编码序列来说，见Leahy，Faseb J.917-25(1995)；Leahy et al.，Cell 681145-62(1992)；Nakayama et al.，Immunogenetics 30393-7(1989)。关于CD8蛋白和多肽的“功能部分”指的是保持本发明中所述的否定活性的CD8α-链的部分，更特别的，保持CD8α-链的HLA-结合活性的部分，特定地，CD8α-链的胞外区域内的Ig-样区域。典型的变异CD8多肽描述于Gao和Jakobsen，ImmunologyToday 21630-636(2000)，在此引入作为参考。在一些具体实例中，使用了全长CD8α-链。然而，在一些具体实例中其细胞质区域被缺失。优选，保留了跨膜区域和细胞外区域。
正如本领域那些技术人员所理解的那样，CD8α-链的跨膜区域能与其它分子的跨膜区域互换，如果必要的话，修饰细胞外区域与靶细胞表面之间的连接。在这个具体实例中，编码CD8α-链的细胞外区域的核酸被可操作地连接到编码跨膜区域的核酸上。本发明中可使用任何跨膜蛋白的跨膜区域。可选择地，发现于跨膜蛋白内的未知的跨膜。在这个具体实例中“合成的跨膜区域”包括大约20-25个疏水氨基酸，其后跟随至少一个，优选两个带电氨基酸。在一些具体实例中，CD8细胞外区域通过本领域传统的技术被连接到靶细胞膜上。优选的CD8α-链序列列于图1，并包括编码来自包括人、小鼠、大鼠、猩猩、蜘蛛猿、豚鼠、牛、鬃毛棉鼠(Hispid cotton rat)、家猪和猫的种的全长CD8α-链的氨基酸序列或核苷酸序列的全长序列。
在一优选的具体实例中，CD8α-链不是融合蛋白，而是截短的蛋白，其内的细胞内区域被删除。如图2所描述，人CD8α-链基因表达一个235个氨基酸的蛋白。该蛋白被认为能分成下面几个区域(起始于该多肽的氨基末端结束于该多肽的羧基末端)信号肽(氨基酸1-21)；免疫球蛋白(Ig)-样区域(大约氨基酸22-136)；最接近膜的茎区域(氨基酸137-181)；跨膜区域(氨基酸183-210)和细胞质区域(氨基酸211-235)。编码这些不同区域的编码序列的核苷酸包括编码信号肽的1-63，编码细胞外区域的64-546，编码细胞内区域的大约547-621和编码细胞内区域的大约622-708。此外，小鼠序列能被分成如下区域。该多肽能被分成包括氨基酸1-27的信号序列，包括大约氨基酸28-194的细胞外区域，包括大约氨基酸195-222的跨膜区域和包括大约氨基酸223-310的细胞内区域。类似地，编码这些区域的编码序列的核苷酸包括编码信号肽的核酸1-81，编码细胞外区域的大约82-582，编码跨膜区域的大约583-666和编码细胞外区域的大约667-923。
在一些具体实例中编码全长蛋白的核酸序列被包含于基因送递载体内。在其它的具体实例中，编码细胞内区域的核酸未被包含于基因送递装置内的多核苷酸内，结果导致膜锚定蛋白缺乏细胞内区域。在其它种内，相应的区域也能被识别，包括在优选的具体实例中是小鼠。
本领域技术人员也将会理解与先前提及的多肽具实质上同源的免疫调节分子在本发明中也有用。因此，例如，也被“CD8多肽”包含的是与被图2中所示的核苷酸编码的多肽具有至少大约80％序列一致性，通常至少大约85％序列一致性，优选至少大约90％序列一致性，更优选大约95％序列一致性和最优选至少大约98％序列一致性的同源多肽。
“编码CD8的核酸分子”，及其语法上的等同物指的图2中所示的人CD8的核苷酸序列，以及与图2中所示的核苷酸具有至少大约80％序列一致性，通常至少大约85％序列一致性，优选至少大约90％序列一致性，更优选大约95％序列一致性和最优选至少大约98％序列一致性的核苷酸序列，其编码具有图2中所示序列的多肽，如列于图1。
如先前所提及的，可以使用许多不同的程序来鉴定一蛋白或核酸是否与已知的序列具有序列一致性或相似性。序列一致性和/或相似性能使用本领域公知的标准技术来测定，包括，但不限于，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部序列一致性运算法则(algorithm)，通过Needleman&Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)的序列一致性比对运算法则，通过Pearson & Lipman的寻找相似性方法PNAS USA 852444(1988)，通过这些运算法则的计算机运行(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)，Devereux et al.，Nucl.Acid Res.12387-395(1984)中描述的Best Fit序列程序，优选使用默认设置，或通过检查。优选，一致性百分比通过基于下列参数的FastDB来计算错配罚分(mismatch penalty)1；间隙罚分(gap penalty)1；间隙大小罚分(gap size penalty)0.33；和连接罚分(joining penalty)30，“序列比较和分析的现行方法，”大分子测序和合成，选择的方法和应用，pp 127-149(1988)，Alan R.Liss，Inc。
一个有用的运算法则的例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的、成对的比对从一组相关的序列产生了多个序列比对。它也能绘制用于产生比对的显示聚类关系的树。PILEUP使用Feng&Doolittle，J.Mol.Evol.35351-360(1987)的渐进比对方法的简化，该方法与Higgins&Sharp CABIOS 5151-153(1989)描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括默认的间隙权重(defaultgap weight)3.00默认的间隙长度权重(default gap lenth weight)0.10，和加权的末端间隙(weighted end gaps)。
有用的运算法则的另一实施例是BLAST运算法则，描述于Altschul etal.，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)and Karlin et al.，PNAS USA 905873-5787(1993)。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其能从Altschul et al.，Methods in Enzymology，266460-480(1996)；http∥blast.wustl/edu/blast/README.html]获得。WU-BLAST-2使用几个检索参数，其中的大多数被设置成默认值。其可调节参数被设置成下列数值重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，词阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并取决于特定序列的组成和针对被检索的目标序列的特定数据库的组成通过程序自身来建立的，然而，该数值能被调整以提高其敏感性。
另一有用的运算法则是被Altschul et al.Nucleic Acids Res.253389-3402报道的间隙BLAST(gapped BLAST)。间隙BLAST使用BLOSUM-62取代记分；阈值T参数设置为9，双重碰撞(two-hit)方法来引发无间隙的延伸；电荷间隙长度(charges gap length)为k值的代价为10+k；Xu设置为16，和Xg在数据库检索阶段设置为40，运算法则的输出阶段设置为67。间隙运算法则被相应于～22比特的分数触发。
A％的氨基酸或核酸序列一致性值是通过配对的相同的残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数而测定。该“较长”序列是在比对区域中具有最实际的残基的序列(通过WU-Blast-2引入使对准记分最大化的间隙被忽略)。
比对可以包括在被比对的序列内引入间隙。此外，对于包含比图11所示的核苷酸编码的多肽的氨基酸序列更多或更少氨基酸的序列来说，可以理解在一个具体实施例中序列一致性百分比将基于相对于氨基酸的总数量的相同的氨基酸数量来测定。因此，在一具体实例中，例如，比图11中的核苷酸编码的多肽更短的序列的序列一致性，如下论述，将使用更短序列内的氨基酸的数量来测定。在百分比一致性的计算中相对权重未被赋予给序列变异的不同表现，如插入、缺失、取代，等。
在一具体实例中，只有一致性被正记分，并且序列变异的所有形式包括间隙被指定为值“0”，其避免了对下述的用于序列相似性计算的加权数值范围或参数的需要。序列一致性百分比能通过，例如，配对的相同残基的数量除以比对的区域内“较短”序列的残基的总数量并乘以100来计算。“较长”序列是在比对区域内具有最实际残基的序列。
与图2内的核苷酸编码的多肽具有不到100％序列一致性的CD8一般将产生于来自除人之外的物种的天然CD8核苷酸序列以及人或非人来源的天然CD8核苷酸序列的变异体。在这点上，值得注意的是很多技术是本领域公知的，并可被常规应用以产生天然CD8序列的核苷酸序列变异体并分析那些变异体的多肽产物以确定至少一种与天然CD8多肽正常相关的活性的存在。在一优选的具体实例中，CD8α-链来自人，但如图1所示，来自大鼠、小鼠和灵长类的CD8-链是公知的并可被用于本发明。
