表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体的制作方法

专利名称：表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体的制作方法
背景技术：
发明领域本发明通常涉及用于递送目的多肽至受试者的病毒样颗粒(VLPs)和编码其的核酸分子。特别地，本发明利用禽类嗜肝DNA病毒颗粒的特性产生稳定的重组VLPs，VLPs用于向受者递送目的多肽。所述目的多肽可包含一种或多种能引起免疫应答的抗原。包含所述目的多肽的VLPs用于将抗原递送至受试者的免疫系统或用于抗原决定部位呈递以在体外测定中检测抗体。本发明扩展至用于产生、生产、递送和监控本发明VLPs的质粒、细胞、试剂盒和方法。
现有技术描述在本说明书中由著者参考的文献的详细目录汇集于说明书的结束部分。
此处对于现有技术的引用(包括任何一个或多个现有技术文献)并不被认为承认或暗示所述现有技术是本领域状态的一部分。
嗜肝DNA病毒是有包膜DNA病毒家族。哺乳动物嗜肝DNA病毒例如B型肝炎病毒的装配非常复杂，并且成熟的病毒体是通过预先形成的细胞质核心颗粒与在宿主内质网(ER)膜上预先装配的表面蛋白的相互作用形成的。在与包膜蛋白的合适部分相互作用后，核壳与超过1000倍空的亚病毒颗(SVPs)一起出芽进入ER的腔中并在中间体前高尔基体区室中完成装配(由Nassal，M.的综述，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，214297-337，1996)。
在许多研究中，缺少核壳的病毒样颗粒(VLPs)已被证明是很有前景的候选疫苗，因为其(i)是非感染性的并因此对生产和应用是安全的，(ii)因为其提供抗原决定部位呈递的必需空间结构因此比亚单位疫苗更具免疫原性，和(iii)引起体液、细胞介导的和重要的粘膜免疫(Krueger等人，Biol.Chem.380275-276，1999)。
近来成功的VLP疫苗的例子(目前正在临床实验中)是重组的乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(L1)VLP，所述衣壳蛋白通过诱导强中和抗体应答预防感染(Frazer，Virus Research，89271-274，2002)。
B型肝炎病毒(HBV)亚病毒颗粒(HBsAg-S)已被看作产生重组VLPs的候选者。几个研究已考察了适合插入外源抗原决定部位的结构域(Bruss等人，EMBO J.132273-2279，1994.，1994；Delpeyroux等人，J.Mol.Biol.195343-350，1987)，所述结构域包括preS结构域的N端融合(Prange等人，J.Gen.Virol.762131-2140，1995)。
最近，携带E2包膜蛋白C型肝炎病毒(HCB)高变区1的小的35个氨基酸的插入物的颗粒已成功地引起了抗体反应(Netter等人，J.Virol.752130-2141，2001)，所述插入物插入至位于第二亲水环上的暴露的“a”决定簇。特别地，当颗粒在哺乳动物细胞体统中产生时存在着颗粒稳定性和所述HBsAg的‘a’决定簇的免疫反应性丢失所能容忍的插入片段大小的限制(Prange等，1995，同上述；Bruss等人，J.Virol.653813-3820，1991)。
近来通过在酵母中表达登革热病毒/HBsAg融合体已经克服了具有巨大融合物的颗粒的不稳定性(Bisht等人，J.Biotechnology.9997-110，2002)。
然而，在所有这些情况下，为了装配嵌合颗粒，重组S蛋白必须与野生型S亚单位一起装配。这些扩展的S链给包入至由所述HBsAg(包括L)形成的紧密的包膜网络中带来困难，因此它们的数目是受限的，并且对外源抗原决定部位产生的免疫应答较低。
因此，需要改进的有效地整合目的多肽的VLPs。
发明概述在整个本发明书和以下的权利要求中，除非上下文有另外要求，单词“包括”和变体“包含”及“含有”将被理解为表示包括所述的实体或步骤或成组的实体或步骤，但不排除任何其它的实体或步骤或成组的实体或步骤。
通过序列标识号(SEQ ID NO)表示核苷酸和氨基酸序列。SEQID Nos在数字上对应序列标志<400>1、<400>2等。表1提供了序列标志概述。在权利要求之后提供了序列表。
鸭B型肝炎病毒(DHBV)和其它禽类嗜肝DNA病毒的包膜蛋白由两种蛋白即大包膜蛋白(L)和小包膜蛋白(S)构成，包膜蛋白通过来自单个preS/S开放阅读框的不同框内翻译起始位点产生。L和S多肽具有共同的C端跨膜区或S结构域，而L具有大约160个氨基酸的包含受体结合区域的N端延伸(或preS结构域)。所述S多肽是主要的病毒包膜组成部分，其决定包膜的曲率并且甚至在核壳不存在的情况下可驱动颗粒分泌。相反地L多肽只能在与S共装配时被转运出去。
DHBV包膜蛋白的装配和其涉及进入宿主细胞与由嗜肝DNA病毒采用的独特的拓扑学转换紧密相关，其中L蛋白的大N端preS结构域是在翻译后被转运跨越ER膜的。该过程是受调控的，这样通常只有大约50％的分子具有转运的N末端并且成熟的颗粒含有混合的内部/外部拓扑结构，包括部分转运的或中间体形式。
本发明部分根据下列惊人的发现DHBV的L多肽的大部分区域对于L转运和颗粒装配是无关紧要的，包括在S结构中与颗粒装配所必需的S多肽的区域具有相同氨基酸序列的区域。因此，L多肽在其颗粒结合上比S多肽更加灵活并因此可进行更广泛的操作。
因此本发明提供了主要包含小包膜(S)多肽或其功能衍生物或同源物的病毒样颗粒(VLPs)。此外，并且根据本发明，其包含含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽。因为L多肽在VLP装配期间不被排除并且因为其可在不会显著地影响颗粒稳定性的情况下被广泛地应用于运载异源多肽，本发明的VLP在递送目的多肽至受试者方面尤其有用。此外，由于抗原性POI的抗原决定部位被有效地展现于VLP中，所述VLPs可用于检测抗体的测定中。
