专利名称：醋酸菌的乙醇脱氢酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个来源于微生物的编码具有生长促进功能蛋白的基因、一种扩增了该基因拷贝数目的微生物、特别是属于醋酸杆菌属(Acetobacter)的醋酸菌或者属于葡糖酸醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸菌，以及一种使用这些微生物有效生产含高浓度醋酸的醋的方法。
背景技术：
醋酸菌是广泛应用于醋生产的微生物。特别地，属于醋酸杆菌属的醋酸菌或者属于葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌可用于工业醋酸发酵。
在醋酸发酵中，培养基中的乙醇被醋酸菌氧化并转变为醋酸，从而在培养基中富集醋酸。然而，醋酸对醋酸菌具有抑制作用。当富集的醋酸量增加并且培养基中的醋酸浓度增高时，醋酸菌的生长能力与发酵能力逐渐降低。
特别地，生长诱导期，即直至醋酸菌真正开始生长，此后才可能确认醋酸富集的这段时期，将随醋酸浓度的增高而变得更长。
因此期望在醋酸发酵中，甚至在高浓度醋酸的条件下也能够进一步缩短生长诱导期。作为实现该目标的一种方式，通过向发酵液中添加PQQ(4，5-二氢-4，5-二氧代-1-吡咯并[2，3-f]醌-2，7，9-三羧酸)以促进生长进而缩短所谓的生长诱导期(例如，参见专利文献1)的方法已有报道。
然而，大量获得PQQ比较困难，而且PQQ价格昂贵。因而以工业规模实现这种方法时总是会遇到问题。因此，尝试通过促进醋酸菌的生长、克隆那些编码具有能够缩短所谓生长诱导期功能的蛋白的基因(生长促进基因)、以及使用这些生长促进基因，来选育并改良醋酸菌。
然而，迄今为止还没有分离到与醋酸菌生长促进相关的基因。在这种情况下，期望分离到新的生长促进基因，它所编码的蛋白具有在实际应用水平上促进醋酸菌生长、缩短生长诱导期的功能，并期望选育出通过使用生长促进基因而具有更强生长功能的醋酸菌。
专利文献1特开昭61-58584A(1986)专利文献2特开昭60-9488A(1985)专利文献3特开昭60-9489A(1985)专利文献4特願2003-350265的说明书非专利文献1“Biochimica et Biophysica Acta，”vol.1088，pp.292-300，1991非专利文献2“Applied and Environmental Microbiology，”vol.55，pp.171-176，1989非专利文献3“Agricultural and Biological Chemistry，”vol.52，pp.3125-3129，1988非专利文献4“Agricultural and Biological Chemistry，”vol.49，pp.2091-2097，1985非专利文献5“Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，”vol.58，pp.974-975，1994非专利文献6“European Journal of Biochemistry，”vol.254，pp.356-362，1998非专利文献7“Method in Enzymology，”vol.89，pp.450-457，1982非专利文献8“Method in Enzymology，”vol.89，pp.491-496，1982非专利文献9“Cellulose”pp.153-158，1989发明的简要描述如上所述，诸如在基因水平上对醋酸菌生长促进功能进行阐述，或者对具有高生长促进功能的实用醋酸菌进行开发之类的成功案例尚未见报道。因此，本发明的目标是分离一种新的乙醇脱氢酶基因，其所编码的蛋白能够在实际应用水平上提高生长促进功能、使用该乙醇脱氢酶基因选育出具有更好生长促进功能的醋酸菌、并提供使用该醋酸菌有效生产含更高浓度醋酸的醋的方法。
我们提出一个假设在那些即使存在醋酸也能够生长发酵的醋酸菌中有一种特殊的生长促进基因(在其它微生物中不存在)。我们进而构思了新颖的想法通过应用这样的基因能够比此前的方法进一步提高微生物的生长促进功能，而且能够开发出比以前的方法更有效生产含高浓度醋酸的醋的方法。从而我们完成了本发明。
本发明如下所述。
(1)一种蛋白ADH，它可以是下述(A)或(B)中的任意一个(A)蛋白ADH，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所组成，并具有乙醇脱氢酶活性。
(2)一种基因的DNA，其编码下述蛋白ADH(A)或(B)中任意一个。
(A)蛋白ADH，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所组成，并具有乙醇脱氢酶活性。
(3)一种基因，其由下述DNA(A)、(B)或(C)组成。
