专利名称：昆虫胰凝乳蛋白酶及其抑制剂的制作方法
背景技术：
发明领域本发明通常涉及一种新的胰凝乳蛋白酶，其对植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂展示抗性。更具体地，本发明提供了一种胰凝乳蛋白酶，当进食花烟草(Nicotiana alata)丝氨酸蛋白酶抑制剂时，其在棉铃虫(Helicoverpa armigera)和澳洲棉铃虫(Helicoverpapunctigera)昆虫幼虫的肠道中被上调。因此，该新胰凝乳蛋白酶代表了用于识别拮抗物的靶，所述拮抗剂包括被提议可有效地用于对照棉铃虫的种(Helicoverpa spp.)群体的抑制剂，该群体已形成了对在植物中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗性。胰凝乳蛋白酶的拮抗物可以局部应用到植物，或者，当处于蛋白质的形式时，可以在植物细胞中通过遗传的手段产生。拮抗物可以在基因表达或蛋白质活性的水平上发挥作用。
现有技术的描述也将在本说明书中提到的出版物的文献细节收集在说明书最后。
在本说明书中，对任何现有技术的参考不是而且也不应该被视为承认或任何形式的暗示该现有技术构成了任何国家的公知常识的一部分。
观赏性烟草，花烟草，的雌性生殖组织和受损叶片积聚了大量的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PI)，用于预防害虫和病原体(Atkinson等，植物细胞5203-213，1993)。这些6kDa的PI积聚在液泡中(Miller等，植物细胞111499-1508，1999)，并源于体内40.3kDa前体蛋白质的翻译后修饰。PI蛋白质的前体(称为“NaPI”)由高序列同一性的6个重复区域组成(
图1)，每一个都具有潜在的PI反应位点。对该6个重复的前体蛋白质的加工出乎意料地发生在重复区域内而不是重复区域之间的位点。完全去除包含在每一重复区域内的连接体序列(Glu-Glu-Lys-Lys-Asn)[SEQ ID NO1]产生了5个邻近的6kDa抑制剂(C1和T1-T4)以及一个新的双链胰凝乳蛋白酶抑制剂(C2)，其由N端和C端肽片段的二硫键连接形成(Heath等，EuropeanJournal of Biochemistry 230(1)25-257，1995；Lee等，NatureStructural Biology 6(6)526-530，1999)。已采用1H-NMR技术研究了C1、T1-T4和C2的结构(Nielson等，J.Mol.Biol.242231-243，1994；Nielson等，Biochemistry 3414304--14311，1995；Lee等，1999，出处同前)。
花烟草也具有与NaPI相关的第二基因，其编码了密切相关的前体蛋白质，具有4个而不是6个重复域(Miller等Plant Mol.Biol.42329-333，2000)。该前体也在体内被加工，导致释放3个邻近的6kDa抑制剂(C1、T4和T5)和双链抑制剂C2(图1)。三个抑制剂(C1、C2和T4)与从6个域的前体释放的那些相同。已经为其它茄科植物包括烟草(N.tabacum)(Balandin等，Plant Mol.Biol.271197-1204，1995)、N.glutinosa(Choi等，Biochim.etBiophys.Acta 1492211-215，2000)、L.esculentum(Taylor等，Plant Mol.Biol.231005-1014，1993)和Capsicum annum(Moura和Ryan，Plant Physiol.126289-298，2001；Antcheva等，Protein Sci.102280-2290，2001)描述了相关的多域前体。
几个研究组已经报道了丝氨酸蛋白酶抑制剂对昆虫消化蛋白酶活性的影响并暗示出它们由植物产生，用于预防昆虫害虫和微生物的破坏性作用(Ryan，Annu.Rev.Phytopathol.28425-449，1990；Gatehouse等，用于农作物保护的植物基因操作，农业生物技术，No.7，Eds.Gatehouse，Hilder & Boulter，International U.K.，pp.155-181，1992)。专门进食一种特定宿主植物的昆虫通常对该植物产生的丝氨酸PI具有抵抗力，但对非宿主产生的PI敏感(Broadway和Villani，Entomol.Expo.Appl.76303-312，1995；Broadway，J.Insect.Physiol.41107-116，1995)。因此，有兴趣将编码丝氨酸P I的基因从非宿主移入农作物以增强抗虫性，并降低对化学杀虫剂的依赖性。近来，然而，几个研究组已报道了摄食大量PI后，某些昆虫具有可改变蛋白水解酶在其中肠内的相对比例的能力(Broadway，1995，出处同前；Jongsma等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(17)8041-8045，1995a)。例如，Broadway(1995，出处同前)发现某些鳞翅目昆虫可产生两类主要的胰蛋白酶样蛋白酶，其一对来自甘蓝叶的PI不敏感。摄食甘蓝PI后，昆虫增加了不受PIs影响的那类胰蛋白酶的生产，并因此能够不受阻碍地生长和发育。Jongsma及其合作者(1995，出处同前)采用进食来自马铃薯(PotII)和烟草的PI的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫进行了类似观察。在这些条件下，调节这些蛋白酶分泌的因素是未知的。
这些研究显示，对于长期的植物保护，专用于昆虫肠道中的一种或两种蛋白酶的PI将具有有限的用途。在转基因植物中，编码花烟草PI的基因比其它植物的PI对于增强抗虫性具有潜在的优势。大多数植物丝氨酸PI仅含有一个或两个抑制域，而花烟草PI前体具有4个或六个(图1)。因此，有潜能设计花烟草PI的各个域以提供对抗昆虫肠道中的几种蛋白酶的抑制活性。
已经部分表征了几种鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)和直翅目(Orthoptera)的中肠蛋白酶。在大多数鳞翅目物种中，内蛋白酶活性主要是由于丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶)，并且半胱氨酸和金属蛋白酶是不可检测的(Christeller等，Insect Biochem.Molecul.Biol.22_735-746，1992；Terra和Ferreira，Comp.Biochem.Physiol.1091-62，1994；Xu和Qin，J.Econ.Entomol.87334-338，1994；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.2563-71，1995a；Johnston等，Insect Biochem.21389-397，1991；Johnston等，Insect Biochem.Molec.Biol.25(3)375-383，1995)。也已经识别了外肽酶和亮氨酸氨肽酶(Christeller等，1992，出处同前；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25(1)49-61，1995b)。
仅部分理解PI对昆虫的作用机理。描述了3种反应(i)严重延缓了生长，但肠道蛋白水解活性不减弱。Broadway和Duffey(J.InsectPhysiol.32673-680，1986a；Broadway和Duffey，J.Insect Physiol.32827-833，1986b)发现进食PI的昆虫具有显著减小的生长率，这与肠道中总蛋白水解活性的降低无关。事实上，肠道蛋白水解活性经常增加。他们暗示出一种反馈机理在起作用，其引起过量产生蛋白酶，并依次导致损耗含有硫的氨基酸。对于其它昆虫，在长期摄食PI后，已经纪录了这种现象(Burgess等，Entomol.Exp.App.61123-130，1991；De Leo等，Plant Physiol.118997-1004，1998；Markwick等，J.Economic Entomology 91(6)1265-76，1998)。
(ii)严重延缓了生长，同时肠道中蛋白水解活性降低。Broadway(1995，出处同前)发现鳞翅目物种小地老虎(Agrotis ipsilon)(黑切根虫)在暴露于大豆胰蛋白酶抑制剂后减小了生长并延缓了化蛹，并且通过分泌PI不敏感蛋白酶不响应。这些昆虫的全部肠道蛋白水解活性降低70％。进食“弹性蛋白酶抑制剂”的幼鳕蛾幼虫(鳞翅目卷蛾科)也延缓了生长和发育，这与肠道中弹性蛋白酶活性的减弱有关(Markwick等，Journal of Economic Entomology 88(1)33-39，1995)。