具有CD8活性的多肽可以比描述于图2中的核苷酸编码的多肽更短或更长。因此，在一优选的具体实例中，包含于CD8多肽的定义是被图2的核苷酸序列编码的多肽的部分或片段。在本发明一具体实例中，被图2的核苷酸编码的多肽的片段被认为是CD8多肽，如果a)他们至少具有所指示的序列一致性；和b)优选具有上述的自然发生的CD8的生物活性。
此外，如下面更全面概括的，CD8α-链能被制成比图2的核苷酸编码的多肽更长；例如，通过添加其它融合序列，或阐明额外的编码和非编码序列。
CD8多肽优选是重组的。“重组多肽”是使用重组技术制备的多肽，也就是说，通过下述的重组核酸的表达。在一优选的具体实例中，本发明的CD8通过表达图2中所示的核酸序列，或其片段来制备。重组多肽至少在一个或多个性质方面不同于自然发生的蛋白。例如，该多肽能从野生型寄主内与其正常相关的一些或全部蛋白和化合物中被分离或纯化出来，并因此能被实质上纯化。例如，一种分离的多肽与其自然状态下正常相关的至少一些物质不共存，优选组成给定样品的总蛋白重量的至少大约0.5％，更优选至少大约5％。一种实质上纯化的多肽包括总多肽重量的至少大约75％，优选至少大约80％，特别优选至少大约90％。该定义包含从在不同有机体或寄主细胞内的一个有机体生产CD8多肽。
可选择地，该多肽可通过使用诱导启动子或高表达启动子，以比正常所见显著更高的浓度被制备，致使该多肽以提高的浓度水平被制备。可选择地，该多肽可以是非正常发现于自然界中的形式，如下面评述的，氨基酸取代、插入和缺失的加入。
在一具体实例中，本发明提供了核酸CD8的变异体。这些变异体属于三类中的一个或多个取代的、插入的、或缺失的变异体。这些变异体通常通过图2核苷酸的核苷酸位点特异性突变来制备，使用盒式或PCR突变或其它本领域公知的技术，来制备编码变异体的DNA，包括基因治疗载体内的变异体和其后表达DNA。氨基酸序列变异体以该变异事前确定的性质为特征，这一特点使他们与CD8氨基酸序列的自然发生的等位基因或种间变异区别开。变异体典型地展现出与自然发生的类似物相同的定量上的生物学活性，尽管具有将在下面被全面概括的修饰的性质的变异体也能被选择。
虽然引入序列变异的位点或区域事先被确定，但该突变本身不需要被事先确定。例如，为了优化一指定位点上突变的性能，在靶密码子或区域可进行随机突变，并筛选表达的突变体以获得最佳的期望的活性。在一具有已知序列的DNA中事先确定的位点上进行取代突变的技术已是公知的，例如M13引物突变和PCR突变。另一个制备突变体技术的实例是基因改组(shuffling)，其中允许重组核苷酸序列相似变体的片段来产生新的变体组合。这些技术的实例被发现于美国专利号5,605,703；5,811,238；5,873,458；5,830,696；5,939,250；5,763,239；5,965,408；和5,945,325中，他们的每一个在本发明中全文结合作为参考。
氨基酸取代典型地是单个残基取代；插入通常属于大约1-20个氨基酸范围的，尽管较大的插入也是被允许的。缺失的范围从1到大约20个残基，尽管在一些情形中缺失可以是更大的并可以包括细胞质区域或其片段。
取代、缺失、插入或他们的任一组合都可被用于获得最终的衍生物。通常对几个氨基酸进行这些变化以使得该分子的变化最小。然而，在某些情况下更大的变化也是被允许的。当期望获得CD8性质的小变化，取代将根据下面的图表来进行
图表1
功能或免疫原性实质上的改变可通过选择比图表1所示的那些更不保守的取代来进行。例如，可进行这样的取代，其实质上更显著影响改变的区域内多肽骨架的结构，例如α-螺旋或β-折叠结构；目标位点上分子的电荷或疏水性；或侧链的大小。通常被期望产生多肽的性质上最大变化的取代是那些其内(a)亲水残基，如丝氨酰基或苏氨酰基，被疏水残基取代或取代疏水残基，如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸被其它任何残基取代或取代其它任何残基；(c)具有电正性侧链的残基，如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基被电负性残基取代或取代电负性残基，如，谷氨酰基或天冬酰氨基；或(d)具有大侧链的残基，如苯基丙氨酸，被不具有侧链的残基取代或取代不具有侧链的残基，如甘氨酸。
尽管突变体因为需要被选择改变CD8的特性，但这些突变体典型地表现出与自然发生的类似物相同性质的生物活性，并将引起相同的免疫应答。可选择地，突变体可被设计致使蛋白的生物活性被改变。
包含于本发明范围内的多肽共价修饰的一种类型包括改变该多肽天然糖基化的模式。“改变天然糖基化的模式”为本发明目的指的是删除一个或多个发现于天然序列CD8多肽内的碳水化合物部分，和/或增加一个或多个天然多肽序列中不存在的糖基化位点。
向多肽上添加糖基化位点可通过改变其氨基酸序列来完成。这一改变，例如，可通过向天然氨基酸多肽添加、或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对O-连接的糖基化位点而言)来进行。氨基酸序列可任选地通过在DNA水平的改变而被改变，特别是通过在事先选择的碱基处突变编码多肽的DNA致使产生的密码子翻译成期望的氨基酸。
存在于多肽上的碳水化合物部分的去除可通过为充当糖基化目标的氨基酸残基编码的密码子的突变取代来实现。
一旦从其自然来源分离，如，包含于质粒或其它载体或作为线性的核酸片段从那里切除，重组的核酸可被进一步用作探针来识别和分离其它核酸。它也能被用作“前体”核酸来制备修饰的或变异的核酸和蛋白。它也能被连接到载体或其它送递载体来治疗本发明中所述的靶细胞。
基因治疗表达载体在本发明内容中，任何合适的基因治疗表达载体都能被使用。“载体”正如本领域那些技术人员所理解的术语那样，是一种用于基因转移的载体。根据本发明的载体包括，但不限于，质粒、噬菌体、病毒、脂质体，等等。根据本发明的表达载体优选包括额外的序列和突变。特别地，根据本发明的表达载体包括包含编码免疫调节分子，特别是本发明中定义的CD8α-链，的转基因的核酸，任选地进一步包含至少一个编码目标治疗性分子的另外的转基因。核酸可包含全部或部分合成制备的编码或其它遗传序列或基因组或互补DNA(cDNA)序列，并能以DNA或RNA的形式被提供。
转基因和/或编码免疫调节的和/或治疗性分子的基因能被转移至病毒载体或从病毒载体移除，或转移入杆状病毒或合适的原核或真核表达载体用于表达mRNA并产生蛋白质，以及用于其它生化性质的评价。
在根据本发明的载体(包括重组腺病毒载体和转移载体)的生产方面，这些载体能使用标准的分子和遗传技术，如本领域技术人员公知的那些来构建。包含病毒体或病毒粒子(如，重组腺病毒载体)的载体能使用适当的细胞系内的病毒载体来制备。类似地，包含一个或多个嵌合外壳蛋白的粒子能在标准细胞系中被制备，如目前被用于腺病毒载体的那些。如果期望的话，这些得到的粒子能靶向特定的细胞。
能使用任何合适的表达载体(如，描述于in Pouwels et al.，CloningvectorsA Laboratory Manual(Elsevior，N.Y.1985)和相应的合适的寄主细胞在寄主细胞内生产重组多肽或蛋白。表达寄主细胞包括，但不限于，在埃希氏菌属、杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属之内的细菌种，哺乳动物或昆虫寄主细胞系统，包括杆状病毒系统(如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47(1988))中描述)，和建立的细胞系，例如COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK，等等。一个用于制备根据本发明的嵌合蛋白(肽)的特别优选的表达系统是杆状病毒表达系统，其中使用了粉夜蛾属(Trichoplusia)ni，Tn 5B 1-4昆虫细胞，或其它合适的昆虫细胞，来生产高水平重组蛋白。本领域普通技术人员当然意识到表达寄主的选择对生产的肽的类型来说具有影响(ramification)。例如，在酵母或哺乳动物细胞(如，COS-7细胞)内生产的肽的糖基化将不同于在细菌细胞，如大肠杆菌内生产的肽的糖基化。
在一优选的具体实例中，蛋白在哺乳动物细胞中被表达。哺乳动物表达系统是本领域公知的，并包括逆转录病毒系统。哺乳动物启动子是任何能结合哺乳动物RNA聚合酶并起始蛋白编码序列下游(3’)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有转录起始区域，该起始区域通常被置于接近编码序列的5’端，和一个TATA盒，使用位于转录起始位点的上游的25-30个碱基对。该TATA盒被认为指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子还包括一个上游启动子元件(增强子元件)，典型地位于TATA盒的上游100-200碱基对内。上游启动子元件决定转录被起始的速率并还能作用于任一方向。特定用作哺乳动物的启动子是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因通常高表达并具有广泛的寄主范围。实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子，和CMV启动子。