(A)一种DNA，它包含由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸组成的核苷酸序列，(B)一种DNA，它在严谨条件下能够与由与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸组成的DNA的互补核苷酸序列组成的DNA杂交，并编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白ADH；或者(C)一种DNA，它在严谨条件下能够与由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸组成的DNA的一部分所制备的探针的核苷酸序列组成的DNA杂交，并编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白ADH。
(4)一个重组载体，其含有(2)或(3)中的DNA。
(5)一种转化子，其含有(4)中的重组载体。
(6)一种微生物，其具有通过在细胞内扩增(2)或(3)所述的DNA的拷贝数所增强的乙醇脱氢酶活性。
(7)(6)中的微生物，该微生物是属于醋酸杆菌属或者葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌。
(8)一种生产醋的方法，它包括在含乙醇的培养基中培养(6)或(7)中的微生物，并促使微生物在培养基中生产并富集醋酸。
(9)通过(8)中的方法获得的含有高浓度醋酸的醋。
(10)(9)中的醋，其中醋酸浓度为10％至13％。
根据本发明，赋予微生物生长促进功能并增强该功能是可能的。进一步，对于能够氧化乙醇的微生物，尤其是对醋酸菌，可赋予他们显著缩短生长诱导期及在培养基中有效富集高浓度醋酸的能力。
附图的简要描述
图1是来源于Gluconacetobacter entanii的基因片段(pP1)的限制性内切酶图谱示意图。
图2显示的是含有来源于Gluconacetobacter entanii的多拷贝的、NAD依赖的乙醇脱氢酶基因的转化子的发酵过程。
图3显示的是来源于Gluconacetobacter entanii的、NAD依赖的乙醇脱氢酶基因所编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图4显示的是引物1的核苷酸序列。
图5显示的是引物2的核苷酸序列。
下文将就本发明进行详细说明。本申请要求2003年3月12日提交的日本专利申请No.2003-66697的优先权，并包括该专利申请说明书和/或附图中所述的内容。
对从醋酸菌中发现生长促进基因的方法进行了细致的研究，结果，通过构建醋酸菌的染色体DNA文库、利用该文库转化醋酸菌、然后筛选能够使菌株在含1％醋酸的琼脂糖培养基上在3天内长成的基因——而菌株在同样的培养基上一般需要4天长成，我们开发出一种用来从醋酸菌中分离生长促进基因的方法。
通过使用这个方法，我们从已实际用于醋生产的属于葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中，第一次成功克隆到一个能在实际应用水平上提高生长促进功能的、新的乙醇脱氢酶基因(在下文中也称为adh基因)。
DDBJ/EMBL/Genbank及SWISS-PROT/PIRd的同源性搜索结果表明，所获得的adh基因与大肠杆菌中发现的adhP基因、Shinorhizobium meliloti中的adhA基因及其它类似基因所产生的一类蛋白具有一定程度的同源性。这暗示adh基因是醋酸菌的一种乙醇脱氢酶基因。
然而，本发明的adh基因与迄今为止所报道的Acetobacterpolyoxogenes中的adh基因(例如，参见非专利文献1)在氨基酸序列水平上仅有6.4％的极低同源性。此外，本发明中adh基因的预测分子量与非专利文献1中报道的adh基因的预测分子量也差异显著。因此，可以确认本发明的adh基因与迄今所报道的作为膜蛋白的任何一种adh基因有明显不同。
进一步地，本发明的adh基因与大肠杆菌的adhP基因在氨基酸序列水平上有39％的同源性，与Shinorhizobium meliloti的adhA基因在氨基酸序列水平上有56％的同源性。由于这种同源性程度极低，可以进一步证明本发明的adh基因虽然与其它原核生物的adh基因有些类似，但却是一个编码一种新的醋酸菌特异性蛋白(也称作ADH蛋白)的全新基因。
在本发明中，通过将adh基因连接到质粒载体上然后用该载体转化醋酸菌来制备具有多拷贝adh基因的转化子。由于在转化子中乙醇脱氢酶活性增强了约54倍，因此可以确认该基因编码具有醋酸菌乙醇脱氢酶活性的蛋白。
我们还发现在存在乙醇时进行通风培养，醋酸发酵能力，尤其是生长促进功能，显著提高了；而且生长诱导期也缩短了。因此，可以有效生产含高浓度醋酸的醋。从而，我们完成了本发明。