本发明对DHBV进行特别的描述，但是本发明也扩展至来自其它具有L和S包膜多肽蛋白的病毒的L和S多肽，其中L不会从颗粒装配中被排除。例如，也涉及来自其它禽类嗜肝DNA病毒的L和S多肽，包括例如但不限于苍鹭(HHBV)、雪雁(SGHBV)和与DHBV表现相似亚颗粒形态学即具有L和S包膜蛋白的嗜肝DNA病毒。在所有嗜肝DNA病毒中L和S多肽的S结构域高度保守，例如在TM1和TM2之间的区域表现出高达70％的氨基酸相似性。
本发明提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含i)包含目的多肽和至少禽类嗜肝DNA病毒的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的多肽，和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
本发明进一步提供病毒样颗粒(VLP)，其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
通过将一个或多个POIs引入L多肽，所述POI与L一起被转运入主要由S多肽构成的颗粒结构中。
尽管提供了几个L多肽颗粒结合部分的例子，但根据此处提供的教导，产生更小或更大的L多肽部分和确定其与目的异源(或内源)蛋白一起是否能在VLP内结合成颗粒在本领域普通技术人员的技术范围之内。因此，本发明绝不受限于作为示例的构建体。
本发明的病毒样颗粒用于疫苗组合物以提高有效的免疫应答。在特定的实施方案中，所述病毒样颗粒具有有利地被抗原呈递细胞例如树突细胞吸收的合适大小。例如，DHBV VLPs显著大于哺乳动物的HBVVLPs。
使用包含编码与S多肽分开地或一起的重组L多肽的核酸分子的表达质粒制备本发明的重组VLPs。表达质粒以便利地适合于在酵母、杆状病毒或禽类或哺乳动物的表达系统中表达的形式存在。包含编码本发明重组L多肽的的核酸分子的质粒也可用于将核酸构建体直接递送至受试者的细胞中。
可选择地，提供试剂盒以帮助本发明融合蛋白的重组生产。
本发明进一步提供了用于产生重组病毒样颗粒和包含来自禽类嗜肝DNA病毒或其它非L排除病毒的L和S多肽的病毒样颗粒的组合物以用作疫苗或抗原资源的方法，其中所述L多肽包含一个或多个来源于一个或多个异源来源的目的抗原。
附图概述

图1是用于产生pCDL-E2.465的克隆策略的概述。
图2A是DHBV的大(L)和小(S)包膜蛋白的概述。L和S由来自单个开放阅读框的差异翻译产生，这样L蛋白由161个氨基酸的preS结构域和167个氨基酸的C端S结构域构成，其包含S蛋白。通过方框表示三个跨膜结构域(TM)。
图2B表示HCV E2胞外域(从氨基酸384至465)的82个氨基酸部分插入L的pres结构域的位置，产生E2.465/L嵌合包膜蛋白。
图2C提供显示所述E2.465/L嵌合体被运送穿过ER的Western印迹的结果。用于蛋白酶保护分析的ER微粒体制备自用pCDL-E2.465和pCI-S(小S蛋白表达质粒)转染的LMH细胞。如上面各泳道标示的，在去垢剂NP-40存在或不存在的情况下用胰蛋白酶降解所述微粒体样品或不作处理。通过SDS-PAGE和用可同时检测E2.465/L和S蛋白的单克隆抗S抗体进行Western印迹杂交分析E2.465/L链的蛋白酶保护。E2.465/L免受胰蛋白酶降解(中间的泳道)表示转运至ER腔中。
图2D提供了显示E2.465/L嵌合体被装配成颗粒的Western印迹的结果。通过冷冻-解冻细胞3次、离心以获取胞质部分并通过从20％蔗糖至70％蔗糖的梯度在38,000r.p.m(SW41 rotor Beckman)下沉降颗粒来从用pCDL-E2.465和pCI-S转染的禽类肝细胞瘤(LMH)细胞中分离细胞内颗粒。在SDS-PAGE和通过Western印迹杂交分析包膜蛋白之前用甲酵沉淀20-70％蔗糖界面上的颗粒级分。
图2E模仿L蛋白在ER(描述为微粒体囊)上的膜定位，表示翻译后转运至赋予E2.465/L杂合链免受胰蛋白酶降解的保护作用的微粒体腔内。在颗粒装配过程中，被装配的包膜蛋白通过ER膜的内叶面从ER出芽至ER腔内。颗粒通过细胞囊泡运出途径从细胞运出，使得可以分离来自细胞质(如D中显示)和细胞外区室的颗粒。如颗粒的草图所表示的，转运至ER腔的包膜蛋白结构域最终被暴露于所述装配颗粒的外侧。
图3是表示DHBV的基因组核苷酸序列的说明。
图4提供DHBV的L和S多肽的氨基酸序列。起始位点用下划线标记而终止位点以星号(*)标记。
图5A是DHBV L和DHBV S蛋白的概述。
图5B至5H是DHBV L嵌合体的概述。用方框标记的TM1-3表示跨膜结构域。沿着DHBV L长度方向的数字代表相对于DHBV L序列的氨基酸位置。V表示TM1内的缺失。
图6A和6B是表示用pSigLΔTM1-E2.661(A)或pCDLΔTM1-MSP2(B)转染的LMH细胞的膜部分的Western印迹结果的概述。MV标记(40-120kDa)用于表示嵌合体L蛋白的大小。
图7A和7B是表示来自蔗糖分级梯度级分的Western印迹的概述，所述Western印迹显示D1/S(A)和在酵母中产生的嵌合L VLPs、DLΔTM1-E2.465/S(B)和DLΔTM1-HpreS(C)具有相同的颗粒密度。将产生于酵母的通过20％蔗糖至70％蔗糖梯度的VLPs进一步在20-70％蔗糖分级梯度中在38,000rpm下进行沉降5小时。将从梯度中(号码2-11)收集的级分在SDS-PAGE上跑胶并用抗DHBV S结构域的单克隆抗体进行Western印迹杂交。