(iii)补充肠道蛋白酶对生长变化无影响。一些昆虫可以通过诱导一种新蛋白酶活性补偿对一组蛋白酶的抑制。鳞翅目昆虫的基因组含有一定范围的丝氨酸蛋白酶基因，并且昆虫可以修改特异性同功酶的表达以适合饮食成分(Bown等，Insect Biochem.Molec.Biol.27625-638，1997；Broadway，J.Insect.Physiol.43(9)855-874，1997)。已经采用Northern印迹分析对来自棉铃虫、玉米夜蛾(H.zea)和小地老虎(Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31645-657，2001a；Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31633-644，2001b)的RNA检测了补充肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶时的变化(Bown等，1997，出处同前；Gatehouse等，InsectBiochem.Molecul.Biol.27929-944，1997)。对于棉铃虫(Harsulkar等，Insect Physiol.121497-506，1999；Patankar等，Insect Biochem.& Mol.Biol.31453-464，2001)、Spodopterafrugiperda(Paulillo等，J.Econ.Entomol.93892-896，2000)、玉米夜蛾和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Broadway，Arch.InsectBiochem.Physiol.32(1)39-53，1996)，也已经通过采用电泳分离同功酶观察了在蛋白质水平上的相应变化。有时，特异性同功酶被上调，并且偶而观察到先前未检测到的蛋白酶。
近来，Mazumdar-Leighton和Broadway(2001a，出处同前)证明了在转录水平上调节玉米夜蛾中的PI不敏感胰蛋白酶的产生，并可以利用转录调节剂放射菌素取消。Broadway及其同事检查到当玉米夜蛾和粉纹夜蛾幼虫进食含有1％SBTI的人工食物48h后肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的变化(Broadway，1996，出处同前)。摄食SBTI后，胰蛋白酶活性增加，并且酶谱上的蛋白酶带型显示了相对补充蛋白酶的变化。研究人员表明SBTI在体外可以抑制来自对照幼虫的肠道提取物中74％的胰蛋白酶活性，但在消耗SBTI的幼虫中仅为3％的肠道胰蛋白酶活性。它们暗示出酶谱上的新蛋白酶带(对于玉米夜蛾为1个新带，并且对于粉纹夜蛾为6个新带)可能为SBTI不敏感的胰蛋白酶或SBTI不敏感的胰凝乳蛋白酶，并推断出通过摄食SBTI而增强这些新蛋白酶的产生。玉米夜蛾和小地老虎采用Northern印迹分析进行的进一步研究显示出摄食SBTI导致编码胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的mRNAs转录诱导(Mazumdar-Leighton和Broadway，2001a，出处同前；Mazumdar-Leighton和Broadway，2001b，出处同前)，尽管不确定这些蛋白酶是否是对SBTI不敏感的。
摄食SBTI后，在玉米夜蛾中诱导的新胰蛋白酶转录物被称为HzT15(Mazumdar-Leighton和Broadway，2001b，出处同前)。近来，从玉米夜蛾肠道纯化对几种蛋白酶抑制剂不敏感的第一昆虫消化酶，相应于由HzT15编码的蛋白质(Volpicella等，Eur.J.Biochem.27010-19，2003)。作者鉴定出在横跨相对于PI抑制性胰蛋白酶的这种对PI不敏感的胰蛋白酶结构模型表面之电荷分布方面的几个区别，但是不能确定引起抗性的结构变化。
直到近来，一直假定胰凝乳蛋白酶对鳞翅目中蛋白质消化的贡献相当小，并且因而大多数生化研究集中于表征胰蛋白酶。该问题的提出是由于最初使用了适用于哺乳动物但根本或不适用于鳞翅目酶的胰凝乳蛋白酶的合成底物。鳞翅目胰凝乳蛋白酶优选具有至少4个氨基酸的合成底物，以占据酶上的S1-S4结合亚位，而哺乳动物胰蛋白酶在具有特异于S1结合位点的1个氨基酸的较短底物上有活性。即，昆虫胰凝乳蛋白酶看来具有伸长的底物结合位，需要至少4个氨基酸用于有效的分析。最近的研究已表明胰凝乳蛋白酶确实对PI摄食进行响应，并值得更详细的研究。当来自棉铃虫的幼虫进食由马铃薯蛋白酶抑制剂II、大豆胰蛋白酶抑制剂、aprotin(胰蛋白酶抑制剂)或马铃薯蛋白酶抑制剂I中任一种组成的食物时，在所有的情况下，胰凝乳蛋白酶mRNA的水平增加，而胰蛋白酶mRNA降低(Gatehouse等，1997，出处同前)。其它报道也提到优先于胰蛋白酶上调胰凝乳蛋白酶(Bown等，1997，出处同前；Wu等，Molecular Breeding 3371-380，1997)。Mazumdar-Leighton和Broadway(2001a，出处同前)在玉米夜蛾幼虫肠道中检测到胰凝乳蛋白酶活性，并发现SBTI抑制95％的来自对照昆虫肠道的胰凝乳蛋白酶，但是仅抑制35％的来自预先暴露于食物中的SBTI的昆虫肠道的活性。
因此，在补充肠道蛋白酶时，摄食蛋白酶抑制剂可以引起强烈的变化，其允许昆虫适应食物并存活。在进食人工食物和转基因植物的昆虫中，暴露于PI后，已经检测到在补充蛋白酶时的变化。调节这些变化的开关仍然是未知的，并且响应随物种、PI及其浓度以及基本食物而变。不清楚为什么一些抑制剂诱导这种响应而其它的则不诱导。然而，很清楚，一些幼虫在遗传上预先适应了PI，这是由于预先暴露于一种特定抑制剂对于待产生抗性的昆虫不是必需的(Broadway，1996，出处同前)。
需要确定和研究对PI不敏感的新昆虫蛋白酶，并利用这些来筛选蛋白酶拮抗物，以便研制可有效地用于对照昆虫生长、维持、发育和/或存活的试剂。
发明概述贯穿整个说明书，除非上下文另有需要，词语“包括”或变形如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所述的元素或整数或元素组或整数组，但并不排除任何其它元素或整数或元素组或整数组。
核苷酸和氨基酸序列用一种序列标识符数目(SEQ ID NO)表示。SEQ ID NO在数字上相应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO1)、<400>2(SEQ ID NO2)等。表1中提供了所有的序列标识符。在说明书末尾提供了序列表。
本发明提供了一种来自棉铃虫的种的新胰凝乳蛋白酶，本文中称为“HpCh5”。提及“HpCh5”包括所有的变体、衍生物、同系物和类似物，以及胰凝乳蛋白酶的HpCh5家族成员。HpCh5变体的例子包括蛋白酶抑制剂(PI)的敏感形式。这种敏感形式尤其可以在第192位携带天冬酰胺或谷氨酰胺，取代精氨酸。本文中，采用单一氨基酸命名法，这种取代称为“R192N/Q”，或采用3字母的氨基酸代码，称为“Arg 192 Asn/Gln”。HpF5的其它衍生物包括HpF5的信号序列。
HpCh5胰凝乳蛋白酶由一种被称为“HpF5”的核苷酸序列编码。同样，提及“HpF5”包括其变体、同系物及类似物。术语“HpF5”包括染色体组序列以及cDNA序列。HpCh5的氨基酸序列如SEQ IDNO2表示。N端活性肽的氨基酸序列显示为SEQ ID NO3。HpF5的编码区域的核苷酸序列如SEQ ID NO4表示，编码活性肽的核苷酸序列显示为SEQ ID NO5，并且其全部的5’-3’序列显示为SEQ ID NO6。HpCh5通常被表征为基本上对来自花烟草的PI的抑制不敏感。
HpCh5的变体和同系物包括在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少75％的氨基酸同一性的分子。HpF5的变体和同系物包括在最佳比对后具有与SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少约75％的相似性的核苷酸序列，或者在低严格条件下能够杂交到SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或其互补形式的一种核苷酸序列。
相应地，本发明一方面提供了包含核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码来自棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI展示抗性。
本发明另一方面提供了从棉铃虫的种分离的胰凝乳蛋白酶。其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI展示抗性，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物。
本发明提供的化合物可抑制HpCh5或其变体以及HpCh5胰凝乳蛋白酶家族的同系物或成员，或可抑制HpF5基因或其变体和同系物的表达。
化合物可以为化学类型的化合物，如喷洒或施加到植物的那些，或者为基因类型的分子，其可以局部施加或在植物细胞中生成。HpCh5或HpF5拮抗物也可以为现有植物PI的修饰形式。
因此，本发明提供的方法通过应用或分散HpCh5活性或HpF5基因表达的拮抗物，用于抑制植物的虫害，或用于延缓昆虫生长和发育。
拮抗物包括结合并抑制HpCh5的化合物以及由植物细胞产生并随后被昆虫摄入的反义或有义核酸分子。
提及″拮抗物″包括提及抑制剂。
本发明还提供了遗传修饰的植物，其被设计以产生HpCh5或HpF5拮抗物。提及“植物”包括单子叶植物或双子叶植物，并可以为从遗传转化的愈伤组织或组织或该植物的后代再生的植物。本发明还提供了来自本发明的遗传修饰的植物的种子和其它生殖物质。