典型地，被哺乳动物细胞识别的转录终止和多聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3’的调节区域并因此，与启动子元件一起，位于编码序列侧面。成熟mRNA的3’末端通过位点特异性翻译后切割以及多聚腺苷酸化形成。转录终止子的例子和多聚腺苷酸化信号包括来源于SV40的那些。
向哺乳动物寄主，以及其它寄主中导入外源核酸的方法是本领域公知的，并且随着所使用的寄主细胞而不同。这些技术包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、长链烃介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒感染、多核苷酸在脂质体内的包装、和向核内直接显微注射DNA。
蛋白也可使用本领域公知的技术被制成融合蛋白。因此，例如蛋白也可被制成融合蛋白以提高表达，或出于其它原因。例如，当蛋白是肽的时候，编码该肽的核酸可被连接到其它核酸用于表达目的。
为检验CD8，该蛋白在表达后被纯化或分离。根据样品中存在什么样的其它成分，能以本领域技术人员已知的多种方式来分离或纯化蛋白。标准的纯化方法包括电泳的、分子的、免疫的和色谱的技术，包括离子交换、疏水的、亲合的、和反相HPLC层析，以及层析聚焦。例如，能使用标准的抗-CD8抗体柱来纯化CD8蛋白。与蛋白浓度相关的超滤和渗滤技术也是有用的。对于合适的纯化技术的普遍指导，见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)。所需的纯化程度将根据CD8蛋白的使用而不同。在一些例子中无需纯化。在一些例子中在细胞表面检测CD8表达，例如通过抗体结合和通过荧光或荧光激活的细胞分类术(FACS)检测。
编码CD8的核酸分子以及任何来源于CD8核酸分子的编码或非编码链的核酸分子能以多种本领域公知的和常规使用的方式与靶中的细胞接触，其中该接触可以是回体或体内。
病毒吸附，侵入和基因表达可通过使用包含插入目标的腺病毒载体产生表达如β-半乳糖糖苷酶的感兴趣蛋白或RNA和标记基因的重组病毒作初始评估。在感染了含有β-半乳糖糖苷酶基因(Ad-LacZ)的腺病毒的细胞中的β-半乳糖糖苷酶表达可在早达细胞加入Ad-Gluc后两小时内检测到。该程序提供了一种迅速有效的重组病毒的细胞侵入和基因表达的分析手段，本领域普通技术人员使用常规技术手段就容易实施。
使用本发明编码蛋白的核酸，可制备多种表达载体。表达载体可以是自我复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。通常地，这些表达载体包括可操作地连接至编码蛋白的核酸的转录和翻译调控核酸。术语“控制序列”涉及在特定宿主机体内对可操作地连接的编码序列的表达必需的DNA序列。适合原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子，多聚腺苷酸化信号和增强子。
核酸与另一个核酸序列处于功能性关系时是“可操作地连接”。例如，前序列或分泌前导的DNA如果作为参与多肽分泌的前蛋白而表达，则与多肽的DNA可操作地连接；启动子或增强子如果影响了序列的转录，则与编码序列可操作地连接；或者核糖体结合位点如果处于有利于翻译的位置，则与编码序列可操作地连接。作为另一个例子，可操作地连接涉及连接DNA序列以使其相邻，并且在分泌前导的情况中，相邻并且在阅读相中。然而，增强子不一定是相邻的。连接通过在方便的限制性位点的连接完成。如果这样的位点不存在，根据常规惯例使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。转录和翻译调控核酸通常适合于用于表达CD8的宿主细胞；例如，人转录和翻译调控核酸序列优选用于在人细胞中表达CD8。用于各种类型宿主细胞的多种类型的合适表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。
一般而言，转录和翻译调控序列可包括，但是不限于，启动子序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。在优选实施方案中，调控序列包括启动子和转录起始和终止序列。
启动子序列编码组成型或诱导型启动子。启动子可是天然存在的启动子或杂交的启动子。结合多于一个启动子的元件的杂交启动子也是本领域公知的，在本发明中是有用的。
另外，表达载体可包括附加元件。例如，表达载体可有两个复制系统，因而使其在两种机体内维持，例如在用于表达的哺乳动物或昆虫的细胞与用于克隆和扩增的原核宿主。此外，对于整合表达载体，表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选与表达构建体侧邻的两个同源序列。整合载体可通过选择在载体中包含合适的同源序列而定位于宿主细胞中的特异位点。用于整合载体的构建物是本领域公知的。
在另一实施方案中，表达载体可包含便于转化的宿主细胞筛选的选择性标记基因。选择性基因是本领域公知的且会随使用的宿主细胞而不同。
优选地，载体是病毒载体，比如腺病毒载体，腺伴随病毒载体，疱疹病毒载体或逆转录病毒载体以及其它载体等。最优选地，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可来源于任何腺病毒。“腺病毒”是腺病毒科的任何病毒，期望是哺乳动物腺病毒属(如哺乳动物腺病毒)或禽腺病毒属(如禽腺病毒)。腺病毒可以是任何血清型。作为腺病毒来源使用的腺病毒原液可从腺病毒血清型1-47扩增，其通常从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)获得，或从由任何其它来源获得的任何其它腺病毒血清型扩增。例如，腺病毒可是亚群A(如血清型12，18和31)，亚群B(如血清型3，7，11，14，16，21，34和35)，亚群C(如血清型1，2，5和6)，亚群D(如血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39和42-47)，亚群E(血清型4)，亚群F(血清型40和41)或任何其它腺病毒血清型。然而，优选的腺病毒是血清型2，5或9。期望地，腺病毒包含相同血清型的外壳蛋白(如五邻体基元，六邻体和/或尾丝)。然而，也是优选地，一个或多个外壳蛋白在某种意义上可是嵌合的，例如所有或部分特定外壳蛋白可来自另一血清型。
虽然病毒载体，优选腺病毒载体，可以是具有复制能力的，优选病毒载体是复制缺陷型或条件复制缺陷型。例如，优选是腺病毒载体的载体，包含具有至少一个使病毒复制缺陷的修饰的基因组。病毒基因组的修饰包括，但不限于，DNA片段的缺失，DNA片段的插入，DNA片段的重排，DNA片段的替换或DNA损伤的引入。DNA片段可小到一个核苷酸，或大到36千碱基对，即腺病毒基因组的大致大小，或38千碱基对，其为腺病毒病毒体可包装的最大量。
病毒，特别是腺病毒基因组的优选修饰，除了使病毒复制缺陷的修饰外，还包括如这里所述的编码免疫调节分子的转基因的插入，和附加优选地，至少一个编码目标治疗性分子的转基因。病毒，例如腺病毒，也优选共合体，即病毒，如腺病毒基因组序列与其它序列，比如质粒，噬菌体或其它病毒的连接。
就腺病毒载体而言(特别是复制缺陷型腺病毒载体)，这样的载体可包括完整的衣壳(即包含病毒基因组，如腺病毒基因组)或空衣壳(即其中缺少病毒基因组或被降解，如通过被物理或化学的方法)。优选地，病毒载体包括完整的衣壳，即作为携带编码免疫调节分子的转基因的工具，任选地和优选地，至少一种编码抑制手段的转基因。可选地，优选地，转基因可插入腺病毒衣壳外的细胞中。
从优选或期望将病毒，比如腺病毒靶向特定细胞上来说，病毒在转移入质粒DNA的细胞中而言基本上是作为内含体溶解(endosomolytic)剂使用，其含有标记基因且被与细胞结合配体，比如运铁蛋白共价连接的多聚赖氨酸复合和浓缩(Cotton等，PNAS(USA)，89，6094-6098(1992)；和Curiel等，PNAS(USA)，88，8850-8854(1991))。已证明转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNA复合体和腺病毒的偶联(例如通过腺病毒导向的抗体的方式，用转谷氨酰胺酶，或通过生物素/链霉亲和素桥接)充分地增强了基因的转移(Wagner等，PNAS(USA)，89，6099-6103(1992))。
可选地，一个或多个病毒外壳蛋白，比如腺病毒尾丝，可被修饰，例如通过加入细胞-表面受体的配体序列或允许结合双特异抗体(即一个末端具有尾丝特异性和另一个末端具有细胞-表面受体特异性的分子)的序列(PCT国际专利申请号WO95/26412(’412申请)和Watkin等，″TargetingAdenovirus-Mediated Gene Delivery with Recombinant Antibodies，″摘要.No.336)。在两个例子中，消除了典型尾丝/细胞-表面受体的相互作用，因此病毒，比如腺病毒，通过它的尾丝再次定向新的细胞-表面受体。