图8是表示DHBV L蛋白的Western印迹的概述，其中用经酵母产生的DL/S VLPs免疫过的一只大鼠的顺序释放的血检测所述蛋白。Pre表示免疫前所取的血，并且编号1-5表示在第3，6，9和13周获得的大鼠血清。
表1
发明详述本发明是部分基于下列发现DHBV的L多肽可被显著地修饰但仍保持在病毒样颗粒装配的过程中与DHBV的S多肽结合的能力。
此处建议使用L多肽或其功能性衍生物或同源物递送目的多肽或肽至受试者。特别地，建议使用L多肽递送作为病毒样颗粒部分的目的抗原至受试者的免疫系统。
在广泛的实施方案中本发明提供了包含融合(嵌合)多肽的病毒样颗粒(VLP)，所述融合多肽包含目的多肽(POI)和大包膜(L)多肽的颗粒结合部分。
所述病毒样颗粒主要由小包膜(S)多肽构成。
因此，本发明进一步提供了VLP，所述VLP包含i)含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
更特别地，本发明进一步提供了VLP，其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
优选地至少部分所述POI暴露于所述病毒样颗粒的表面。
术语“病毒样颗粒”在其最广义上用于表示颗粒或三维蛋白质结构，其象有包膜病毒的亚病毒颗粒一样通过脂双层内的包膜多肽自组配或折叠形成颗粒。本发明的病毒样颗粒可以是重组或合成的，或可包含合成或重组成分的组合。
除非上下文清楚地指出，否则此处涉及的单数形式例如“a”、“an”或“the”包括复数方面。因此，例如“a polypeptide of interest”包括单个多肽以及二个或多个这样的多肽。
此处涉及的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不应当受任何特定长度的限制。因此，所述术语包括蛋白质、寡肽、肽和抗原决定部位。所述术语不排除多肽的修饰，例如肉豆蔻基化、糖基化、磷酸化、加上N端信号序列等。包括在此定义范围内的是，例如含有一个或多个氨基酸(例如包括，非天然氨基酸例如在表面2中所给出的氨基酸)类似物的多肽或具有取代连接的多肽。
此处涉及的类似物包括但不限于对侧链的修饰、在肽、多肽或蛋白质合成过程中整合入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对蛋白质分子或其类似物施以构象限制的其它方法。
本发明涉及的侧链修饰的例子包括氨基官能团的修饰，例如通过与醛反应然后用NaBH4还原进行的还原烷基化、用甲基乙酰亚胺酸酯进行乙酰亚胺化、用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基官能团三硝基苄化、用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐酰化氨基官能团，和用吡哆醛-5-磷酸接着用NaBH4还原来吡哆醛化赖氨酸。
精氨酸残基的胍基官能团可通过与反应物例如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物进行修饰。
羧基官能团可通过碳二亚胺活化来修饰，碳二亚胺活化是通过形成O-酰基异脲然后衍生化为例如相应的酰胺来进行的。
巯基官能团可通过某些方法进行修饰，所述方法为例如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧基甲基化、过甲酸氧化成磺基丙氨酰、与其它硫醇化合物形成混合二硫化物、与顺丁烯二酰亚胺、顺丁烯二酐或其它取代顺丁烯二酰亚胺反应、使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、氯苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞化物形成汞衍生物；在碱性pH下用氰酸进行甲氨酰化；十六烷基化半胱氨酸残基。
色氨酸残基可通过例如用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄溴或sulphenyl halide烷基化吲哚环来进行修饰。另一方面，酪氨酸残基可通过用四硝基甲烷形成3-硝基酪氨酸衍生物来进行改变。
组氨酸残基咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用二乙基焦碳酸盐进行N-乙酯基化。
在肽合成过程中整合入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型同分异构体。此处涉及的非天然氨基酸的目录显示于表2。
表2非常规氨基酸代码
例如，可使用交联剂稳定3D构象，使用同源双功能交联剂例如具有(CH2)n(n＝1至n＝6)间隔子官能团的双功能亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和异双功能试剂，所述异双功能试剂通常含有氨基反应性部分例如N-羟基琥珀酰亚胺和另外的基团特异性反应性部分例如马来酸亚胺或二硫部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。此外，通过例如整合入Cα和Nα-甲基氨基酸和在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键可限制肽的构象。
术语“融合多肽”或“嵌合多肽”或“杂合多肽”可交互使用，表示包含两个或更多个相连的作为同一表达产物中的部分表达的或通过合成方式产生的多肽、蛋白质或肽。融合多肽可包含两个或多个L和POI多肽和间隔区域，例如连接体或间隔子区域。特别地，允许或直接地或间接地有助于表面拓朴学或在颗粒中增加目的多肽对蛋白酶的抗性的区域是想要的，例如N端信号序列。信号序列的例子是前催乳激素，然而，正如本领域技术人员所理解的，还有许多其它合适的信号序列。间隔子区域的例子是跨膜结构域。可选择的或此外，可包括促进胞质拓扑学的区域。可通过蛋白酶保护测定或通过确定与抗体的相互作用来估测病毒颗粒中的多肽拓扑学，所述相互作用由L多肽、S多肽、目的多肽或由这些多肽的融合产生的抗原决定部位决定。因此，“融合多肽”中的术语“融合”不是“病毒融合”的意思。