本文中预期的植物包括棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李属、高粱属植物、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、木豆、鹰嘴豌豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(Dianthus)(观赏用植物)和天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、紫花苜蓿、羽扇豆、蚕豆、青豆、花生、菜籽油、金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花、蜡菊属(Helichrysum)(观赏用植物)、小麦、大麦、燕麦、黑小麦、胡罗卜、洋葱兰科植物、蔷薇属和/或矮牵牛花。
本发明还提供了编码马铃薯来源的蛋白酶抑制剂的核酸分子，例如但不局限于Pot1A和Pot1B或其同系物或衍生物，以及包括并能够表达相同的转基因植物。
本发明另一方面构思了一种用于筛选昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂的方法，所述昆虫胰凝乳蛋白酶对NaPI如HpCh5的抑制不敏感。该方法通常涉及在存在潜在抑制剂时检测胰凝乳蛋白酶活性。方便地在体外进行接触分析，尽管棉铃虫和/或澳洲棉铃虫的用途也包括在本发明中。本发明也预期采用该分析识别的分离抑制剂。
表1中提供了贯穿说明书使用的所有序列标识符。
表1所有的序列标识符
附图简述图1的图显示了杆状病毒表达的澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的温度稳定性。通过在40℃和70℃之间以5℃的间隔培养100μL等份的试样而比较了50mM醋酸钠中的小牛胰凝乳蛋白酶(◆)和HpF5(▲)。在冰上迅速冷却受热的样品后，于30℃下，通过用底物培养10μL bc或50μL HpF5，一式两份进行活性分析。残留活性以未经处理的对照组的活性百分数表示。
图2的图显示了进食低蛋白质扁豆人工食物或棉花叶人工食物的澳洲棉铃虫幼虫的生长，存在或不存在0.26％(重量/体积)的NaPI。对重量增加(mg)监测21天。对于进食两种人工食物的幼虫均以相同的速度生长，并且当存在NaPI时，生长被延缓。(A)幼虫生长。(B)进食棉花人工食物21天后幼虫的相对尺寸，存在或不存在0.26％的NaPI。在进食NaPI的20只幼虫中，仅有5只存活，并且21天后，所有这5只的重量低于对照幼虫。(C)NaPI对肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。当每只澳洲棉铃虫幼虫达到晚期第四/早期第五的发育龄期时提取肠道，并且在分析胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性前制备肠道提取物。来自进食对照棉花叶人工食物(CC)的各个幼虫的提取物以灰色显示，进食含有0.26％(重量/体积)NaPI(NC)的相同食物的幼虫以黑色显示。仅有4只测试幼虫存活到第五龄，而大多数对照幼虫存活。所有分析均一式两份进行。采用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性，采用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。活性单位以405nm/min/mg肠道提取物蛋白质的吸光度变化(±标准偏差)表示。相对于对照组，在来自进食NaPI幼虫的提取物中，胰蛋白酶的活性几乎被取消，尽管胰凝乳蛋白酶活性在4只进食NaPI的幼虫中的2只中较低。(D)在虫粪中，NaPIs对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。从进食棉花叶人工食物的每只幼虫收集虫粪，并且制备排泄物的提取物。在来自进食对照食物(CC)的幼虫的提取物中，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性以灰色显示，进食含有0.26％(重量/体积)NaPI(NC)的相同食物的幼虫以黑色显示。需要指出的是，在该分析中包括幼虫CC16和NC13的虫粪，但被排除在图2C之外，这时因为在制备提取物期间肠道被损伤。一式两份进行所有的分析。采用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性，并采用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。活性单位以405nm/min/mg排泄物的提取物蛋白质的吸光度变化(±标准偏差)表示。在来自进食NaPI的幼虫的提取物中，很明显胰蛋白酶的活性可以忽略，尽管相对于对照组胰凝乳蛋白酶活性被提高。(E)在对照组和进食NaPI的幼虫的虫粪中的胰蛋白酶水平。在15％(重量/体积)SDS-PAGE上分析虫粪提取物，并转移到硝化纤维素上。采用兔抗HpTRY1血清(1∶2000稀释)作为初级抗体，接着是二级抗体驴抗兔IgG-辣根过氧化酶偶联物(1∶2000稀释)来探查硝酸纤维素滤膜。利用增强的化学发光(ECL)试剂和Hyperfilm ECL X射线照片显现免疫反应的蛋白质。相对于对照组，在摄食NaPIs(NC)的幼虫虫粪中的胰蛋白酶显著增加(上表)，但是无活性(下表)，可能是因为它与NaPIs复合。相比之下，在对照幼虫(CC)的虫粪中，胰蛋白酶为有活性的，即使存在的量低于抗体的检测水平。(F)在进食NaPI的幼虫肠道中产生对NaPI不敏感的蛋白酶。将幼虫的肠道提取物进行抑制分析，以确定对NaPI不敏感的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。在存在或不存在80nM NaPI抑制剂时，将每种提取物于30℃下预培养30min(T1单体用于胰蛋白酶分析，C1单体用于胰凝乳蛋白酶分析)，之前加入底物以启动反应。不含抑制剂的提取物分析结果以灰色(对照幼虫)和黑色(进食NaPI幼虫)显示。含有抑制剂的提取物分析结果为带点的。一式两份进行所有的分析。活性单位以底物水解405nm/min/mg提取物蛋白质(±标准偏差)表示。(A)用T1抑制胰蛋白酶的活性。利用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性。(B)用C1抑制胰凝乳蛋白酶的活性。利用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。在对照幼虫的提取物中，T1几乎完全抑制胰蛋白酶活性，指示了这些幼虫不产生对NaPI不敏感的胰蛋白酶。来自进食NaPI幼虫的提取物含有可忽略的胰蛋白酶活性，但是该活性不能被T1抑制。在6只对照幼虫的提取物中，C1不抑制胰凝乳蛋白酶的活性，并且在对照组的剩余部分中仅部分抑制肠胰凝乳蛋白酶，指示出受控昆虫含有对C1不敏感的胰凝乳蛋白酶。在来自进食NaPI幼虫的提取物中，大多数的胰凝乳蛋白酶活性可以归因于对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。当用80nM胰凝乳蛋白酶预培养来自对照组和进食NaPI幼虫的提取物时，所有的胰凝乳蛋白酶活性均被取消。
图3的图显示出各种蛋白酶抑制剂对来自澳洲棉铃虫的未分离的肠道提取物中的胰凝乳蛋白酶活性的影响。在采用胰凝乳蛋白酶底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺培养前，将蛋白酶抑制剂与1μg来自未分离的肠道提取物的蛋白质混合。抑制以对照样品中的总活性百分数表示。
图4的照片显示出来自澳洲棉铃虫肠道的NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶的纯化和N端序列。(A和B)利用具有固定化的C1抑制剂的亲和柱，在纯化的不同阶段，采用蛋白质凝胶分析片段(图1)。(A)15％(重量/体积)SDS-聚丙烯酰胺凝胶，装有(a)未分级分离的肠道提取物(b)和(c)未键合的蛋白质。(B)12.5％(重量/体积)SDS-聚丙烯酰胺凝胶，装有(d)清洗级分(e)键合到C1柱的蛋白质。(C)在泳道(e)中，～24kD蛋白质的N端序列。
图5的图显示出来自澳洲棉铃虫的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的纯化和N端序列。(A)胰凝乳蛋白酶的PVDF印迹(i)从马铃薯抑制剂柱洗脱。在变性条件下，从基质中共洗脱马铃薯抑制剂II(ii)和马铃薯抑制剂I(iii)。(B)从PVDF印迹中获得的N端氨基酸序列。Rechla为获得的4个序列中最丰富的。
图6的图显示出pH和多种底物对来自澳洲棉铃虫中肠的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶活性的影响。SA2PF-pNA，N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺；SA2PL-pNA，N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺；MA2PM-pNA，N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Met-对硝基苯胺。