本发明将在以下各项中详细描述。
(1)本发明的DNA本发明的DNA与大肠杆菌的adh基因或其它类似基因具有一定程度的同源性，并包含编码乙醇脱氢酶的核苷酸序列，该酶具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，能够提高生长促进功能。本发明的DNA包含调节元件与结构基因。
本发明的DNA可以按下文所述从Gluconacetobacter entanii的染色体DNA获得。
首先，制备Gluconacetobacter entanii，例如Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(于1984年2月23日以保藏号FERMBP-491保藏，(原始保藏)在国际专利生物保藏机构(Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan)，独立行政法人工业技术综合研究所(AIST)特许生物寄托中心)的染色体DNA文库。此外，染色体DNA通过常规方法(例如，参见专利文献3)获得。
接下来，为了从获得的染色体DNA中分离乙醇脱氢酶基因，构建一个染色体DNA文库。第一步，使用限制性内切酶对染色体DNA进行部分消化以获得不同大小片段的混合物。在调节剪切反应时间及其它类似的反应条件以调节剪切程度的过程中，可使用限制性内切酶的宽范围模式。例如，在不同反应时间(1分钟至2小时)及酶浓度也在1至100单位/ml的范围内变动的条件下，通过Sau3A I在30℃或更高温度下，优选的是37℃作用于DNA来消化染色体DNA。此外，在下文所示的实施例中也使用了Pst I。
接下来，这些剪切的染色体DNA片段连接到可在醋酸菌中自主复制的载体DNA上，从而构建重组载体。特别地，在37℃及酶浓度在1至10单位/ml的范围内反应1或几个小时的条件下，可使用限制性内切酶(例如Pst I，它可生成与使用了限制性内切酶Pst I所剪切的染色体DNA相互补的末端核苷酸序列)作用于载体DNA，从而完全消化并剪切载体DNA。
接下来，上文获得的染色体DNA片段的混合物与剪切的载体DNA混合，然后在温度4℃至16℃、酶浓度1至100单位/ml、反应时间1小时以上(优选的6至24小时)的条件下，加入T4DNA连接酶进行反应，从而获得重组载体。
使用所获得的重组载体进行转化在含浓度为1％醋酸的琼脂糖培养基上一般需4天才能长成的醋酸菌，例如醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)No.1023菌株(于1983年6月27日以保藏号FERM BP-2287保藏，(原始保藏)独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan))。然后，产物涂布在含1％醋酸的琼脂糖培养基上，随后培养3天。生成的菌落转接至液体培养基中培养。从得到的菌体细胞中收集质粒，这样便获得了含adh基因的DNA片段。
本发明DNA的特定实施例是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。在此DNA中，含Nos.359位至1390位核苷酸的核苷酸序列是一个编码区。
DDBJ/EMBL/Genbank及SWISS-PROT/PIR的同源性搜索结果表明，序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或者序列表中SEQ IDNO2(对应于图3核苷酸Nos.359位至1390位)所示的氨基酸序列与大肠杆菌的adhP基因在氨基酸水平上具有39％的同源性，与Shinorhizobium moliloti的adhA基因在氨基酸水平上具有56％的同源性。从而，推断出相应的基因编码一种蛋白ADH。然而，由于两个同源性只有60％或更低，清晰表明该基因是一个与这些基因不同的新基因。
此外，已有从醋酸菌Acetobacter polyoxogenes中获得adh基因的报道(例如，参见非专利文献1)。在这个案例中adh基因编码的蛋白与由核苷酸Nos.359位至1390位组成的核苷酸序列所编码的蛋白，其氨基酸序列的同源性极低，仅为6.4％。本发明的基因与已知的adh基因明显不同，显然是醋酸菌的一个新的adh基因。
本发明DNA的核苷酸序列已经阐明。因此，可以通过，例如使用Gluconacetobacter entanii的基因组DNA作为模板、及基于核苷酸序列合成的寡核苷酸作为引物的聚合酶链反应(PCR反应)，或者通过使用基于核苷酸序列合成的寡核苷酸作为探针的杂交来获得DNA。