术语“目的多肽”是指任何有利地作为病毒样颗粒的部分被递送至受试者的多肽。例如，涉及促进和/或介导特定生物化学或生理学反应的两个或多个多肽或多肽的基质可以病毒颗粒的形式被递送至受试者。所涉及的特定反应是对抗原的免疫应答。因此所述术语包括任何目的抗原性多肽。抗原性多肽可与免疫强化多肽例如本领域技术人员所熟知的细胞因子共表达。本发明的多肽和肽(POIs)可进一步与作为靶向和/或标记分子的分子在L中表达或合成，所述靶向和/或标记分子是例如，但不限于，帮助靶向和/或标记特定细胞例如树突细胞或其它抗原呈递细胞的分子。
此处所使用的“受试者”是指动物，优选地是哺乳动物和更优选地是可从本发明的病毒颗粒的施用中获益的人。对从此处描述的分子中获益的动物类型没有限制。无论是人或非人动物的患者都可称作个体、受试者、动物、宿主或受者。本发明的分子和方法应用于人医学、兽医学以及通常地于驯养或野生动物的饲养中。为方便，“动物”包括禽类物种例如家禽禽类、鸟类饲养场的鸟类或猎禽。
所述优选的动物是人或其它灵长类、家畜动物、实验室测试动物、陪伴动物或捕获的野生动物。
实验室测试动物的例子包括鸭子、雪雁、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿动物例如大鼠和小鼠提供了方便的测试系统或动物模型。家畜动物包括绵羊、母牛、猪、山羊、马和驴。也涉及非哺乳动物例如鸟类品种，斑马鱼和两栖类动物。
术语“抗原”或“抗原性多肽”广义上包括能在受试者中诱导免疫应答的多肽。所述抗原性多肽可包括单个抗原决定区域到多个包括重复抗原决定部位区域的抗原决定部位区域。尽管涉及来自传染性因子的抗原例如病毒、细菌、真菌、原生动物、吸虫、线虫、朊病毒等以及肿瘤相关的抗原，所述抗原性多肽可来自单个或多个来源。许多因子和肿瘤相关蛋白的抗原性区域在本领域是众所周知的。抗原是例如来自寄生虫、细菌、病毒、癌症的抗原和此处描述的包括来自肝炎的E2多肽、来自疟原虫(P.falciparum)的MSP2多肽和来自麻疹的H蛋白的抗原。
正如本领域技术人员所熟知的，预防性或治疗性疫苗的有效免疫通常会引起强烈的CTL和T辅助细胞应答以及强烈的体液应答。
所述目的抗原性多肽可包含来自一个或多个来自不同生物体、物种或亚种的多肽的抗原决定部位区域。例如，可对病毒和细菌或多个病毒或多个细菌的感染同时进行接种疫苗。
短语“颗粒结合部分”是指，对所有L多肽而言，用来将L多肽整合至病毒样颗粒中所需的L多肽的部分。例如，L的S结构域的TM1区域对于L与所述颗粒的缔合不是必需的因此可从此处使用的L多肽中略去。事实上，如此处所提到的，L多肽的TM1下游序列(或TM2和5’半胱氨酸环的下游)足以满足颗粒结合。类似地，L的preS结构域不是将L装配入颗粒中所需要的。缺少TM1的L的S结构域是L的颗粒结合部分的例子。很明显，根据本发明许多不同的颗粒结合部分是可获得的。该部分的特征是可变的，并且可使用本领公开的和此处提到的方法根据经验进行确定。
尽管L的最小功能性部分在一些应用中是有利的，但本发明提供了间插有POI的全长L多肽或其中将POI附加在末端的全长L多肽。优选地所述POI被引入至L的表面暴露部分。
术语“来源于”是指特定的组分或组分群来自于所描述的来源，但不一定需要从所述特定的来源直接获得。
术语“分离的”包括指VLPs已经过至少一个纯化步骤，方便地以在样品中纯物质的％来描述。优选的形式包括在样品中VLP物质具有至少50％的纯度、更优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少大约80％、更优选地至少大约90％。
本发明的一个有利方面是VLPs可以大体上一致的大小产生。
在本发明的另一方面，涉及分离的病毒样颗粒(VLP)，其包含i)包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜(L)多肽的部分S结构域或其功能性衍生物或同源物的融合多肽；和ii)禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物，其中至少部分所述POI暴露于病毒样颗粒的表面。
根据要求，可方便地使用信号序列以实现特定POI/L多肽在一些表达系统中的表达。如此处所描述的，强信号序列的存在也可用于增强在VLP表面表达的POI量。
示例性L部分是DHBV S结构域的氨基酸24至167部分或，更优选地至少是TM2(包括TM1和TM2之间的5’半胱氨酸环)和DHBV的L多肽的下游序列。
在本发明的一个特定实施方案中，所述目的多肽位于L多肽的S结构域氨基酸序列或除去TM1结构域的S结构域的氨基末端。在另一个实施方案中，所述POI位于L多肽的pre-S结构域或L多肽的N末端。
通过向L的pre-S结构域或L的S结构域的N端或缺少TM1的S结构域的N端引入一个或多个POIs，所述POI与L一起被转运至主要由S多肽构成的颗粒结构中。这有利于每个VLP含有高拷贝数量的POI。
在一个实施方案中本发明的病毒样颗粒用于疫苗组合物中以提高有效的免疫应答。特别地，所述病毒样颗粒具有有利地被抗原呈递细胞例如树突细胞吸收的合适大小。特别地，对于哺乳动物嗜肝DNA病毒颗粒，这些颗粒通常大约为20纳米，而禽类嗜肝DNA病毒是多晶的并且直径通常在35和60纳米之间。有效的免疫应答是能够在受试者中减少靶抗原数量和可以预防感染或疾病状况发展(预防性疫苗)或可治疗当前的感染或疾病状况(治疗性接种)的应答。