图7的图显示出设计用于扩增来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的寡核苷酸引物。从GenBank数据库中的DNA序列预测来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的排列。NCBI蛋白质数据库访问号在序列左边。将相应于寡核苷酸引物的区域加框，并将扩增方向用箭头显示。
图8的图显示出在RT-PCR扩增棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶时采用的寡核苷酸序列。
图9的图显示出来自扩增编码澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的cDNAs的PCR产物。从肠道mRNA制备的cDNA的PCR扩增为5种不同的胰凝乳蛋白酶产生了局部序列。将被翻译的序列进行排列，并将相应于PCR引物的区域框起来。
图10的图显示出来自澳洲棉铃虫的预测的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列排列。催化残基以实心三角形()标记。高度保守的活性位点图用灰色高亮显示。在所有的胰凝乳蛋白酶中，保守的二肽R-I(↓↓)为被提议的用胰蛋白酶切割活性肽的位点。位于底物结合口袋并具有底物特异性的残基以符号、§、#显示。在所有的胰凝乳蛋白酶中，半胱氨酸(●)残基为高度保守的。
图11的图显示出设计用于扩增编码对NaPI不敏感的来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的cDNA的寡核苷酸引物。(A)将2种对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端序列与从cDNA克隆预测的棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶进行比较。独特区域F1和F2为带阴影的。(B)寡核苷酸引物互补于不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端的独特区域。
图12的图形显示出核苷酸序列和从编码不敏感的胰凝乳蛋白酶的cDNA推导的氨基酸序列。不敏感的胰凝乳蛋白酶cDNA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。得自被纯化蛋白质的N端序列的氨基酸序列为灰色阴影。以箭头显示用胰蛋白酶进行的内蛋白水解切割的假定位点。在核苷酸序列中，双划线区域指用于PCR扩增的简并引物的位置。聚腺苷酸化作用信号序列为单划线的，并且星号标记终止密码子。假定的活性肽的推导的氨基酸序列计为-40到-1，接着是成熟域(+1)。相应于催化残基的3种氨基酸以符号#标记。胰凝乳蛋白酶底物特异性残基，丝氨酸，位于初级底物结合口袋的底部，用符号§来标记。
图13显示出澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶族的比对，显示出序列同一性。来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的5个族的成员的ClustalW比对。蛋白质序列以单字母代码给出。相同的氨基酸为黑色，相似的氨基酸为灰色。在右侧计数氨基酸，并且引入间隙以使排列最大化。对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶为族5的成员，并由185位的唯一一个精氨酸残基来表征(带箭头的)。人胰蛋白酶IV在类似位置也含有一个精氨酸残基(带箭头的)。
图14显示出将澳洲棉铃虫对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶与来自棉铃虫的同系物一起比对，其在185位也具有一个精氨酸残基。
图15显示出从澳洲棉铃虫为不敏感的(HpCh5)和敏感(HpCh2A)胰凝乳蛋白酶推导的蛋白质序列，对准小牛胰凝乳蛋白酶同工型A和B。采用ClustalW，将澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶HpCh2A和HpCh5对准牛胰凝乳蛋白酶同工型A和B。编号系统(排除间隔)符合用于牛胰凝乳蛋白酶的Greer命名法(Proteins7317-34，1990)。遍及序列的圆点表示保守的残基。灰色阴影区域代表组成表面环的残基，其包含在底物或抑制剂的识别和结合中。初级底物结合口袋由标记为S1A、S1B和S1C的区域形成。S1’位点由环35和60形成。黑框标记HpF5序列中的残基，其与其它胰凝乳蛋白酶中在相应位置的氨基酸明显不同。采用Greer，1990，出处同前命名法，这些残基为Asp36、Arg63、Thr72、Pro83、Gly109、Ileu120、129和130之间的Glu插入物、Glu134、Ser145、Arg192和Pro207。通过自催化切割，将框起来的氨基酸从牛胰凝乳蛋白酶中去除，导致形成α-胰凝乳蛋白酶。
图16的图显示出在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶HpCh2A的结构模型中的几个表面环大于在牛胰凝乳蛋白酶中的同源环。将澳洲棉铃虫F2A胰凝乳蛋白酶(灰色)的结构模型层压到来自Bos taurus(黑色)的a-胰凝乳蛋白酶结构上。在昆虫胰凝乳蛋白酶模型中，在底物识别中包含的表面环60、35和142较大。观察到胰凝乳蛋白酶底物特异性残基，丝氨酸189，其位于初级底物结合口袋的底部，为一个填充有范德华力半径图的空间。
图17显示出当与C1一起建模时，表面看来很容易容纳敏感性胰凝乳蛋白酶HpCh2A的谷氨酰胺192(Greer，1990，出处同前命名法，图15)。敏感性胰凝乳蛋白酶HpCh2A(灰色)与蛋白酶抑制剂C1(黑色)络合的结构模型。用箭头表示谷氨酰胺192的侧链。Gln192附近的C1残基以棍形表示(黑色)。
图18的图显示出围绕络合到C1的敏感和不敏感的胰凝乳蛋白酶的残基192的环境对比。图17显示了框区的放大图。不敏感的胰凝乳蛋白酶(B)的精氨酸192表面看来与C1抑制剂的残基不协调，相比之下，与敏感胰凝乳蛋白酶(A)的谷氨酰胺192无明显冲突。
图19的图形显示出当不敏感的胰凝乳蛋白酶络合到1类马铃薯蛋白酶抑制剂时，围绕精氨酸192的环境(PotIB，图24)。(A)不敏感的胰凝乳蛋白酶HpCh5(灰色)与马铃薯I类蛋白酶抑制剂PotI(黑色)络合的结构模型。(B)围绕Arg 192的区域的放大图(B中的框区)。标记精氨酸192的侧链。在Arg 192附近的PotI残基显示为棍形(黑色)。
图20的照片显示出在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达胰凝乳蛋白酶克隆HpF2B，用于产生多克隆抗体。(A)在用考马斯兰染色的12.5％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上诱导HpCh2B后，在0-5hr的时间点分离总的细胞溶菌产物。泳道用诱导后的小时数标记，并且箭头显示具有正确的预测分子质量的被诱导蛋白质的位置。(B)面板1在Talon树脂(BD Biosciences Clontech)上纯化细菌表达的HpCh2B，在15％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上分离，并用考马斯兰染色。面板2将与面板1相同的样品转移到硝化纤维素上，并用抗HpCh2B抗体免疫染色。(C)通过SDS-PAGE分离数量减少的(200、150、100、75、50、25、20、10、0ng)细菌表达的胰凝乳蛋白酶HpCh2B，并用银染色，以及采用抗胰凝乳蛋白酶HpCh2B抗体检测相同凝胶的蛋白质印迹(1/2500)。澳洲棉铃虫抗体具有的检测限为20ng细菌表达的蛋白质。
图21的照片显示出抗体特异性，培养对抗来自澳洲棉铃虫的细菌表达的对NaPI不敏感的(HpCh5)和敏感(HpCh2B)的胰凝乳蛋白酶。采用SDS-PAGE，在12.5％(重量/体积)聚丙烯酰胺凝胶上分离细菌表达的对NaPI不敏感的(R)和敏感(C)的胰凝乳蛋白酶，并且(A)用考马斯兰染色，(B)用α-His标签抗体进行免疫印迹，(C)采用抗体免疫印迹到HpCh2B胰凝乳蛋白酶(α-RC)，以及(D)采用抗体免疫印迹到HpCh5胰凝乳蛋白酶(α-SC)。
图22显示出纯化来自马铃薯块茎的PotI。通过酸提、硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化来自马铃薯块茎(Russet Burbank)的PotI。(A)银染色的SDS-PAGE。泳道1分子尺寸标记物(kDa)，泳道2集中对照的PotI，含有来自G-75柱的片段，泳道3航道2的免疫印迹，利用了在兔中培养的抗体到连接到匙孔血蓝蛋白的PotI的商业制品(Calbiochem)。确定PotI为单带，近似质量为6kDa。(B)来自A的集中对照的G-75片段的RP-HPLC。峰1、2和3为PotI同工型，峰4为污染的蛋白质。
图23的图显示出将棉铃虫幼虫生长在含有NaPI和PotI人工食物中。进食棉花叶人工食物使棉铃虫幼虫生长，存在或不存在0.26％(重量/体积)NaPI或0.26％(重量/体积)NaPI和0.26％(重量/体积)PotI。从马铃薯块茎纯化PotI(var Russet Burbank)，参见图22。在每种食物上使用了25只幼虫。在孵化后的第7、10、12、14和17天测量幼虫的重量。在第17天，仅食用NaPI的幼虫为对照组的84％，并且食用NaPI和PotI的幼虫为对照组的34％。2只进食对照食物的幼虫死亡，7只进食NaPI食物的幼虫死亡，并且6只进食NaPI和PotI食物的幼虫死亡。