可选地，能够特异性结合指定细胞类型的靶向元件，可与高亲和结合对的第一个分子偶联并引入宿主细胞(PCT国际专利申请号WO95/31566)。然后，与高亲和结合对的第二个分子偶联的基因送递载体被给予宿主细胞，其中第二个分子能够特异性结合第一个分子，这样基因送递载体靶向于指定细胞类型。
沿同一思路，既然以它们的核酸序列形式(即RNA或DNA)转移病毒，质粒和噬菌体的方法(如电穿孔，转化，三亲接合的偶联，(共)转染，(共)感染，膜融合，使用微粒，用磷酸钙-DNA沉淀孵育，直接显微注射等)是可得的，在没有任何相关蛋白比如衣壳蛋白和任何包膜脂质时，载体同样地可包含RNA或DNA。
类似地，由于脂质体通过与细胞膜融合影响细胞侵入，载体可包含带有编码外壳蛋白的组成型核酸的脂质体。这种脂质体可从例如LifeTechnologies，Bethesda，Md.购买获得，并可按照生产商的介绍使用。此外，脂质体可用于影响基因送递，并可使用具有增加的转移容量和/或降低的体内毒性的脂质体。可溶性嵌合外壳蛋白(如此处描述的方法生产)可按照生产商的说明在脂质体制备后，或者在脂质体制备过程中，加到脂质体中。
根据本发明的载体不限于本发明方法中使用的那些，也包括基因转移载体构建中使用的中间型载体(如“转移载体”)。
用于体内送递一种或多种核酸序列的优选方法之一涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”表示包括含有足以(a)支持构建物的包装(b)在有义或反义方向上表达已克隆于其内的多核苷酸的腺病毒序列的那些构建物。当然，在反义构建物的情况下，表达不需要合成基因产物。
表达载体包括腺病毒的遗传工程形式。对36kb，线性，双链DNA病毒腺病毒遗传结构的了解，允许用最长7kb的外源序列替换大片段腺病毒的DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA以不具有潜在遗传毒性的游离方式复制。而且，腺病毒结构稳定，大量扩增后没有发现基因组重排。腺病毒可感染事实上所有的上皮细胞而不考虑它们的细胞周期阶段。到目前为止，腺病毒感染似乎只与缓和的疾病比如人类急性呼吸疾病相关。
腺病毒特别适合用作基因转移载体，因为它有中等大小的基因，易于操作，高滴度，宽的靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两个末端都含有100-200bp的反向重复序列(ITRs)，其中cis元件对病毒的DNA复制和包装是必要的。基因组的早期(E)区和晚期(L)区含有以病毒DNA复制的起始划分的不同转录单元。E1区(E1A和E1B)编码负责病毒基因组转录调控几个细胞基因的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达导致了病毒DNA复制蛋白的合成。这些蛋白涉及DNA复制，晚期基因表达和宿主细胞的关闭(shut-off)(Renan，1990)。晚期基因的产物，包括大部分病毒衣壳蛋白，仅在由主要晚期启动子(MLP)引起的单个初级转录子的有效加工后才被表达。MLP(位于16.8mu)在感染晚期阶段尤其有效，而且所有由该启动子引起的mRNA′s拥有使它们作为优先翻译mRNA′s的5′-三联前导(TPL)序列。
在通常体系中，重组腺病毒通过穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组产生。由于两个前病毒载体之间存在重组的可能性，野生型腺病毒可通过这一过程产生。因此，从一个单个噬菌斑中分离出病毒的单克隆并检测它的基因组结构是非常重要的。
复制缺陷型腺病毒载体的产生和繁殖依赖于独特的辅助细胞系。实际上，腺病毒可包装约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等1987)，提供容量约为额外2kB的DNA。结合E1和E3区中可取代的约5.5kB的DNA，通常腺病毒载体的最大容量低于7.5kB或约载体全长的15％。载体的骨架中保留了大于80％的腺病毒基因组，它们是载体产生细胞毒性的根源。而且，E1-缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。例如已观察到通常可得的载体在高感染复数(multiplicities of infection)(MOI)时出现了病毒基因表达的渗漏(Mulligan，1993)。
辅助细胞系可来源于人细胞比如人胚肾细胞，肌细胞，造血细胞，或其它人胚间充质或上皮细胞。可选地，辅助细胞可来源于其它与人腺病毒相容的哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括，比如Vero细胞或其它猴胚间充质或上皮细胞。如上所述，通常优选的辅助细胞系是293。
最近，Racher等(1995)公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一种模式中，通过将单个细胞接种到1升含有100-200ml培养基的硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中培养天然的细胞集合物。以40rpm搅拌后，细胞的活力用台盼蓝作估计。在另一方法中，使用了Fibra-Cel微载体(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)，如下所述。将重悬于5ml培养基中的细胞接种体加到250ml的Erlenmeyer瓶中的载体(50ml)上，保持静止并偶尔振荡1-4h。然后用50ml新鲜培养基替换，并开始摇动。为了生产病毒，让细胞长到约80％满板，此后换培养基(至终体积的25％)和以0.05的MOI加入腺病毒。培养物静置过夜，接着体积增加到100％，再开始摇动72h。
在一优选实施方案中，腺病毒是本领域已知的“无活力”腺病毒。“无活力”腺病毒载体是最近研制的用于腺病毒基因送递的体系。腺病毒复制需要辅助病毒和表达E1a和Cre的专门人类293细胞系，这是在天然环境中没有的条件。在目前为止最有效的体系中，使用具有与噬菌体P1 loxP位点侧邻(″floxed″)侧邻的包装信号的E1-缺失的辅助病毒。表达Cre重组酶的辅助细胞被无活力病毒和具有floxed包装信号的辅助病毒共同感染后应该只产生无活力rAV，因为包装信号从辅助病毒的DNA中缺失了。然而，如果使用基于293的辅助细胞，辅助病毒DNA可与整合进辅助细胞DNA的Ad5DNA发生重组。结果恢复了野生型包装信号和E1区。因而，如果使用了E1-缺失的辅助病毒，基于293(或911)的辅助细胞的无活力rAV生产也可能导致产生RCA。
该载体丧失了所有的病毒基因。因而，载体是非免疫原性的，如果需要可反复使用。“无活力”腺病毒载体也含有36kb用于容纳转基因的空间，因而允许向细胞中共送递大量基因。特异性序列基元，比如RGD基序可插入腺病毒载体的H-I环中以增强它的感染力。通过将特异性转基因或转基因的片段克隆进任何如这里所述的和本领域已知的腺病毒载体中，构建了腺病毒重组体。腺病毒重组体可以非入侵的模式作为免疫试剂用于转导脊椎动物的表皮细胞。
“无活力”腺病毒的使用对插入大片段异源DNA特别有利(见综述，Yeh.和Perricaudet，FASEB J.11615(1997))，此处引用作为参考。此外，无活力腺病毒载体及其制造和使用它们的方法在U.S.专利号6,156,497和6,228,646中有更详细的描述，此处都专门引用作为参考。
除了需要腺病毒载体是复制缺陷型或至少条件缺陷型外，腺病毒的性质对本发明的成功实施不是关键的。腺病毒可是已知的42种不同的血清型或亚群A-F中的一种。为了获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒载体，亚群C的腺病毒5型被作为优选起始材料，这是由于腺病毒5型是人类腺病毒，其大量生化和遗传信息已知，而且史上已用于使用腺病毒作为载体的大部分构建方法中。
如上所述，根据本发明的典型载体是复制缺陷型，并没有腺病毒E1区。因而，最方便在除去E1-编码序列的位置中引入编码免疫调节分子和/或附加的目标治疗性蛋白的转基因。然而，表达构建物在腺病毒序列中的插入位置对本发明不是关键的。目标转基因也可如Karlsson等(1986)所述插入，以代替E3置换载体的缺失的E3区中，或者插入由辅助细胞系或辅助病毒互补E4缺陷的E4区中。
腺病毒易于生长和操作，在体外和体内都有广泛的宿主范围。该组病毒可以高滴度获得，如每毫升109-1011噬菌斑形成单位，而且它们是高感染性的。腺病毒的细胞周期不需要整合到宿主细胞基因组中。腺病毒载体送递的外源基因是游离型的，因此对宿主细胞的遗传毒性低。在用野生型腺病毒接种疫苗的研究中没有报道过副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，表明了它们的安全性和作为体内基因转移载体的治疗潜力。
腺病毒载体已被用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗研制(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，动物研究表明重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。向不同组织给予重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992)，，肌肉注射(Ragot等.，1993)，外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)和脑内趋实体(stereotactic)接种(Le Gal La Salle等，1993)。