在不受限于任何特定理论的情况下，本发明的VLPs能够刺激体液和/或细胞介导的免疫应答。异源抗原被靶向至加工和呈递MHC I类和II类抗原的合适途径，并且被靶向至引起特别是T细胞应答的树突细胞。
在另一方面，优选的L多肽包含或由基本上如SEQ ID NO7和SEQ ID NO9所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO7和SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列构成。
甚至更优选地，所述％相似性超过60％同一性、更优选地70％同一性、然而更优选地至少大约80％、而更优选地大约90-95％的同一性。
优选的L多肽来源于禽类嗜肝DNA病毒，例如但不限于DHBV。重要的是，应用于本发明的嗜肝DNA病毒或包膜多肽不会从VLP装配中排除L。
本发明L多肽的功能性衍生物包括亲本分子的片段或部分，其保持L多肽与由S多肽形成的颗粒结合的能力，或至少其中这种能力没有明显丢失。
本发明的S多肽的功能性衍生物保留了S多肽形成病毒样颗粒的能力，或至少这种能力没有明显丢失。
明显丢失表示L颗粒与S以低于大约1∶1或优选地低于1∶2，甚至更优选地低于1∶3，而更优选地低于1∶4的比例被装配入颗粒中。
优选的S多肽来源于禽类嗜肝DNA病毒，例如但不限于DHBV，或包含或由基本上由SEQ ID NO13所列氨基酸序列构成。
术语“功能性衍生物”也扩展至具有一个或多个氨基酸突变或修饰的多肽。突变可来自氨基酸的添加、插入、缺失或替代。替代优选地是下列组内的保守氨基酸替代甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。修饰可包括添加增强病毒装配或稳定的侧翼序列。
优选地，衍生物与所述亲本分子的全部或部分具有至少60％的氨基酸相似性，或更优选地至少80％，或最优选地90％或更大的相似性。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合多肽的VLP，所述融合多肽包含POI和L多肽的颗粒结合部分，其中所述L多肽包含基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或与其具有至少大约50％相似性的氨基酸序列，或其功能性衍生物或同源物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合多肽的VLP，所述融合多肽包含POI和L多肽的颗粒结合部分，其中所述L多肽由基本如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或能够在中等严紧条件下与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
使用本领域技术人员熟知的技术例如此处描述或提及或Sambrook等人总结的技术，在体外或体内装配本发明的VLPs。特别地，产生用来表达一种或多种如此处描述的重组包膜蛋白的表达质粒。
因此，在另一方面，本发明提供了用于装配包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的VLP的分离的或重组的多肽。
在相关方面，本发明提供了当在细胞中表达时能够装配入VLP的重组多肽，所述多肽包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物。
优选地，所述L的颗粒结合部分至少包括L的S结构域或除去TM1结构域的L的S结构域或其功能性衍生物。
更优选地，POI位于L的pre-S结构域、或L的S结构域的氨基末端侧、或除去TM1结构域的L的S结构域。
根据本发明的这个方面，所述L多肽包含基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO7或SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列。
如此处所描述的，L多肽的颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列氨基酸序列或包含与SEQ ID NO7或SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列的其功能性衍生物构成。
禽类嗜肝DNA病毒表现相当高的序列同一性并且因此考虑具有高于70％相似性或同一性的序列。
本发明扩展至L多肽或其颗粒结合部分在制备VLP中的应用，所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或与SEQ ID NO6和SEQ ID NO8具有至少大约50％相似性的核苷酸序列或能够在中等严紧杂交条件下与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
在本发明进一步方面，所述L多肽进一步包含信号序列。这样的序列在增强POI在VLP的表面表达上特别有用。
优选的L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
而在另一方面，本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分，并且其中编码L多肽的颗粒结合部分的核苷酸序列包含SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的序列或能够在低严紧杂交条件下与其或与其互补形式杂交的连续核苷酸序列，或其功能性衍生物或同源物。