图24显示出预测的StPotIA和StPotIB的氨基酸序列排列，具有马铃薯抑制剂I族成员。马铃薯抑制剂I族的几种成员的ClustalW排列。X67950马铃薯cDNA，(Beuning和Christeller，Plant Physiol 1021061，1993)，P01052马铃薯蛋白质(Richardson和Cossins，FEBS Letters，52161，1975)，M17108马铃薯染色体组序列(Cleveland等，Plant Mol.Biol.8199-207，1987)，K03290番茄(Graham等，J.Biol.Chem.，2606555-6560，1985)Z12619烟草(Lindhorst等，Plant Mol.Biol.21985-992，1993)，X78988玉米(Jose Cordero等，Plant J.6141-150，1994)，EILXCHleech(See Muller等，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.3581105-1117，1977)。*P1反应位点。StPotIA和StPotIB与来自马铃薯的其它族成员类似。然而，StPotIA在41-44位具有另外4个氨基酸，在来自番茄(K03290)的受伤诱导的PotI中也发现如此。StPotIB在P1位具有一个蛋氨酸，其对于马铃薯分离物是共有的。StPotIA在P1位具有一个丙胺酸，这对于来自马铃薯的PotI分离物还未报道，但出现在来自玉米的PotI分离物中(X78988)。
图25的图显示出纯化大肠杆菌表达的StPotIA和StPotIB。采用融合到StPot1A和StPotIB的N端HIS标签和金属亲和树脂接着是RP-HPLC来纯化StPot1A和StPotIB。经RP-HPLC分离后的图。采用线性梯度为0-100％的缓冲液B(80％(体积/体积)乙腈，0.1％(体积/体积)TFA)，流速为1ml/min，洗脱蛋白质超过60min。(A)StPotIA，(B)StPotIB。保留时间为36min时，在一个主峰中洗脱出StPotIA(60％缓冲液B)，并且保留时间为25min时，在一个主峰中洗脱出StPotIB(42％缓冲液B)。采用SDS-PAGE分析峰，并用银染色(在A中的插入物)。泳道1为StPotIA(pk1)，泳道2为StPotIB(pk2)，并且泳道3为来自马铃薯块茎的经纯化的PotI。StPotIA和StPotIB到从块茎分离的Pot1同工型混合物(6kDa)具有不同的表观迁移率(10kDa)，这是由于位于N末端的其它HIS-标签表位。
图26的图显示出细菌表达的StPotIA和StPotIB对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的抑制。采用纯化的PotI抑制来自澳洲棉铃虫肠道的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。(A)底物SA2PFpNA，发育时间30min，(B)底物SA2PLpNA，培养30min。来自马铃薯块茎的PotI同工型混合物(圆圈)、StPotIA(正方形)、StPotIB(三角形)。StPotIA、StPotIB和来自马铃薯块茎的PotI为对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的良好抑制剂。
图27的图显示出使棉铃虫幼虫生长在表达NaPI和PotI的转基因棉花上。将转基因棉花cv Coker 315用于采用棉铃虫的生物测定中。将30只幼虫食用对照的未变形Coker 315、转基因系1(NaPI)、转基因系2(StPot1A)或转基因植物3(NaPI X StPot1A)的叶子。在孵化后第7天测量幼虫的重量。(A)幼虫生长。在第7天，食用表达NaPI的叶的幼虫为食用未变形叶的对照幼虫重量的86％。食用表达StPotIA的叶的幼虫为对照组的92％，并且食用表达NaPI和StPotIA的叶的幼虫为对照组的46％。(B)摄食NaPI和PotI对肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。在每次实验中，集中对照来自幼虫的肠道并制备提取物。一式两份进行所有的分析。利用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性(黑色)，并且用SA2PFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性(灰色)。活性单位以405nm/min/ug肠道提取物蛋白质的吸光度变化表示。相对于对照组，在食用表达NaPI和NaPI+StPotIA的叶的幼虫提取物中，胰蛋白酶的活性减小。在食用表达NaPI或NaPI+StPotIA的叶的幼虫提取物中，胰凝乳蛋白酶的活性增加，并在仅食用StPotIA的幼虫提取物中减小。
图28的图显示出核苷酸序列和从编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的HpF5 cDNA推导的氨基酸序列，以及寡核苷酸引物的位置，用于向HpCh5加入一个内质网序列。将FwBacRBCH1引物用于加ER信号序列的第一半和一个不活动突变，将A变为G，以破坏BamHI切割位点。FwBacRECH2引物将用于ER信号的译码序列的剩余部分和一个BamHI切割位点加入到序列的3’端。在组氨酸标签前加入ER信号，以便能够在细胞处理后通过金属亲合色谱法纯化被表达的蛋白质。加入的氨基酸为灰色阴影。
图29的照片显示出在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达胰凝乳蛋白酶克隆HpF5。在12.5％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上分离被表达的蛋白质，并采用α-HpCh5-抗体(A)RCDNA进行免疫印迹。通过用20μl bacmid DNA转染HIGH FIVE(商标)昆虫细胞而产生HpCh5。对照组；将被bacmid DNA转染的(pFastBac载体)昆虫细胞用不含HpF5插入物的pFastBac载体调换；用未被调换的bacmid DNA转染(蓝色菌落)昆虫细胞；(单独的细胞)未被转染的昆虫细胞；单独用CELFECTIN(注册商标)处理的(Cellfectin)昆虫细胞；阳性对照+为细菌表达的HpCh5，具有一个六组氨酸标签。(B)采用被病毒RC24、48和72感染的HIGH FIVE(商标)昆虫细胞产生HpCh5。用HpF5重组病毒感染后24、48和72小时收集介质。对照组24、48和72。来自用病毒处理过的细胞的、从未转染的bachmid(蓝色菌落)制备的介质用于24、48和72小时。阳性对照为细菌表达的HpCh5，具有一个六组氨酸标签。
发明详述部分地断定本发明为识别和克隆一种新的昆虫胰凝乳蛋白酶分子，以术语“HpCh5”表示。本文中，将编码HpCh5的cDNA称作“HpF5”。分离该分子可允许识别和设计一系列的产品，其有效地用于控制棉铃虫的种和其它昆虫的生长、发育和/或全部的生物适合度。这些产品通常作为HpCh5功能或HpF5基因表达的拮抗物，并有效地用作昆虫控制剂。
HpCh5的氨基酸序列如SEQ ID NO2表示。HpF5的核苷酸序列如SEQ ID NO4和6表示。
本文中，提及“HpCh5”应当理解为提及HpCh5的所有形式，包括，例如，源于HpF5 mRNA的其它剪接的任何肽同工型、HpCh5的突变体或多态性变体、HpCh5的任何翻译后的修饰形式或HpCh5的任何非翻译后的修饰形式，以及在其它昆虫物种或菌株中的任何同系物。术语“HpCh5”也包括胰凝乳蛋白酶分子的HpCh5族成员。在没有特别指定的时，本文中提及HpCh5包括其衍生物、同系物、类似物、化学等价物及模仿物。提及HpCh5也指提及任何在最佳比对后具有与SEQID NO2至少75％的氨基酸同一性的变体。HpCh5变体的实例包括对PI敏感的变体，如特别是具有一个Arg 192 Gln或Arg 192 Asn取代的那些。其它变体包括HpCh5的N端信号序列，如SEQ ID NO3所定义的，并且由如SEQ ID NO5表示的核苷酸序列编码。所述变体包括一种含有氨基酸序列的信号序列，其在最佳比对后具有与SEQ IDNO3至少约75％的相似性，或被一种具有与SEQ ID NO5至少约75％的同一性的核苷酸序列编码，或被一种在最佳比对后能够杂交到SEQID NO5的核苷酸序列编码。
提及“HpF5”应当理解为提及HpF5的所有形式，包括任何cDNA同工型、染色体组形式、突变体和HpF5的多态变体，以及任何来自其它物种或昆虫菌株的同系物。术语“HpF5”也包括编码HpCh5或HpCh5类型的胰凝乳蛋白酶的基因的HpF5族成员。在未特别指定时，本文中，提及HpF5包括提及HpF5的衍生物，以及一种具有与SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少约75％的同一性的核苷酸序列，或者在严格性低的条件下，能够杂交到SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或其互补形式的一种核苷酸序列。被定义为SEQ ID NO3并且被SEQ IDNO5编码的HpF5的信号序列也包括其变体。如上所示，所述变体包括一种信号序列，该信号序列在最佳比对后具有与SEQ ID NO3至少约75％的相似性，和/或被一种在严格性低的条件下能够杂交到SEQID NO5上的核苷酸序列编码，和/或被一种在最佳比对后具有与SEQID NO5至少约75％的同一性的核苷酸序列编码。