因此，在优选实施方案中，这里使用的表达载体是腺病毒载体。合适的腺病毒载体包括人腺病毒比如Ad2或Ad5的修饰，其中对病毒在体内复制所需的遗传元件已被除去；如E1区，和编码插入到腺病毒基因组中的目标外源基因的表达盒。
此外，如上所述，优选的表达载体系统是逆转录病毒载体系统，比如PCT/US97/01019和PCT/US97/01048中所一般描述，它们此处都专门引用作为参考。
逆转录病毒是单链RNA病毒组，其特征是在感染细胞内通过逆转录过程将它们的RNA转化成双链DNA的能力(Coffin，1990)。产生的DNA然后作为前病毒稳定地整合进细胞染色体中，指导病毒蛋白的合成。整合导致了病毒基因组序列在受体细胞及其子代中的维持。逆转录病毒基因组含有三个基因，gag，pol和env，分别编码衣壳蛋白，聚合酶和包膜成分。在gag基因上游发现的序列含有将基因组包装进病毒体的信号。两个长末端重复(LTR)序列位于病毒基因组的5′和3′末端。它们含有强启动子和增强子序列并且对整合进宿主细胞基因中也是需要的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，编码一个或多个目标寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸被插入病毒基因组中，取代某些病毒序列以生产复制缺陷型病毒。为了生产病毒体，构建了含有gag，pol和env基因但是没有LTR和包装组份的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起共同引入这一细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录子包装进病毒体中，其然后被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛的细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等，1975)。
最近研制了一种设计来使逆转录病毒载体特异靶向的新方法，是基于通过化学添加乳糖残基至病毒包膜而对逆转录病毒进行化学修饰。这种修饰能够允许通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
一种不同的重组逆转录病毒靶向的方法被设计，其中使用抗逆转录包膜蛋白和抗特异性细胞受体的生物素化的抗体。该抗体使用链霉亲和素通过生物素组分偶联(Roux等，1989)。使用抗主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，它们用嗜亲性病毒在体外证明了携带那些表面抗原的多种人细胞的感染(Roux等，1989)。合适的逆转录病毒载体包括LNL6，LXSN和LNCX(见Byun等，Gene Ther.3(9)780-8(1996综述)。
AAV(Ridgeway，1988；Hermonat和Muzycska，1984)是一种细小病毒，由于腺病毒原液的污染而被发现。它是一种与任何疾病无关普遍存在的病毒(85％的美国人群中存在它的抗体)。它也可归为依赖病毒属，因为它的复制依赖辅助病毒的存在，比如腺病毒。已分离五种血清型，其中AAV-2的特征研究得最清楚。AAV具有单链线状DNA，其被衣壳蛋白VP1，VP2和VP3包裹形成了直径为20-24nm的二十面的病毒体(Muzyczka和McLaughlin，1988)。
AAV的DNA约为4.7kb长。它含有两个开放阅读框架，侧翼是两个ITR。AAV基因组有两个主要的基因rep和cap。rep基因编码负责病毒复制的蛋白，而cap编码衣壳蛋白VP1-3。每个ITR形成T形的发夹结构。这些重复序列是AAV染色体整合唯一必要的cis组分。因此，AAV可作为载体，其除去了所有的病毒编码序列且被基因送递盒取代。已鉴定了三个病毒启动子，根据它们的作图位置命名为p5，p19和p40。p5和p19的转录导致了rep蛋白的产生，p40的转录导致了衣壳蛋白的产生(Hermonat和Muzyczka，1984)。
AAV由于它的安全性，也是送递载体的良好选择。它存在一个相对复杂的拯救(rescue)机制为了活动化(mobilize)rAAV，不仅需要野生型腺病毒，而且也需要AAV基因。同样，AAV是非致病性的，并不与任何疾病相关。除去了病毒编码序列将针对病毒基因表达的免疫应答减到最小，因此rAAV不会引起炎症反应。美国专利号6,531,456公开了其它的AAV相关内容，此处专门引用作为参考。
其它病毒载体也可作为用于本发明向宿主细胞送递免疫调节分子的表达载体使用。可使用来源于病毒的载体，比如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Coupar等，1988)，慢病毒，脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒。它们为多种哺乳动物细胞提供几个有利的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
表达载体的送递为了影响免疫调节分子(如CD8α-链)和/或附加治疗性蛋白的表达，表达载体必须送递到细胞内。这种送递可在体外完成，如用于转化细胞系的实验室程序，或在体内或回体，如某些疾病状态的治疗中。如上所述，送递的一个优选机制是通过感染，其中核酸被包裹进重组病毒颗粒中。
一旦表达载体已送递到细胞中，编码期望寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸会在不同的位置定位并且表达。在某些实施方案中，编码构建体的核酸可稳定地整合进细胞的基因组中。这种整合可通过同源重组(基因取代)特异性定位和定向，或者整合入随机、非特异性位置(基因增强)。在进一步和优选实施方案中，核酸可作为分离的，游离型DNA片段在细胞中稳定地维持。这些核酸片段或“游离体”编码足以允许不依赖或同步于宿主细胞周期的维持和复制的序列。如何将表达构建体送递给细胞以及核酸保留在细胞中的何处取决于使用表达载体的类型。
在本发明某些实施方案中，表达载体可仅由裸露重组DNA或质粒组成。载体的转移可通过上述提到的任何物理或化学的渗透细胞膜的方法来完成。这特别适用于体外转移，但是也可用于体内转移。Dubensky等(1984)成功地将多瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝脏和脾脏中，证明了活性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也证明了腹膜内直接注射磷酸钙沉淀的质粒导致了感染性基因的表达。可以想象编码目标基因的DNA也可在体内以类似方式转移和表达基因产物。
本发明中用于将裸露DNA表达构建体转移到细胞中的另一实施方案可涉及质粒轰击。这一方法依赖于让DNA包裹的微粒加速到高速度以使它们穿过细胞膜并且没有被破坏地进入细胞的能力(Klein等，1987)。已经研制了一些用于加速小粒子的装置。一个这样的装置依赖于高压放电以产生电流，其随后提供动力(Yang等，1990)。使用的微粒通常由生物学惰性物质比如钨或金珠组成。
挑选的器官包括大鼠和小鼠的肝脏、皮肤和肌肉组织，其已用于体内轰击(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能需要手术暴露组织或细胞，以消除基因枪和靶器官之间的任何障碍组织，即回体的处理。此外，编码特定基因的DNA可通过这种方法送递，也被本发明引用。
在本发明的一个实施方案中，核酸分子通过脂质体介导的核酸转移引入靶细胞中。在这方面，许多基于脂质体的试剂是本领域公知的，可购买获得，可在将核酸分子引入靶细胞时常规使用。本发明的某些实施方案使用了阳离子脂质转移载体，比如Lipofectamine或Lipofectin(LifeTechnologies)，溶于阳离子胆固醇衍生物(DC胆固醇)中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(Sioud等，J.Mol.Biol.242831-835(1991))，DOSPADOPE，DOTAP，DMRIE胆固醇，DDABDOPE等等。生产脂质体包封的核酸是本领域公知的，典型的涉及脂质和核酸以比例约为1∶1结合。
本发明的用途如上详述，这里描述和实施的方法和组合物具有预防针对用于如基因治疗程序中的表达载体的宿主免疫应答的通用性。就是说，大部分基因治疗程序遇到的普遍问题是针对载体相关抗原的宿主免疫应答。然而，根据本发明，通过在基因治疗载体中引入编码主题(subject)CD8多肽的核酸克服了这个问题。就是说，使用包含编码目标治疗性分子以及CD8多肽的核酸序列的嵌合载体。结果是CD8多肽和载体相关抗原在细胞表面上共同表达，从而有效和特异地抑制了针对载体相关抗原，比如腺病毒载体中病毒外壳蛋白的宿主免疫应答。就是说，当病毒蛋白和CD8在同一细胞中表达时，CD8使感染的细胞抑制了宿主免疫应答，从而延长了使用基因治疗载体治疗的时间。