寡核苷酸可以按照常规方法合成，例如，多种商业化的DNA合成仪来合成。进一步地，PCR反应可以使用Applied Biosystems公司生产的Thermal Cycler Gene Amp PCR system 9700、Taq DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.生产)、KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生产)及其它类似物按照常规方法进行。
本发明中编码具有生长促进功能蛋白ADH的DNA，只要乙醇脱氢酶活性或者所编码的蛋白ADH的生长促进功能没有退化，可以是编码通过1个或几个氨基酸在1个或多个位置缺失、替换、插入或者添加或倒置所得到的蛋白的任意DNA。
还可以通过，例如，定点诱变、特别通过特定位点上氨基酸的缺失、替换、插入或者添加或倒置对核苷酸序列进行改变，来获得这种编码与具有生长促进功能的乙醇脱氢酶几乎完全相同的蛋白ADH的DNA。此外，也可以通过已知的传统诱变处理来获得上文的改变的DNA。
进一步地，已知蛋白的氨基酸序列与编码蛋白的核苷酸序列在种间、菌株间、变型间及变种间会略有不同。编码基本上完全相同的蛋白的DNA可以从全部醋酸菌中获得，尤其是那些来自醋酸杆菌属或者葡糖酸醋酸杆菌属的种、菌株、变型及变种。
特别地，在严谨条件下可与，例如，由与Nos.359位至1390位(序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列)核苷酸所组成的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA，或者具有由Nos.359位至1390位(序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列)核苷酸所组成的核苷酸序列的一部分所制备的探针的核苷酸序列组成的DNA，进行杂交、并编码对醋酸具有增强抗性功能的蛋白的DNA，是从醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌、醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的突变醋酸菌、或者其自发突变的菌株或者变种中分离到的。以这种方式，也可以获得编码与所述蛋白基本上完全相同的蛋白的DNA。此处所用的术语“严谨条件”指在此条件下可以形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交。很难使用数值来精确描述这种条件。这种条件的实施例包括在此条件下，具有高同源性的核苷酸序列，例如，DNA具有70％或以上的同源性，能够相互杂交；而同源性低于这个水平的核苷酸序列不会彼此杂交。其它此类实施例包括杂交的一般洗脱条件，例如在此条件下，在60℃、盐浓度为1×SSC，0.1％SDS的溶液中进行清洗。
(2)本发明中的醋酸菌本发明的醋酸菌属于醋酸杆菌属或者葡糖酸醋酸杆菌属，这二者对醋酸均具有增强的抗性。
醋酸杆菌属细菌的具体实施例包括诸如醋化醋杆菌No.1023菌株(由国际专利生物保藏机构以FERM BP-2287保藏，)、醋化醋杆菌木糖亚种(Acetobacter aceti xylinum)IFO3288菌株及醋化醋杆菌IFO3283株这样的醋化醋杆菌。
进一步地，葡糖酸醋酸杆菌属细菌的实施例包括Gluconacetobacter europaeus DSM6160菌株以及诸如目前由国际专利生物保藏机构以FERM BP-491保藏的Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株这样的Gluconacetobacter entanii。
通过，例如，将含有结构基因的DNA片段与在醋酸杆菌属细菌中能够有效发挥功能的启动子序列连接为重组DNA，使用该重组DNA转化醋酸杆菌属的细菌或者扩增adh基因在细胞中的拷贝数，来增强生长促进功能。
还可以通过使用在醋酸杆菌属或者葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中能够有效发挥功能的另一个启动子序列，来替换染色体DNA上基因的启动子序列，由此增强生长促进功能。实施例包括来源于非醋酸菌微生物的启动子序列，譬如大肠杆菌质粒pBR322(由TAKARA BIOINC.生产)的氨苄青霉素抗性基因、质粒pHSG298(由TAKARA BIOINC.生产)的卡那霉素抗性基因、质粒pHSG396(由TAKARA BIO INC.生产)的氯霉素抗性基因及β-半乳糖苷酶基因上的启动子。
可以通过将含有基因的多拷贝载体导入醋酸杆菌属的醋酸菌细胞中来扩增细胞内该基因的拷贝数。特别地，扩增可以通过将含该基因的质粒、含该基因的转座子或其它类似物导入醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌细胞中来进行。