而在另一方面，本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分，并且其中编码L多肽颗粒结合部分的核酸编码SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或与其具有至少大约50％相似性的氨基酸序列或其功能性衍生物或同源物。
在另一方面，本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分，并且其中编码L多肽颗粒结合部分的核酸编码SEQID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列。
另外本发明的另一方面提供了用于制备重组VLP的重组核酸分子，所述核酸分子包含编码至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个适合于接受第二个编码一个或多个目的多肽的克隆位点，其中所述目的多肽作为与所述L多肽形成的融合多肽被表达。本发明的表达载体也可以方便地表达其它包膜蛋白例如L或，优选地，S多肽。因此可常规地使用双向或双顺反子启动子以表达来自相同载体的重组L以及S多肽。此外，使用信号序列以增强POI的表达(包括表面表达)。明确包括含有本发明重组核酸分子的细胞和试剂盒。
因此本发明提供了将POI递送至受试者或细胞的方法，其包括在包含来自禽嗜肝病毒例如DHBV的L多肽或其功能性衍生物或同源物的VLP中表达POI以使至少部分POI在VLP的表面表达。在一个方面，所述VLP在体外表达系统中产生。在另一方面，所述VLP在体内产生。当POI是抗原性多肽时，优选的细胞是免疫系统的细胞例如抗原呈递细胞。
特别地提供了本发明的所有或部分核酸分子的互补形式。
本领域技术人员很容易地认识到，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式或混合的聚合物、有义链和反义链，并且可以是化学或生化修饰的或可包含非天然的或衍生核苷酸碱基。这类修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物(例如吗啉环)替代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电荷连接(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、带电荷连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如多肽)、插入物(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和被修饰的连接(例如α-异头核酸等)。被包括的还有模仿多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。这类分子在本领域是已知的并且包括，例如，用肽键替换分子主链中的磷酸键的分子。
此处所用的术语“相似性”包括在核苷酸和氨基酸水平上进行比较的序列之间的精确同一性。当在核苷酸水平上存在非同一性时，“相似性”包括导致不同氨基酸的序列差异，但所述不同氨基酸彼此之间在结构、功能、生物化学和/或构象水平上是相关的。
当在氨基酸水平上存在非同一性时，“相似性”包括相互之间在结构、功能、生物化学和/或构象水平上相关的氨基酸。在特定的优选的实施方案中，在同一性水平上而非相似性上进行核苷酸和序列比较。
用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间相互关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本相似”、和“基本同一”。“参照序列”长度至少为9-12个但通常是15-18和通常至少21-25或更多，例如30个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即只是完整的多核苷酸序列的一部分)和(2)两个多核苷酸之间有差异的序列，因此通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以确定和比较局部区域的序列相似性来进行两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较。“比较窗口”是指被用于与参照序列比较的通常12个连续残基的概念片段。当与参照序列(不包含加入或缺失)比较以最优化两个序列的比对时，比较窗口可包含大约20％或更少的加入或缺失(即缺口)。可通过计算机化的算法工具(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或通过目测进行用于比对比较窗口的最优化序列比对，通过任何被选择的各种方法产生最佳比对(即导致在比较窗口上最高的百分比同源性)。也可以参考BLAST程序集，例如由Altschul等人于Nucleic AcidResearch，253389-3402，1997中公开的。在Ausubel等人(同上)的Unit 19.3中可找到序列分析的详细讨论。
此处所用的术语“序列相似性”和“序列同一性”是指在比较窗口上基于核苷酸与核苷酸或基于氨基酸与氨基酸的序列同一或者功能或结构相似的程度。因此，例如，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳排列的序列，确定在两个序列上出现相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Iys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以获得匹配位置数目，用匹配位置数目除以比较窗口中的总位置数目(即，窗口大小)，并将所述结果乘以100产生序列同一性百分比来计算的。为了本发明的目的，“序列同一性”可理解成表示通过DNASIS计算机程序(用于Windows的2.5版，获自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Franci sco，California，USA)使用如在伴随软件的参考手册中所使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。与此类似的说明也适用于序列相似性。可认为保守氨基酸的变换提供了相似性序列但非同一性序列。