在描述本发明的细节前，将要理解，除非另有规定，本发明不局限于特定的组分制剂、制造方法、施用方案等，由于这些可以变化。也要理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施例，并非用于限制。
必须指出，如在说明书中所用的，单数形式的“一个”包括复数方面，除非上下文清楚地另有规定。因此，例如，提及“试剂”或“拮抗物”包括一种单一的试剂或拮抗物以及两种或多种试剂或拮抗物等。
在描述和请求保护本发明时，根据下面提出的定义使用以下术语。
术语“化合物”、“试剂”、“活性试剂”和“活性剂”在本文中相互交替使用，指一种化学的化合物，其抑制HpCh5的活性或相应于HpF5的染色体组基因的表达。该术语也包括那些活性试剂在农业上或园艺上的活性成分，在本文中专门提到的，包括不局限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用术语“化合物”、“试剂”、“活性试剂”或“活性剂”时，将要理解为这包括试剂本身，以及在农业上或园艺上可接受的、生理学上的活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“化合物”并非仅被解释为一种化学化合物，而是扩展至肽、多肽和蛋白质以及遗传分子如RNA、DNA及其化学类似物。
因此，本发明预期的化合物可有效地用于下调HpCh5的活性，或下调相应于HpCh5的染色体组基因的表达。术语“下调”包括抑制HpCh5的活性。抑制HpCh5或降低其水平具有降低或延缓昆虫生长的作用。抑制HpCh5的活性或HpF5的基因表达可以通过在植物中产生抑制剂而发生，其随后被昆虫摄食，或者所述抑制剂可以局部应用到植物，或喷洒或者另外散布到昆虫或昆虫源。这样，植物可以产生核酸分子，当被昆虫摄食时，其干扰HpF5的表达。供选地，植物可以产生能够抑制HpCh5的PI。在另一供选的方式中，HpCh5抑制剂为非蛋白质的化学物质，被施加到植物表面，或被植物的根系统吸收。本文中，提及“植物”不排除树或来自植物(或树)的培养组织(例如愈伤组织)。
提及化合物、试剂和活性剂也包括化合物、试剂或活性剂的组合。所述组合物可以制备在多部分的农业或园艺组合物中，在分散或顺序使用前，将它们混合在一起。
如本文中使用的，术语试剂的“有效量”、“杀虫有效量”和“昆虫静态有效量”指足量的试剂以减小或延缓昆虫的生长和发育和/或杀死或抑制昆虫。
采用“农业上可接受的”或“园艺上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂指的是一种媒介，其包括一种非环境中的或者植物或非目标昆虫不期望的物质。载体可以包括赋形剂和其它添加剂，如稀释剂、洗涤剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
如本文中所用的，与植物或根除昆虫有关的术语“处理”指降低植物虫害症状的严重性，或者试剂应用到一组昆虫，导致其延缓生长、发育、生物适合度或保持良好状态。
本发明的化合物可以为大的或小的分子、核酸分子(包括反义的或有义的分子)、肽、多肽或蛋白质或混合分子，如RNAi-或siRNA-复合物、核酶或DNA酶。
术语“核酸分子”也包括“遗传分子”，并包括发夹结构，如包括RNAi-介导的转录后基因沉默或甲基化介导的沉默的那些。
相应地，本发明一方面提供了一种分离的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括编码一种新胰凝乳蛋白酶蛋白质或其衍生物、同系物或模仿物的核苷酸序列，其中，所述胰凝乳蛋白酶对花烟草的PI不敏感。
更具体地，本发明涉及一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括一种核苷酸序列或与一种核苷酸序列互补的核苷酸序列，其编码了一种基本上如SEQ ID NO2或其衍生物、同系物或模仿物表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少约75％或更大的同一性或如SEQ ID NO4或SEQ ID NO6表示的一种核苷酸序列，或一种具有与SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少约75％或更大的相似性的核苷酸序列，或一种在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或其互补形式的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了一种分离的胰凝乳蛋白酶(棉铃虫的种)。其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物展示抗性。
更具体地，分离的胰凝乳蛋白酶包含一种如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少约75％的相似性的一种氨基酸序列。
如本文中所用的，术语“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上，在被对比的序列之间的精确同一性。当在核苷酸水平上有非同一性时，“相似性”包括序列间的区别，其形成在结构、功能、生化和/或构象水平上相互相关的不同氨基酸。当在氨基酸水平上有非同一性时，“相似性”包括在结构、功能、生化和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在特别优选的实施例中，在同一性水平上将核苷酸和氨基酸序列进行对比，而不是相似性。
用于描述两种或多种多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“对比窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分数”、“序列同一性百分数”、“基本上相似”和“基本的同一性”。“参考序列”至少为12个，但常见的是15-18个，并经常是至少25个或更多，如30个单体单位，在长度上包括核苷酸和氨基酸残基。因为两种多核苷酸可以每个都包括(1)在两种多核苷酸之间为相似的一种序列(即仅全部多核苷酸序列的一部分)，以及(2)在两种多核苷酸之间有分歧的一种序列，在两种(或多种)多核苷酸之间的序列对比典型地是通过比较“对比窗”上的两种多核苷酸序列而实现，以确定并比较序列相似性的本地区域。典型地，“对比窗”指12个邻近残基的概念片段，其与参考序列进行对比。与参考序列相比(其不包括增加或删除)，对比窗可以包括约20％或更小的增加或删除(即间隙)，以便最佳排列两种序列。通过计算机执行算法，可以进行对准对比窗的最佳排列序列(在Wisconsin遗传软件包释放7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机组，575Science Drive Madison，WI，USA)，或通过检查和最佳排列(即在对比窗上导致最高的同源百分数)，由选取的各种方法中的任何一种产生。也可以参考程序的BLAST族，例如，由Altschul等所公开的(核酸研究.253389-3402，1997)。可以在Ausubel等的单元19.3中发现对序列分析的详细讨论(“分子生物中的当前纪录”JohnWiley & Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)。
如本文中所用的，术语“序列相似性”和“序列同一性”指对比窗上在核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的基础上，序列的相同或功能上或结构上的相似程度。因此，例如，通过在对比窗上比较两种最佳排列的序列计算“序列同一性百分数”，测定在两种序列中出现相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数，以生产匹配位置数，用对比窗(即，窗尺寸)中的位置总数去除以匹配位置数，并将结果乘以100以生产序列同一性百分数。为实现本发明的目的，“序列同一性”将被理解为指用DNASIS计算机程序计算的“匹配百分数”(对于windows，为版本2.5；购自Hitachi软件工程有限公司，South San Francisco，California，USA)，利用了标准偏差，如在与软件一起的参考手册中使用的。相似的注释应用在相关的序列相似性上。术语“相似性”特别有效地用于描述氨基酸序列对比。术语“同一性”特别有效地用于描述核苷酸序列对比。
提及至少约75％的同一性或75％的相似性包括同一性和相似性百分数大于75％，如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