多拷贝载体(醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体)的实例包括pMV24(例如，参见非专利文献2)、pGI18(例如，参见专利文献4)、pUF106(例如，参见非专利文献9)、pTA5001(A)及pTA5001(B)(例如，参见专利文献2)。此处的另一个实例是pMVL1(例如，参见非专利文献3)，它是一个染色体整合载体。此外，转座子的实例包括Mu与IS1452。
DNA可以通过氯化钙法(例如，参见非专利文献4)、电转化法(例如，参见非专利文献5)或类似方法导入醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中。
转化子通过将重组质粒导入醋化醋杆菌No.1023(FERM BP-2287)来获得。这样的重组质粒含有至少一段具有序列表中SEQ IDNO1表示的核苷酸序列的DNA片段，譬如将上述的DNA片段插入到醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体(多拷贝载体)pMV24而制备的重组质粒pADH1。
在具有氧化乙醇能力的醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中当乙醇脱氢酶活性如上所述得到增强时，生长促进功能也得到增强，并且生长诱导期缩短了，因此可以有效生产含高浓度醋酸的醋。
(3)生产醋的方法通过上述的扩增adh基因拷贝数的方法可获得生长促进功能得到选择性增强的醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌。这类能够氧化乙醇的醋酸菌在含有乙醇的培养基中培养，随后会在培养基中产生并富集醋酸，从而可以有效生产含高浓度醋酸的醋。
本发明生产方法中的醋酸发酵可以按照与常规的使用醋酸菌发酵生产醋时所用方法相类似的方式来进行。不论是合成的还是天然培养基，只要含有碳源、氮源、无机物与乙醇，以及，如果需要，还含有适量微生物菌株进行生长所必需的营养物质，都可以用作醋酸菌发酵的培养基。
碳源的实施例包括多种碳水化合物，譬如葡萄糖、蔗糖及多种有机酸。可以使用譬如蛋白胨这样的天然氮源及发酵微生物的分解产物作为氮源。
进一步地，培养在诸如静置培养方法、摇床培养方法及通风振荡培养方法这样的有氧条件下进行。培养在温度为20℃至40℃的范围内进行，优选的为25℃至35℃，一般为30℃。培养基的pH值一般在2.5至7之间，优选的为2.7至6.5。pH值可以使用多种酸、多种核苷酸、缓冲液及其它类似物来调节。一般经1至21天的培养，可在培养基中富集高浓度的醋酸。使用这种方法获得的醋中醋酸浓度范围为10％至13％。
优选实施例的详细描述将通过实施例对本发明做进一步详细描述。
(实施例1)从Gluconacetobacter entanii中克隆具有生长促进功能的基因并测定其核苷酸序列及氨基酸序列(1)染色体DNA文库的构建30℃条件下，在添加了6％醋酸与4％乙醇的YPG培养基(3％葡萄糖，0.5％酵母提取物及0.2％聚胨)中以摇床培养方式培养Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)，一株Gluconacetobacter entanii。培养后，离心培养基(7500×g，10分钟)以收集菌体细胞。从所获得的菌体细胞中，通过染色体DNA制备方法(例如，参见专利文献3)制备染色体DNA。
上文获得的染色体DNA用限制性内切酶Pst I(由TAKARA BIOINC.生产)部分消化。使用限制性内切酶Pst I完全消化大肠杆菌-醋酸菌穿梭载体pMV24。将适量的这些DNA混合并用连接试剂盒(TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2，由TAKARA BIO INC.生产)进行连接，从而构建了一个Gluconacetobacter entanii的染色体DNA文库。
(2)具有生长促进功能的基因的克隆按上文所述所获得的Gluconacetobacter entanii的染色体DNA文库转化到在含1％醋酸的琼脂糖培养基上一般需4天长成的醋化醋杆菌No.1023菌株中，然后在含1％醋酸及100μg/ml氨苄青霉素的YPG琼脂糖培养基上于30℃培养3天。接种3天内形成的菌落并在含100μg/ml氨苄青霉素的YPG培养基上培养，然后从所获得的菌体细胞中收集质粒。如图1所示，所克隆的是一条大约1.7-kbp的Pst I片段，质粒命名为pP1。此外，可以进一步证实致使醋化醋杆菌No.1023菌株在含1％醋酸的YPG琼脂糖培养基上于3天内长成的片段，是克隆到pP1中的约1.7-kbp的Pst I片段上的一段约为1.2-kbp的Bgl I片段。