没有被理论所束缚，我们认为CD8在靶细胞上的表达赋予了靶细胞诱导对宿主免疫系统的“否决效应”的能力。就是说，如上所述，当表达CD8的细胞和宿主T细胞接触时，T细胞被下调或者杀死。因此，“否决效应”或“传统否决”是指靶细胞下调针对靶细胞的免疫应答的能力。我们认为CD8分子对否决效应的诱导或转移是必要的。“否决效应的转移”是指否决效应向正常不会诱导否决效应的细胞的转移。就是说，通过CD8诱导的或增加的表达赋予了靶细胞减少或降低调节T细胞对靶细胞应答的能力。
因此，本发明发现了通过诱导否决效应减少针对基因治疗送递载体和/或靶细胞的免疫应答的用途。这导致了那些识别靶细胞的T细胞的下调和缺失(deletion)。同样地，这导致了体液免疫应答的减少。
本发明的表达载体还可用于体外。这样的载体在病毒清除和维持的研究中以及评价规避免疫应答手段的效率的方法中可作为研究工具。类似地，表达载体，优选重组表达载体，特别是病毒或腺病毒载体，其包含转基因和至少一个编码免疫调节分子的基因，可在体内使用。
体内传送包括，但是不限于向器官内直接注射，经导管或经其它灌注手段。核酸可用在接近靶器官的位置血管给药或系统给药。本领域普通技术人员会知道每种送递模式的优点和缺点。例如，直接注射会产生最大滴度的核酸，但是核酸在靶中的分布可能是不均匀的。在接近靶点处导入核酸通常会导致与器官的细胞有更多的接触，但是系统给药通常更简单些。
特别地，表达载体，比如本发明的重组腺病毒载体，通过向细胞送递正确的DNA，比如编码功能缺少或损害的DNA，可用于治疗许多疾病中任何一种。可治疗的疾病包括，例如癌症，如黑色素瘤或神经胶质瘤，囊性纤维化，遗传紊乱和病原感染，包括HIV感染。
共同未决的U.S.专利申请号No.XX中描述了特异性抑制同种免疫和自体免疫应答的主题组合物和方法的用途，它的内容在此全文应用作为参考。本发明方法和组合物的其它应用对本领域技术人员是显而易见的。
组合物和表达载体给药的方法本领域技术人员应当知道许多合适的给动物施用本发明的表达载体(特别是腺病毒载体)和抑制免疫应答的手段的方法(见例如Rosenfeld等，Science，252，431-434(1991)；Jaffe等，Clin.Res.，39(2)，302A(1991)；Rosenfeld等，Clin.Res.，39(2)，311A(1991)；Berkner，BioTechniques，6，616-629(1988))是可得的，而且虽然给药可使用多于一种路线，但是某一路线可能比另一种路线提供更直接和更有效的反应。用于施用表达载体和/或抑制免疫应答的手段的药学可接受的赋形剂也是本领域技术人员公知的，且容易获得。赋形剂的选择部分取决于施用表达载体所使用的特定方法和抑制免疫应答的手段。因此，本发明提供了一种组合物，其包含在合适载体中仅编码免疫调节蛋白(如CD8α-链)或还结合了转基因的表达载体，用于本发明的合适制剂有很多种。特别地，本发明提供了包含含有编码CD8α-链(或其功能性片段)的基因的表达载体及其载体的组合物。在优选实施方案中，表达载体还包括编码目标治疗性分子或蛋白的转基因。这样的组合物还可包括其它活性成分，比如治疗或预防剂和/或免疫抑制剂是本领域公知的。下面的方法和赋形剂只是例证，而无意限制。
适合口服给药的制剂可由下列组成(a)液体溶液，比如溶解在如水，盐或橘子汁的溶剂中的有效剂量的化合物；(b)胶囊，袋剂或片剂，每个含有预定量的活性成份，如固相的或颗粒的；(c)合适液体中的悬浮液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包括一种或多种乳糖，甘露醇，玉米淀粉，土豆淀粉，微晶纤维素，阿拉伯树胶，明胶，胶状二氧化硅，交联羧甲基纤维素钠，滑石，硬脂酸镁，硬脂酸和其他赋形剂，着色剂，稀释剂，缓冲剂，湿润剂，防腐剂，调味剂以及药学上相容的赋形剂。锭剂形式可在调味剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄芪树胶中包含活性成份，以及在惰性基质，比如明胶和甘油，乳剂，凝胶中包含活性成分的软锭剂，和除了含有活性成分之外还含有本领域公知的赋形剂。
气雾剂制剂可用于吸入给药。这些气雾剂制剂可置于加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气等。它们也可制成用于无压力制剂的药物，如在雾化器或喷雾器中。
适于肠胃外给药的制剂包括含水的和不含水的、等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和给制剂提供与针对的受体血液等压的溶质，以及含水的和不含水的无菌悬液，其可包含悬浮剂，增溶剂，增厚剂，稳定剂和防腐剂。制剂可装在单剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶，也可在冻干(冷冻干燥)条件下贮存，使用前只需要加入无菌的液体赋形剂，例如水就可马上用于注射。临时注射液和悬液可由先前所述种类的无菌粉末，颗粒和片剂制备。此外，栓剂可用多种基质，比如乳化基质或水溶性基质制备。适于阴道给药的制剂可以是含有除了活性成分之外还有本领域认为适宜的载体的阴道栓，棉塞，霜剂，胶剂，糊剂，泡剂或喷雾剂。
本发明中给予动物，特别是人的剂量随着目的治疗性转基因，载体来源和/或免疫调节分子的性质，使用的组合物，给药的方法和特定的位点以及治疗的生物而有所不同。然而，优选使用相应于载体(如根据本发明的腺病毒载体)的有效剂量。“有效剂量”是指足以在宿主中产生期望效应的剂量，其可使用本领域公知的几个终点来监测。例如，一种期望效应是核酸向宿主细胞的转移。这种转移可通过多种手段，包括但不限于，治疗效应(如一些与疾病，病症，紊乱或治疗的综合症相关的症状的缓和)，或通过证明转移的基因或编码序列或其在宿主内的表达(如使用多聚酶链反应，Northern或Southern杂交或转录分析或以检测宿主细胞内核酸，或使用免疫印迹分析，抗体介导的检测，或检测转移核酸编码的蛋白或多肽或由转移引起的水平或功能上的影响的详细分析)来监测。所述的方法不是囊括一切的方法，其它适于特殊应用的方法对本领域普通技术人员是显而易见的。关于这点，应当指出宿主对引入载体，如病毒载体，特别是腺病毒载体和编码抑制免疫应答的手段的载体的反应可依赖于施用病毒的剂量，送递的位点以及载体与转基因和抑制免疫应答的手段的遗传组成而变化。
一般而言，为了确保本发明载体的有效转移，优选每个细胞接触约1-5000拷贝的本发明载体，基于根据给药途径确定待接触的细胞大致数量，更优选约3-300pfu进入每个细胞。然而，这只是一个总的指导方针，并不排除根据特殊应用，在体外或体内使用更高或更低的剂量。同样地，抑制免疫应答的手段的剂量，如果是以包含蛋白的组合物形式，应该足以抑制包含转基因的重组载体引起的免疫应答。例如，实际剂量和时间安排可依赖于组合物的服用是否结合其它药物组合物，或依药学动力，药物倾向和代谢的个体差异而变化。同样地，体外应用的剂量可依赖于靶向细胞的特殊类型或载体转移的手段而变化。本领域技术人员根据特定情况的需要，容易做任何必要的调整。
虽然参考优选的实施方案对本发明作了描述，但是在不偏离本发明精神和范围的情况下，本领域技术人员会知道形式和细节上的变化。这里提到的每个专利，出版物和其它参考文献都全文专门引用作为参考。
实施例1否决效应——用载体进行的研究a)用质粒表达载体人工改造成纤维细胞以作为否决细胞成纤维细胞经人工改造在其表面表达人或小鼠CD8链。用pCMVhCD8质粒或pCMVmCD8质粒转染成纤维细胞，在质粒中CD8α-链的表达受CMV立即早期启动子/增强子(Invitrogen)的驱动。当CD8-链转染的成纤维细胞(H-2b)被加到混合的淋巴细胞培养物(BALB/c；H-2d抗-C57BL/6；H-2b)中后，仅表达CD8-链的细胞系抑制CTL应答。如图3A和B所示，表达小鼠或人CD8-链的MC57T成纤维细胞的加入完全抑制了CTL的诱导。相反，非转染成纤维细胞的加入不会影响T-淋巴细胞的激活。除了确定了CD8α-链的抑制功能外，这些实验也证明了小鼠T-淋巴细胞能够被人CD8α-链否决。因此，小鼠模型对检测设计用于临床用途的否决是有用的。
人工改造的否决细胞在体内的功能实验中确定了人工改造的否决是否在动物体内起作用。被转染以表达CD8α-链的C57BL/6(H-2b)-来源的成纤维细胞被注射到Balb/c(H-2d)小鼠中。对照动物用非转染的成纤维细胞注射。8-40天后收集脾脏细胞，并引入MLC培养物中C57BL/6(H-2b)脾细胞作为刺激物细胞。5天后，收集培养基，检测它们裂解EL4(C57BL/6，H-2b)靶细胞的能力。在注射了表达CD8-链的成纤维细胞的动物体内，抗-H-2bCTL应答的诱导完全被抑制了(图4)。抗-H-2bT细胞的抑制是高度特异性的。来自这些小鼠的T细胞对第三类H-2k异种-MHC(allo-MHC)分子仍产生应答。这些实验证实了，与传统否决细胞类似，人工改造的否决细胞在体内特异性抑制免疫应答，以及非经典否决细胞能够被人工改造成否决细胞。换句话说，人工改造的细胞使动物对这些细胞携带的抗原负免疫(negatively immunize)。