本文中，提到低严格性指从至少约0到至少约15％(体积/体积)的甲酰胺(包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％和14％(体积/体积)甲酰胺)以及从至少约1M到至少约2M的盐，用于杂交，以及至少约1M到至少约2M的盐，用于清洗条件。通常，低严格性为从约25-30℃到约42℃。温度可以改变，并且较高的温度用于取代甲酰胺，和/或生成供选的严格性条件。当需要时，可以应用供选的严格性条件，如介质严格性，其包括并包含从至少约16％(体积/体积)到至少约30％(体积/体积)的甲酰胺，以及从至少约0.5M到至少约0.9M的盐，用于杂交，和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，用于清洗条件，或者高严格性，其包括并包含从至少约31％(体积/体积)到至少约50％(体积/体积)的甲酰胺，并从至少约0.01M到至少约0.15M的盐，用于杂交，以及至少约0.01M到至少约0.15M的盐，用于清洗条件。通常，在Tm＝69.3+0.41(G+C)％下进行清洗(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5109，1962)。然而，误配的碱基对数目每增加1％，双链DNA的Tm降低1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.4683，1974)。在这些杂交条件下，甲酰胺为优选的。相应地，特别优选的严格性水平为如下所定义的在25-42℃下，低严格性为6×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS；在20℃-65℃的温度范围内，中等严格性为2×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS；在温度至少为65℃时，高严格性为0.1×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS。
本发明另一方面预期了一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括一种基本上如SEQ ID NO4或SEQ ID NO6表示的核苷酸序列，或一种具有与SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少75％或更大的相似性的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物，或者在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或其互补形式并编码一种基本上如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的核苷酸序列或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少75％或更大的同一性的，该核酸分子编码对花烟草的蛋白质抑制剂不敏感的胰凝乳蛋白酶核苷酸序列。
本发明另一方面预期一种核酸分子，包括一种基本上如SEQ IDNO4或SEQ ID NO6表示的核苷酸序列。编码HpCh5的核酸分子优选脱氧核糖核酸序列，如cDNA序列或染色体序列。染色体序列也可以包括外显子或内含子。染色体序列也可以包括启动子区域或其它的调节区域。本发明还预期HpF5的分离的内含子和外显子，如植物细胞中包含在遗传网络内的那些。
根据本发明这一方面，本文中，核酸分子相应于HpF5。根据本发明，已经测定了该cDNA编码蛋白质，所述蛋白质在胰凝乳蛋白酶基因族组中定义了一个新的胰凝乳蛋白酶族，家族5，并且在本文中该蛋白质指HpCh5。提及“HpF5”也包括基因的染色体组形式。在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因族中，如表2所示，同源性水平有变化。族5由HpF5举例说明，并且最类似于族2A，为73％，并且最不类似于族4，为＜20％。不希望以任何方式限制本发明，通过N端的两种独特性序列伸展(F1和F2)以及通过相应于NaPI敏感胰凝乳蛋白酶的6个氨基酸取代来举例说明HpCh5。这些取代中的5个表面看来未落入功能上的有意义区域，然而，第6个取代与一个β-链相关，该链形成初级底物结合口袋的壁。对于S1域，该取代的位置和从谷氨酰胺转化为精氨酸为极不寻常的，所述S1域以排列非极性残基为主，所述残基限定了胰凝乳蛋白酶的特异性。
表2澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因族成员间的蛋白质序列同一性百分数
因此，本发明提供了一种具有胰凝乳蛋白酶活性的分离蛋白质，其基本上不受来自花烟草的PI抑制。相应地，本发明另一方面涉及一种从如下列表中选择的分离蛋白质(i)一种新的胰凝乳蛋白酶蛋白质，或其衍生物、同系物或模仿物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对花烟草蛋白酶抑制剂不敏感；(ii)一种蛋白质，具有基本上如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少75％或更大的同一性的序列；(iii)一种蛋白质，由一种基本上如SEQ ID NO4或SEQ IDNO6表示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物编码，或由一种具有与SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少75％的相似性的核苷酸序列编码，或一种编码基本上如SEQ ID NO2表示的一种氨基酸序列或其衍生物、同系物或模仿物的序列，或在最佳比对后具有与SEQ IDNO2至少75％或更大的相似性的序列；(iv)一种蛋白质，由一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码，包括一种基本上如SEQ ID NO4或SEQ ID NO6表示的核苷酸序列，或其衍生物、同系物或类似物，或者在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO4或SEQ ID NO6上并编码一种基本上如SEQ IDNO2表示的氨基酸序列的核苷酸序列，或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO2至少75％或更大的相似性的序列。
(v)一种新的胰凝乳蛋白酶蛋白质，或其衍生物、同系物或模仿物，具有一个精氨酸，用于取代初级底物结合口袋中的天冬酰胺或谷氨酰胺。
本发明公开了一种新胰凝乳蛋白酶的氨基酸和相应的cDNA序列，该酶对由茄属物种如花烟草产生的Type II丝氨酸蛋白酶抑制剂不敏感。因此，其可以用作一种控制携带该不敏感蛋白酶的昆虫之试剂的靶。已经显示了抑制HpCh5活性的许多化合物，并且作为优选的实施例，在表3中可发现这些化合物的列表。
表3多种蛋白酶抑制剂对来自澳洲棉铃虫的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶和牛胰凝乳蛋白酶的活性影响
SBTI，大豆胰蛋白酶抑制剂；PMSF，苯甲基磺酰氟；Bowman Birk，大豆Bowman Birk抑制剂；利马豆，利马豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)；PotI，马铃薯蛋白酶I型抑制剂。牛胰凝乳蛋白酶(BC)。
未将这些化合物中任何一种的作用模式限制到任何一种活性，3D模型被用于研究PotI和肽的结合能力，该肽被NaPI的C1域编码到对NaPI不敏感的和对NaPI敏感的昆虫胰凝乳蛋白酶上。
从cDNA克隆HpF2A(对NaPI敏感的)和HpF5(对NaPI不敏感的)推导的氨基酸序列被建模在Solenopsis invicta(火蚁)和Bostaurus(牛)胰凝乳蛋白酶的结构上，得自Research Collaboratory，用于结构生物信息学(RCSB)蛋白质数据库。
预测棉铃虫胰凝乳蛋白酶采用了与所有的胰凝乳蛋白酶报道的可在数据库中获得的相似结构。建模结构具有典型的丝氨酸蛋白酶折叠，由两种6链的反平行β圆筒组成，具有位于两个域之间的催化三分体。在哺乳动物胰凝乳蛋白酶中，某些表面环被切割(环142)，但是在昆虫胰凝乳蛋白酶中保持完整。因此，需要火蚁胰凝乳蛋白酶结构(Botos等，J.Mol.Biol.298895-901，2000)以帮助精细调整棉铃虫胰凝乳蛋白酶模型中这些表面环的定向。在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶中，两个表面环60和142相当大(图15，16)。
将C1与对NaPI敏感和对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶一起建模，以研究在对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶中，什么样的残基可能参与抑制剂结合丧失。先前采用1H NMR测定了胰凝乳蛋白酶抑制剂C1的结构(Nielson等，1994，出处同前)，但还没有在蛋白酶络合物中进行测定。因此，来自Solanum tuberosum的相关蛋白酶抑制剂PCI-1与来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶B复合(Greenblatt等，J.Mol.Biol.205201，1989)提供了一种引导复合物排列的适当基础。C1胰凝乳蛋白酶复合物的能量最小化显示出在可能的24个假定的接触残基中，Arg192(胰凝乳蛋白酶编号系统)作为唯一的可能候补物质可引起这种抗性。含有与C1复合的Arg192残基、对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(Greer命名法，Greer，Proteins 7317-34，1990。图15)不能正确地能量最小化，这是由于Arg192和C1之间的空间接触，然而，在与C1复合的Na-PI敏感胰凝乳蛋白酶中，Gln192残基不引起所述问题，这是由于其尺寸小得多。图17显示出在C1-HpF2A胰凝乳蛋白酶络合物中围绕Gln192的结合区域的近视图。很清楚，Gln192不与抑制剂分子上的任何区域冲突。然而，与C1-HpCh5胰凝乳蛋白酶模型中的共有Arg残基的对比证明了没有足够的空间容纳该大得多的C1中的Thr5和Ala9相接触的残基。而且，将StPot1A抑制剂建模到HpCh5显示出对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶可以容纳Arg192残基，与由StPot1A抑制该胰凝乳蛋白酶一致(图19)。