如上所述，获得了使得醋化醋杆菌No.1023菌株在含1％醋酸的琼脂糖培养基上于3天内长成的基因片段，而该菌株在含1％醋酸的此种琼脂糖培养基上通常需4天长成。
(3)测定克隆DNA片段的核苷酸序列上述克隆的PstI片段插入到pUC19的Pst I位点，然后利用Sanger的双脱氧链终止法来测定片段的核苷酸序列。从而测定了SEQ IDNO1的核苷酸序列。通过使所有的剪切点都相互交叠，对两条DNA链的全部区域都进行了测序。
在SEQ ID NO1的核苷酸序列中，确认存在一个由No.359位核苷酸至No.1390位核苷酸构成的编码在SEQ ID NO2(图3)中描述的344个氨基酸的开放阅读框。
(实施例2)在来源于Gluconacetobacter entanii的具有生长促进功能的基因所转化的转化子中缩短生长诱导期的效果(1)转化到醋化醋杆菌中上文所克隆的来源于Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的具有生长促进功能的基因通过使用KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生产)的PCR方法进行扩增。所获得的DNA片段插入到醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pMV24(例如，参见非专利文献2)的限制性内切酶SmaI酶切位点上，从而制备质粒pADH1。插入到pADH1中的扩增片段如图1所示。图1所示的是使用PstI进行克隆的来源于Gluconacetobacter entanii的基因片段(pP1)的限制性内切酶图谱、具有生长促进功能的基因的位置，及插入到pADH1中的片段。
PCR方法按下文详细说明进行。具体说来，在下述使用Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株的基因组DNA作为模板、引物1(其核苷酸序列在SEQ ID NO3(图4)中所示)、引物2(其核苷酸序列在SEQ ID NO4(图5)中所示)、及KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生产)的PCR反应条件下进行PCR反应。
具体地，PCR方法进行30个循环，每循环包括94℃15秒，60℃30秒及68℃1分钟。
pADH1通过电转化法(例如，参见非专利文献5)转到醋化醋杆菌No.1023菌株中。转化子通过添加了100μg/ml氨苄青霉素及1％醋酸的YPG琼脂糖培养基进行筛选。
从3天内在选择培养基上长成的具有氨苄青霉素抗性的转化子中提取质粒，然后按照常规方法进行分析。从而，可以确认菌株含有具有生长促进功能基因的质粒。
(2)转化子的生长促进功能根据在添加了醋酸的YPG培养基上的生长比较上文获得的含有质粒pADH1的具有氨苄青霉素抗性的转化子与仅使用穿梭质粒pMV24转化的原始醋化醋杆菌No.1023菌株。
具体地，摇床培养(150rpm)是在含有3％醋酸、3％乙醇及100μg/ml氨苄青霉素的100ml YPG培养基中于30℃进行的。通过测量660nm处的吸光度来比较转化子与原始菌株在添加了醋酸的培养基中的生长。
结果如图2所示，可以确认在添加了3％醋酸与3％乙醇的培养基中，转化子比原始醋化醋杆菌No.1023菌株生长更快。进一步证实了基因能够增强生长促进功能的效果。
(3)转化子与原始菌株的多种酶活对于含有质粒pADH1且具有氨苄青霉素抗性的转化子与仅使用穿梭质粒pMV24转化的原始醋化醋杆菌No.1023菌株，通过用于细菌的改进的方法(例如，参见非专利文献6)来测定NAD依赖的乙醇脱氢酶活性。确切地，将适量的破碎细胞悬浮液加入到1ml含有25mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、500mM乙醇及1.5mM NAD+的反应混合液中，然后在25℃测定340nm处的吸光度。规定1个单位的酶活相当于每分钟产生NADH量为1μmol。此外，通过用于醋酸菌的方法(例如，参见非专利文献7)来测定膜结合的乙醇脱氢酶活性，通过用于醋酸菌的方法(例如，参见非专利文献8)来测定膜结合的乙醛脱氢酶活性。结果如表1所示。
表1
基于表1的结果，可以发现转化子中膜结合的乙醇脱氢酶活性与膜结合的乙醛脱氢酶活性同原始醋化醋杆菌No.1023菌株中这些酶活性在同一个水平。然而，转化子具有比原始菌株高约54倍的NAD依赖的乙醇脱氢酶活性。因此，可以确认所克隆的基因是编码NAD依赖的乙醇脱氢酶的adh基因。
(实施例3)含有来源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的转化子的醋酸发酵试验实施例2中获得的含质粒pADH1且具有氨苄青霉素抗性的转化子与仅具有穿梭质粒pMV24的原始醋化醋杆菌No.1023菌株根据醋酸发酵能力进行比较。