检测了CD8-链的表达是否干扰完全活化的T细胞的功能。为了此目的，用完全活化的CTL检测表达CD8α-链的靶细胞对裂解的易感性。为此研究，选择了两种不同的T细胞群MLC中激活的同种异体反应性CTL，和活化的肽特异性CTL。如图5所示，表达CD8α-链的靶细胞被同种异体反应性T细胞群体有效地裂解，但是不能被抗原特异性T细胞裂解。这些结果表明人工改造的否决甚至能够干预正在进行的抗原特异性免疫应答，比如自身免疫应答中的那些。
b)用病毒转移载体人工改造成纤维细胞作为否决细胞腺病毒转移载体m-CD8的否决功能研制了携带鼠CD8α-链的复制缺陷型载体腺病毒转移载体(mAdCD8α)。用mAdCDB否决转移载体感染的小鼠成纤维细胞(MC57)在第二天高水平地表达小鼠CD8α-链。在这些快速增殖的细胞内，小鼠CD8α-链的表达到第5天时显著减少。mAdCD8也感染其它小鼠细胞系，比如EL4，虽然效率低些(数据没有显示)。
在后面的实验中，mAdCD8α-感染的MC57成纤维细胞(H-2b)被加到Balb/C(H-2d)抗-C57B1/6(H-2b)MLC中。5天后，收获培养物，检测抗-H-2bCTL的存在。加入了感染的成纤维细胞的MLC中，不再含有抗-H-2bCTL(图12)。这些实验确定了否决转移载体介导免疫抑制的能力。
此外，生成了人CD8-型的腺病毒载体。还生成了表达小鼠CD8α-链的腺病毒伴随病毒。证实了这些病毒诱导各CD8链的表达。表达小鼠或人CD8α-链的腺病毒否决载体介导了杀伤T细胞的诱导的完全抑制(见图7)。
用mAdCD8否决转移载体负免疫设计了两个不同的实验以确定mAdCD8是否在体内抑制免疫应答。在第一个实验中，用等同剂量的mAdCD8否决转移载体或者相似的编码小鼠CD8α-链以代替β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(Adβgal)感染C57B1/6小鼠。免疫七天后，杀死动物。它们脾细胞的单个细胞悬液在Adβgal病毒存在的情况下培养五天。然后收集培养物，评估它们的增殖能力。如图7所示，从Adβgal免疫的小鼠收集的T细胞在有Adβgal时大量增殖，证明了高增殖性CD4+细胞的存在。相反，从mAdCD8-注射的动物收集的T细胞没有得到扩增。
在第二个步骤中，我们测试这些培养物中是否含有功能性CD8+CTL以检测它们裂解Adβgal-感染的靶细胞(EL4，H-2b)的能力。仅在建立自注射了Adβgal的小鼠的培养物中发现了CTL(图8)。第一个实验说明AdCD8α不诱导针对腺病毒抗原的应答可能是因为CD8α-链的表达。然而，AdCD8α不诱导免疫应答也可能是由于其它原因。AdCD8以某些未确定的方式是无功能的，或者小鼠可能只能与没有在mAdCD8中发现的β-半乳糖苷酶反应。
为了测试不同结论的正确性，C57Bl/6小鼠用mAdCD8或Adβgal注射一次后，7天后用Adβgal作第二次灌注。七天后杀死小鼠，建立Adβgal存在的情况下培养五天的脾细胞培养物。检测应答T细胞裂解Adβgal-感染的靶细胞的能力(图8)。确实，两次暴露于Adβgal中导致了免疫应答的提高。这些研究也表明了在注射AdCD8后，小鼠不再对Adβgal应答，并且Adβgal主要、虽然并非专门诱导针对两种载体中均具有的腺病毒蛋白的CTL应答。这组实验有力地暗示了生产能负免疫(negafively immunize)针对载体所携带基因的应答的基因治疗病毒载体是可能的。
通过否决抑制CD4+T淋巴细胞为了检测否决转移载体能否用于抑制诱导CD4+T淋巴细胞，建立了下面的实验体系。转化C57B1/6-来源的成纤维细胞刺激物以表达同种异体MHCII类分子(H-2Ek)和免疫刺激性CD80。用mAdCD8或者Adβgal转移载体转导这些非照射以保存它们全部刺激能力的慢速增殖成纤维细胞，然后加到未选择的C57B1/6脾细胞中。4天后，收集培养物，用表面免疫荧光分析活化的即blasting，CD4+T淋巴细胞存在(图9)。我们发现与正常或Adβgal-转导的刺激物细胞一起培养的未选择的C57B1/6脾细胞中有大量的CD4+T淋巴母细胞。相反，加入mAdCD8-感染的刺激物的培养物中，只检测到少量的CD4+T淋巴母细胞。这些研究证实了否决抑制了CD4+T淋巴细胞，而且此外病毒否决转移载体可用于此目的。
用不同病毒构建体感染后小鼠和人CD8α-链的表面表达染色程序mAdCD8在改良的IMDM中mAdCD8以约104的感染复数模拟感染或感染MC57T 3天。收获感染的细胞，用FITC直接标记的抗小鼠CD8α-链抗体(Pharmingen)用于CD8α-链的表面表达的染色。表面荧光的强度在荧光激活细胞分析仪(FACScan，Beckton-Dickinson)上测量(图10)。
从Balb/c小鼠股骨腔中收获骨髓细胞。在改良的IMDM中用表达β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(AdLacZ)或mAdCD8以104的感染复数感染细胞3天。收获感染的细胞，用FITC直接标记的抗小鼠CD8α-链抗体用于CD8α-链的表面表达的染色。测量表面荧光的强度(图10C)。此外，确定了几种细胞类型，包括CD34+骨髓细胞，即干细胞库内的细胞被有效转导(表2)。
hAdCD8模拟感染MC57T。hAdCD8的病毒滴度是未知的。用100μl病毒原液感染3×105个细胞3天。收获感染的细胞，用FITC直接标记的抗人CD8α-链抗体(Pharmingen)用于CD8α-链的表面表达的染色。表面荧光的强度在荧光激活细胞分析仪上测量(FACScan，Beckton-Dickinson)(图10)。
基于AAV的否决载体使用Strategene/Avigen体系平行生产基于AAV-否决载体。在这些构建体中，人和小鼠的CD8α-链受相同的CMV中间(intermediate)早期启动子/增强子的驱动。两种病毒，mAAVCD8和hAAVCD8在HEK 293包装细胞系中包装。使用的体系不需要辅助病毒。mAAVCD8和hAAVCD8有效感染小鼠成纤维细胞(MC57T)，分别驱动小鼠或人CD8α-链的高水平表达。荧光的强度在荧光激活细胞分析仪上测量(图10D)。有趣的是在转导后36小时内发现了CD8α-链的高水平表达。这个发现与其他人的观测结果形成了对比。他们发现AAV-驱动的基因表达需要几天时间才达到显著水平(PHSchmelck，PrimeBiotech)。用AAV否决载体进行的其它研究再次说明了我们先前的发现，即它们可用于抑制免疫应答。这里使用了标准的MCL程序(图6)。
实施例2体外抑制研究—混合的淋巴细胞培养物收集来自Balb/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠的脾细胞。制备单细胞悬液。C57BL/6脾细胞用3,000拉德(Mark1铯辐射器)照射。每孔4×106Balb/c脾细胞(应答子/效应子细胞)与每孔4×106经照射的C57BL/6脾细胞(刺激子细胞)在24孔平板(TPP，Midwest Scientific，Inc.)中共培养，其含有含10％胎牛血清(FCS)(Sigma)，HEPES，青霉素G，硫酸链霉素，硫酸庆大霉素，L-谷氨酰胺，2-巯基乙醇，非必需氨基酸(Sigma)，丙酮酸钠和碳酸氢钠的IMDM(Sigma)(改良的IMDM)。在CO2孵育箱(Forma Scientific)培养5天后，完整收获培养物，检测裂解C57BL/6-来源的靶细胞(H-2b)的能力。
在这些培养基中的一些中，加入4×105个已用12,000拉德照射的MC57T成纤维细胞(H-2d)。在抑制培养物中，包含4×105个已用mAdCD8以约104的感染复数感染1-2天的MC57T细胞。
细胞毒性T淋巴细胞杀伤分析计算从混合淋巴细胞培养物中收集的细胞用于胚细胞数，作为活化的T淋巴细胞的指示。这些效应子细胞加到U形-底的96孔平板的单孔中。每孔效应子数目用3倍滴定步骤测得，从每孔3×106or 1×105个效应子细胞开始。每孔1×104个EL4(H-2b)，MC57T(H-2b)或P815(H-2d)靶细胞被加到这些效应子细胞中。靶细胞先前已用51Cr(Na-Chromate，Perkin-Elmer)标记。1×106个靶细胞与100μCi在约为500μl体积的改良IMDM中孵育90分钟。然后，用改良IMDM多次清洗以除去未结合的51Cr。
效应子细胞和靶细胞以总体积200μl在CO2孵育箱孵育4小时。然后，平板用离心机(Centra CJ35R，International Equipment Company)以1,500转/分离心3分钟。从每孔除去100ml培养基，靶细胞释放的51Cr量用Model4000γ计数器(Beckman Instruments)计算。设立对照培养基，其中不加入效应子细胞以确定背景释放值。测定孔中结合入靶细胞的总51Cr，其中用1％(w/v)Triton×100溶液(Sigma)替代效应子细胞。
特异性裂解量测定为in％＝(特异性释放值-背景释放值)/(总释放值-背景释放值)×100mAdCD8的体外活性建立混合淋巴细胞培养物(Balb/c抗-C57BL/6)。向这些培养物中加入已用12,000拉德照射和用mAdCD8感染的MC57T成纤维细胞。培养5天后，收获培养物，以不同效应子/靶细胞(E/T)比率测试它们裂解EL4(H-2b)靶细胞的能力(见图4)。
正如所见到的，即使在混合的淋巴细胞培养物中，表达CD8的细胞抑制了裂解性T淋巴细胞的诱导。