特别优选的核酸分子编码L多肽的颗粒结合部分并包含基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的连续核苷酸序列或具有与SEQ IDNO6或SEQ ID NO8至少大约50％相似性的核苷酸序列。优选地，相似性％与编码L多肽颗粒结合部分的序列相关。
此外，本发明涉及编码L多肽颗粒结合部分的核酸分子，其包含基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或能够在中等严紧条件下与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或其互补形式杂交的核苷酸序列。
本发明核酸分子的功能性衍生物包括其片段或具有一个或多个核苷酸突变或修饰的序列。
突变包括一个或多个核苷酸缺失、插入或替代。可选择地或此外，可通过加入序列或部分以增强功能例如增强的稳定性或活性或引入新的活性来修饰衍生物。例如，修饰可包括加入促融合(fusagenic)剂以增强膜通透性、影响转录前或转录后修饰事件的修饰、或产生包含标记、标签和其它用于鉴别、纯化等的修饰的融合蛋白。
所述核酸分子的功能性衍生物保持亲本分子编码具有S多肽颗粒装配功能或L多肽颗粒结合功能的多肽的能力。
所述核酸分子的片段可包括具有亲本功能的其部分或一个或多个其小部分。
本发明核酸序列的功能性同源物包括来自不同物种(通过共同的系统发生行为发生关系的物种)的直向同源基因序列同时也包括来自其它物种的作为趋同进化的结果与本发明核酸序列相似的基因序列，其中所述同源物是在功能和结构上与本发明核酸序列相关的，因此容易通过基于杂交的方法或通过与公开的基因组数据库进行序列比较来进行鉴定和/或分离。例如，大约20个禽类嗜肝DNA病毒的核苷酸序列是公共可获得的(Triyatni等人，J.Gen.Virol，82373-378，2001)。
如本领域所熟知的，可在利用不同严紧杂交条件的测定中估计核酸水平上的相似性，例如如Ausubel等人(同上)所描述的。
此处提及的严紧杂交条件优选地是指允许在基本相似的分子间进行选择性杂交或退火的条件。满足该标准的杂交溶液的杂交温度组成和离子强度可根据大量已被很好表征的因素例如长度、互补程度和GC含量进行变化。对于更长的序列，通常可能计算在各种条件下的双螺旋核酸序列的预期熔解点。杂交可针对完整的或具有能充分提供其编码的多肽的特性和功能性的最小长度的部分本发明多核苷酸。
低严紧杂交条件包括从至少大约0至至少大约15％v/v甲酰胺和从至少大约1M至至少大约2M的盐(用于杂交)，和至少大约1M至至少大约2M的盐(用于洗涤条件)。通常，低严紧是从大约25-30℃至大约42℃。可改变温度并且用更高的温度取代甲酰胺和/或给出其它的严紧条件。
中等严紧包括从至少大约16％v/v至至少大约30％v/v甲酰胺和从至少大约0.5M至至少大约0.9M的盐(用于杂交)，和至少大约0.5M至至少大约0.9M的盐(用于洗涤条件)。高严紧包括从至少大约31％v/v至至少大约50％v/v甲酰胺和从至少大约0.01M至至少大约0.15M的盐(用于杂交)，和至少大约0.01M至至少大约0.15M的盐(用于洗涤条件)。通常在Tm＝69.3+0.41(G+C％)下进行洗涤。然而，随着错配碱基对数目每增加1％，双螺旋DNA的Tm就下降1℃(Bonner等人，1974)。甲酰胺在这些杂交条件下是可选的。因此，如下确定特别优选的严紧水平低严紧是6×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，温度于25-42℃下；中等严紧是2×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，温度在从20℃至65℃范围内；高严紧是0.1×SSC缓冲液，0.1％w/vSDS，温度至少在65℃以上。
可将适合用于制备重组VLPs的本发明的重组核酸分子导入有助于VLP产生的载体中。
载体优选地含有克隆位点并且能在确定的宿主细胞中自我复制。可选择地，所述载体可整合入基因组中并且与其被导入的染色体一起复制。载体通常也包括选择标记。
可选择的标记的例子包括赋予对化合物例如抗生素抗性的基因、赋予在选择的底物上生长的能力的基因、编码产生可检测信号例如发光的蛋白的基因。大量的这类标记是公开和可获得的，包括，例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。可选择标记也包括赋予在某种培养基底物上生长的能力的基因，例如tk基因(胸苷激酶)或赋予在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)上生长的能力的hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)；和允许在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长的细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖转移酶)。其它用于哺乳动物细胞的选择标记和携带各种选择标记的质粒描述于Sambrook等人的MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，New York，USA，1990中。