总之，来自棉铃虫物种的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶在第192位天冬酰胺或谷氨酰胺的位置具有一个精氨酸，其延伸入S1结合口袋，并且表面看来干扰C1结合。而且，很清楚，该Arg残基不干扰PotI结合，这与观察的PotI为比NaPI抑制剂更加有效的昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂的结果一致。从马铃薯块茎纯化大量的PotI抑制剂(图22)以评价NaPI和PotI对棉铃虫幼虫生长的组合作用(图23)。生物测定证实PotI显著增强了NaPI抑制剂的活性。一起食用NaPI和PotI的毛虫(分别为0.26和0.34％(重量/体积))为发育第五龄期的对照幼虫尺寸的34％，然而，仅进食NaPIs的毛虫为对照组尺寸的约84％。
因此，本发明另一方面提供了一种用于调节昆虫中HpCh5或其同系物或变体活性的方法，所述方法包括将HpCh5蛋白质或其同系物或变体与有效量的一种试剂接触一段时间，并且是在足以降低或增加HpCh5活性的条件下。
本发明另一方面提供了一种用于调节昆虫中HpF5或同系物或变体的表达的方法，所述方法包括将HpF5或其同系物或变体与有效量的试剂在足以降低或增加HpF5表达的条件下接触一段时间。
根据这些和其它方面，优选的目标昆虫为棉铃虫物种和其它鳞翅目物种。此外，被保护的植物包括对棉铃虫、澳洲棉铃虫、玉米夜蛾和H.virescens敏感的那些。所述植物包括对棉铃虫敏感的植物，如棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李属、高粱属植物、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、木豌豆、鹰嘴豌豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(观赏用植物)、天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、紫花苜蓿、羽扇豆、蚕豆、青豆、花生、菜籽油、金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花和蜡菊属(观赏用植物)。
本文中预期的其它植物包括谷类(如小麦、大麦、燕麦、黑小麦等)、园艺植物(例如苹果、胡罗卜、洋葱等)、装饰用植物(如兰科植物、蔷薇属、矮牵牛花等)和树。
因此，本发明预期了筛选化合物方法，其抑制或作为HpCh5活性或HpF5基因表达的拮抗物。例如，一种方法涉及将候选化合物与HpCh5接触。筛选方法包括检验(i)存在化合物和HpCh5的复合物，或(ii)HpF5 cDNA或染色体组DNA的表达水平改变。检验的一种形式涉及竞争结合分析。在所述竞争结合分析中，HpCh5典型地被标记。从任何推定的复合物中分离游离的HpCh5，并且游离(即未复合的)标记物的数量为被测试剂与HpCh5结合的一种量度。也可以测定结合的而不是游离的HpCh5的数量。也可能标记化合物而不是HpCh5，并在存在和不存在被测化合物时，测定结合到目标的化合物的数量。所述化合物可以抑制HpCh5。对于结合并抑制HpF5或其mRNA转录的化合物，可以采用一种相似的方法。
用于试剂筛选的其它技术提供了可高通量筛选对HpCh5具有适当结合亲和力的化合物，并详细描述在Geysen中(国际专利公开文本WO 84/03564)。简单地说，在固态底物如塑料插头或一些其它表面上合成大量不同的小肽测试化合物。将肽测试化合物与HpCb5进行反应并清洗。随后，采用本领域公知的方法检测结合的HpCh5分子。该方法可以用于筛选非肽、化学物质。因此，该方面扩展至组合的方法，包括噬菌体展示，以筛选HpCh5拮抗物。
被纯化的HpCh5可以直接涂敷到平板上，用于前述的试剂筛选技术。然而，也可以利用HpCh5的非中和抗体，以便将HpCh5固定到固定相上。
活的动物如棉铃虫和/或澳洲棉铃虫也可以被用在喂养试验中，以寻找潜在的抑制剂。
本发明也预期竞争试剂筛选分析的用途，所述方法中，能够特异性地结合HpCh5的中和抗体与测试化合物竞争，以结合到HpCh5或其片段上。以这种方式，抗体可以被用于检测存在任何共享HpCh5的一种或多种抗原决定簇的肽。
然而，另一有用的化学修饰化合物类似物来源可以被用于诱导生化或遗传途径的反馈抑制，以产生真实的HpCh5。
本文中预期的HpCh5类似物包括但不局限于修饰侧链，包括在肽、多肽或蛋白质合成期间的非天然氨基酸和/或其衍生物的掺入，以及使用交联剂和其它方法将结构限制强加到HpCh5上。
本发明预期的HpCh5侧链修饰的实例包括修饰氨基基团，如通过与醛反应，接着是用NaBH4还原进行还原性烷基化；用甲基乙酰亚氨酯进行脒化；用乙酸酐酰化；用氰酸盐甲氨酰化氨基基团；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苄基化氨基基团；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐酰化氨基基团；以及采用吡哆醛-5-磷酸吡哆化赖氨酸，接着是用NaBH4还原。
通过与试剂如2，3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛形成杂环缩合物，可以修饰精氨酸残基的胍基团。
可以通过形成O-酰基异脲以及随后的衍生化，例如为相应的由碳二亚胺活化修饰羧基。
巯基可以采用如下方法被修饰，如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧基甲基化；过甲酸氧化为磺基丙氨酸；与其它巯基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺进行反应；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯基磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞化合物形成汞化合物衍生物；在碱性pH下与用氰酸盐进行甲氨酰化。
色氨酸残基可以被修饰，例如，通过用N-溴琥珀酰亚胺氧化，或者用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤化物烷基化吲哚环。另一方面，可以通过采用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变酪氨酸残基。
通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化，可以实现对组氨酸残基的咪唑环的修饰。
在肽合成期间，掺入非天然的氨基酸和衍生物的实例包括但不局限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基氨基乙酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或D-氨基酸同工型。表4显示了本文预期的非天然氨基酸的列表。
表4非常规氨基酸的代码
可以使用交联剂，例如，为了稳定3D构型，采用了同型双功能团的交联剂，如双功能团的酰亚胺酯，其具有(CH2)n间隔基团，其中n＝1到n＝6，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，和异双功能团的试剂，其通常含有一个氨基反应部分，如N-羟基琥珀酰亚胺和其它基团特异性的反应部分，如马来亚氨或二巯基部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。此外，肽可以在构型上被限制，例如，通过掺入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键，并通过引入共价键(如在N和C末端之间、在两个侧链之间或在一个侧链和N或C末端之间形成酰胺键)而形成环肽或类似物。
所述类似物，尤其是如果它们保留活性，或甚至是HpCL5分子本身，可以具有类似应用，如在洗衣粉或去污剂中。
本发明另一方面预期了任何化合物，其与HpCh5或其衍生物或变体结合或者发生其它的相互作用，或者诱导HpCh5合成的反馈抑制，导致HpCh5的活性或水平下调。
本发明也有效地用于筛选其它可减小HpF5表达的化合物。可以采用多种试剂筛选技术，如本文和在国际
发明者K·M·当斯, R·L·希斯, M·A·安德森 申请人:赫希玛有限公司, 拉特罗布大学