mAdCD8和hAdCD8的生产借助Biogene的AdEasyTM系统生产两种腺病毒载体。这里小鼠和人CD8α-链cDNA掺入转移载体(步骤1)。在BJ5183EC细菌中完成用Ad5ΔE1/ΔE3载体重组(步骤2)。然后重组载体转移到含有可互补重组腺病毒缺失的这一必需区域的E1A和E1B腺病毒5病毒基因的QBI-HEK 293A细胞中。因此在这些细胞中生产的hAdCD8和mAdCD8是复制缺陷型的。
作为表达细菌LacZ基因(β-半乳糖苷酶)的对照载体，Qbiogene提供了QBI-Infect+病毒粒子(Ad5.CMVLacZΔE1/ΔE3)。使用小鼠的CD8α-链序列。
该序列与发表的小鼠序列类似蛋白序列真实序列MASPLTRFLSLNLLLMGESIILGSGEAKPQAPELRIFPKKMDAELGQKVDLVCEVLGSVSQGCSWLFQNSSSKLPQPTFVVYMASSHNKITWDEKLNSSKLFSAVRDTNNKYVLTLNKFSKENEGYYFCSVISNSVMYFSSVVPVLQKVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLD FACDIYIWAPLAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCPRPLVRQEGKP RPSEKIV所使用的人的CD8α-链序列。该序列如所示与发表的人序列相比有一个沉默突变真实序列MALPVTALLL PLALLLHAAR PSQFRVSPLDRTWNLGWTVELKCQVLLSNP TSGCSWLFQP RGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFS GKRLGDTFVL TLSDFRRENEGYYFCSALSN SIMYFSHFVPVFLPAKPTTT PAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGG AGNRRRVCKCPRPVVKSGDK PSLARYVpAAV-mCD8和pAAV-hCD8的生产借助Stratagene的AAV Helper-Free系统生产这些载体。该系统是通过将小鼠和人的序列插进pAAV-MCS克隆载体中而工作的。然后该质粒与辅助质粒(含有必要的腺病毒蛋白)和pAAV-RC载体(含有衣壳基因)共转染HEK293细胞以生产重组AAV粒子。
实施例3动物模型中的人工改造的否决我们研究了动物如何应答大剂量的mAdCD8注射。在第一组实验中，用等同剂量的mAdCD8或者编码β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(AdLacZ)静脉内注射Balb/c小鼠(每组两只小鼠)。七天后，杀死动物。它们的脾细胞在AdLacZ存在的情况下培养五天。然后测试它们裂解AdLacZ-感染的靶细胞(P815，Balb/c-来源的)能力。如图13所示，具有特异性裂解能力的CTL可以用AdLacZ免疫的Balb/c小鼠中增殖，但是在接受mAdCD8的小鼠中没有增殖。这个结果表明由于CD8α-链的表达，AdCD8α不诱导针对腺病毒抗原的免疫应答。
在第二个步骤中，C57B1/6小鼠用等同剂量的mAdCD8(2只小鼠)或AdLacZ(2只小鼠)免疫。免疫七天后，每组杀死一只动物。它们的脾细胞在AdLacZ存在下在细胞悬液中培养五天。然后检测它们特异性裂解AdLacZ-感染的靶细胞(EL-4，C57B1/6-来源的)能力。再一次地，虽然注射AdLacZ以低频率诱导了特异性杀伤细胞的发生，但是mAdCD8却没有做到这一点(图14)。
在这一实验的第二个阶段，已接受mAdCD8或AdLacZ的剩余C57BL/6小鼠在它们第一次注射病毒7天后，接受第二次剂量的AdLacZ。七天后，杀死小鼠，在AdLacZ存在下建立培养五天的脾细胞培养物。再次检测应答T细胞裂解AdLacZ-感染的EL4-靶细胞的能力(图8)。确实，两次暴露于AdLacZ中导致了免疫应答有所提高。然而，先前接受了mAdCD8的小鼠仍旧没有应答。这些实验表明AdCD8不仅没有诱导免疫应答，反而防止了针对它的免疫应答的诱导。因而，mAdCD8规避了免疫系统。
权利要求
1.一种多核苷酸，包含a)编码CD8α-链的第一核酸，所述第一核酸可操作地连接至编码跨膜多肽的核酸；和b)包含目标治疗性基因的第二核酸；和c)至少第一转录和翻译控制元件，所述元件用于指导所述第一和第二核酸的表达。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述编码CD8α-链的核酸与如图1所列编码人CD8α-链的核酸(SEQ ID NO)有大于80％的序列同一性。
3.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述编码CD8α-链的核酸与如图1所列编码小鼠、大鼠或猪的CD8α-链的核酸(SEQ ID NOS)有大于80％的序列同一性。
4.根据权利要求3的多核苷酸，其中所述编码CD8α-链的核酸包括如图1所列的小鼠、大鼠或猪的CD8α-链(SEQ ID NOS)。
5.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述CD8α-链包括选自图1 SEQID NO所示序列的序列。
6.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述CD8α-链缺少野生型CD8α-链的细胞内结构域。
7.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述目标治疗性基因选自血红蛋白-β，GATA-结合蛋白，δ-氨基乙酰丙酸合酶，葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶，凝血因子VIII，凝血因子XI，囊性纤维化跨膜传导调控子，鸟氨酸氨基甲酰转移酶，α-L-艾杜糖醛酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，β-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷神经酰胺酶，酸性α-葡萄糖苷酶，hexamidase A，苯丙氨酸羟化酶，IV型胶原，α5，布卢姆氏综合症基因产物或低密度脂蛋白受体。
8.根据权利要求1-7任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括载体。
9.根据权利要求8的多核苷酸，其中所述载体选自重组腺病毒，重组逆转录病毒，重组腺伴随病毒或重组疱疹病毒。
10.根据权利要求9的多核苷酸，其中所述载体是复制缺陷型。
11.包含根据权利要求1，2，3，4，5，6或7任一项的多核苷酸的组合物，还进一步包括脂质体。
12.降低针对来自基因治疗送递体系的抗原的免疫应答的方法，包括a)使细胞和所述基因治疗送递体系接触，其中所述基因治疗送递体系包括i)编码CD8α-链的第一核酸，所述第一核酸与编码跨膜多肽的核酸可操作地连接；和ii)包含目标治疗性基因的第二核酸；和iii)用于指导所述第一和第二核酸表达的至少第一转录和翻译控制元件，从而表达所述第一和第二核酸，所表达的CD8α-链与所述细胞的细胞膜相结合，并且针对所述细胞的宿主免疫应答与针对没有CD8α-链编码核酸的细胞的免疫应答相比降低。
13.根据权利要求12的方法，其中所述基因治疗送递体系选自病毒表达载体，质粒或裸露的核酸表达载体。
14.根据权利要求13的方法，其中所述病毒表达载体选自重组腺病毒，重组逆转录病毒，重组腺伴随病毒或重组疱疹病毒。
15.根据权利要求12的方法，其中所述目标治疗性基因选自血红蛋白-β，GATA-结合蛋白，δ-氨基乙酰丙酸合酶，葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶，凝血因子VIII，凝血因子XI，囊性纤维化跨膜传导调控子，鸟氨酸氨基甲酰转移酶，α-L-艾杜糖醛酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，β-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷神经酰胺酶，酸性α-葡萄糖苷酶，hexamidase A，苯丙氨酸羟化酶，IV型胶原，α5，布卢姆氏综合症基因产物或低密度脂蛋白受体。
16.根据权利要求12的方法，其中所述编码CD8α-链的核酸包括如图11所列的序列(SEQ ID NO)。
17.根据权利要求12的方法，其中所述编码CD8α-链的核酸编码具有如图10所列序列(SEQ ID NO)的蛋白。
全文摘要
本发明提供用于特异性抑制针对表达载体以及用该载体转染的靶细胞的寄主免疫应答的组合物和方法。特别描述了特异性抑制针对基于使用CD8α－链的载体相关抗原和靶细胞相关抗原的寄主免疫应答的体液和细胞成分的方法。
文档编号C12N15/67GK1791679SQ200480013970
公开日2006年6月21日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月19日
发明者齐岩, 张祥华, 葆拉·J·科尼格斯伯格 申请人:伊索格尼斯股份有限公司