选择标记可依赖于其自身启动子进行表达并且标记基因可不必来自人基因组(例如原核标记基因可用于人细胞中)。然而，优选地用已知在受体细胞中发挥功能的转录机器取代原来的启动子。可获得的大量用于这种目的转录起始区域，包括，例如，金属硫蛋白启动子、胸苷激酶启动子、β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、SV40启动子和人细胞巨化病毒启动子。广泛使用的例子是具有在SV40早期启动子控制下的细菌新霉素磷酸转移酶基因并且赋予哺乳动物细胞抗G18(与新霉素相关的抗生素)抗性的pSV2-neo质粒。可使用许多其它变化以增强选择标记在动物细胞中的表达，例如加上poly(A)序列和加上合成的翻译起始序列。组成型或诱导型启动子都可使用。
用于制备重组VLP的重组核酸分子优选地以有助于导入编码POI的核酸分子和颗粒装配的试剂盒形式存在。
本发明的另一方面提供了包含编码POI和至少DHBV的L肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表达载体，其中所述POI可以作为与所述L多肽形成的融合多肽进行表达。
本发明的另一方面提供了包含编码POI和至少DHBV的L肽的S结构域的部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表达载体，其中所述POI在L多肽氨基酸序列的S结构域或其功能性衍生物或同源物之中或N末端进行表达。
优选地，所述POI在L多肽的S结构域的N末端上或多肽的pre-S结构域内表达。
如本领域技术人员所理解的，本发明的核酸分子可进行进一步修饰以确保其适合于在一系列细胞内的表达、体外选择、适合用于在其中克隆各种POIs。这类技术和策略对本领技术人员来说是熟知的并且可方便地参考Ausbel等人编著的short protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，第5版，2002和/或Sambrook等人(同上)。
为确保表达，编码POI和L多肽成分的核苷酸序列可有效地连接至一个或多个表达控制序列上。优选地两个或多个这样的核苷酸序列在同一阅读框内。
在一个实施方案中表达载体被方便地整合入宿主细胞的基因组中并在宿主细胞启动子的驱动下表达。
本发明也提供了被转化或被转染或包含核酸分子的微生物或宿主细胞，所述核酸分子包含编码POI和至少DHBV的L肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列。酵母细胞是特别方便的宿主细胞。有利地使用原核或真核宿主细胞。通常原核细胞包括大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属物种而真核细胞包括酵母、真菌、哺乳动物和昆虫细胞。
本发明进一步提供了用作疫苗的包含来源于DHBV L和S多肽的病毒样颗粒的组合物，其中L多肽包含一个或多个目的抗原。
本发明也涉及包含以与DHBV的L多肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合蛋白表达的目的抗原和DHBV S多肽的疫苗，其中S多肽和抗原-L多肽可被装配入VLP中，与合适的药物可接受的稀释剂和载体混合。所述疫苗可在使用前冻干和可进一步与合适的佐剂混合。因此所述疫苗可以试剂盒的形式存在。
“药物可接受的”载体或稀释剂是指由不是生物学上或其它方面不想要的物质构成的药物学载体，即在不导致任何或明显不利的反应的情况下可与所选择活性试剂一起给受试者施用的物质。载体可包括赋形剂和其它添加物例如稀释剂、去垢剂、着色剂、增湿或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
可在药物组合物中配制本发明的VLPs和多肽核酸分子，所述药物组合物根据常规药物配方技术制备而来。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing，Company，Easton，PA，U.S.A.)。所述组合物可包含活性试剂或活性试剂的药物可接受盐。除了其中一种活性物质外，这些组合物还可包括药物可接受赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其它本领域熟知的物质。这些物质应当是无毒的并且不应当干扰活性成份的功效。所述载体可根据想要施用的制剂的形式采取广泛的形式，例如局部、静脉内、口内、鞘内、神经弓上(epineural)或肠胃外施用。
对于口内施用，可将化合物配制成固体或液体的制剂例如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、悬浮剂或乳剂。以口服剂量形式制备组合物时，在口服液体制剂(例如，悬浮剂、酏剂和溶液)的情况下可使用任何常用的药物介质，例如，水、乙二醇、油、醇、增味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等；或在口服固体制剂(例如，粉末、胶囊和片剂)的情况下可用载体例如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。因为其容易施用，所以片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，其中明显地使用了固体药物载体。如果想要，通过标准技术可对片剂进行糖包衣或肠包衣。可将活性试剂装入胶囊以使其稳定地通过胃肠道但同时允许穿过血脑屏障。参见例如，国际专利
发明者D·A·安德森, E·V·L·格伽茨克 申请人:赫普吉尼克斯股份有限公司