具体地，使用装有2.5升含1％醋酸、4％乙醇与100μg/ml氨苄青霉素的YPG培养基的5升小型发酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生产；KNJ-5A)进行通气振荡培养(30℃，400rpm，0.20vvm)。使菌株发酵从而使醋酸浓度达到3％。随后从小型发酵罐中移走培养基仅余下700ml培养基。向余下的700ml培养基中添加1.8升含醋酸、乙醇及100μg/ml氨苄青霉素的YPG培养基。调节培养基使其中醋酸与乙醇的浓度分别为3％与4％，然后重新开始醋酸发酵。继续进行通气振荡培养，在发酵过程中添加乙醇使培养基中的乙醇浓度维持在1％。转化子与原始菌株根据醋酸发酵能力来进行比较。结果总结在表2中。
表2
基于表2的结果，转化子的生长诱导期同原始菌株的相比较有显著缩短。因此，可以确认转化子能够有效地进行醋酸发酵。
(实施例4)含有来源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的转化子的醋酸发酵试验(1)转化到Acetobacter altoacetigenes中来源于Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的具有生长促进功能的基因，通过使用KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生产)的PCR方法进行扩增。使用限制性内切酶Sma I剪切醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18后(例如，参见专利文献4)，将所扩增的DNA片段插入到该位点，从而制备质粒pADH2。插入到pADH2中的扩增片段如图1所示。图1所示的是使用Pst I进行克隆的来源于Gluconacetobacter entanii-的基因片段(pP1)的限制性内切酶图谱、具有生长促进功能的基因的位置，及插入到pADH2中的片段。
PCR方法按下文详细说明进行。具体地，在下述使用Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株的基因组DNA作为模板、引物1(其核苷酸序列在SEQ ID NO3(图4)中所示)、引物2(其核苷酸序列在SEQ ID NO4(图5)中所示)、及KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生产)的PCR反应条件下进行PCR反应。
具体地，PCR方法进行30个循环，每循环包括94℃15秒，60℃30秒及68℃1分钟。
PADH2通过电转化法(例如，参见非专利文献5)转到Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株中。转化子通过添加了100μg/ml氨苄青霉素、4％醋酸及3％乙醇的YPG琼脂糖培养基进行筛选。
从在选择培养基上长成的具有氨苄青霉素抗性的转化子中提取质粒，然后按照常规方法进行分析。从而，可以确认转化子具有含adh基因的质粒。
(2)转化子的醋酸发酵试验(1)中获得的含质粒pADH2且具有氨苄青霉素抗性的转化子与仅使用穿梭载体pGI18转化的原始Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株根据醋酸发酵能力来进行比较。
具体地，使用装有2.5升含100μg/ml氨苄青霉素的原料培养基(7％醋酸，3％乙醇，0.2％酵母提取物及0.2％葡萄糖)的5升小型发酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生产；KNJ-5A)进行通气振荡培养(30℃，500rpm，0.20vvm)。在可清楚观测到菌体生长且残留乙醇浓度降为2％的时候，加入含有乙醇的培养基(1％醋酸、50％乙醇、0.2％酵母提取物及0.2％葡萄糖)使发酵液的乙醇浓度控制在2％。通过这种醋酸发酵方法，对转化子与原始菌株的醋酸发酵能力进行比较。结果总结在表3中。
表3
基于表3的结果，根据获得的醋酸终浓度可以确认转化子明显优于原始菌株。
(实施例5)含有来源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的转化子的醋酸发酵试验
(1)转化到醋化醋杆菌木糖亚种中实施例4中获得的质粒pADH2通过电转化方法转到一株醋化醋杆菌木糖亚种—醋化醋杆菌木糖亚种IFO3288菌株中。使用添加了100μg/ml氨苄青霉素的YPG琼脂糖培养基筛选转化子。
从生长在选择培养基上的具有氨苄青霉素抗性的转化子中提取质粒，然后按照常规方法进行分析。从而，可确认菌株具有含参与增强醋酸抗性的基因的质粒。
(2)醋酸发酵试验在(1)中获得的含质粒pADH2且具有氨苄青霉素抗性的转化子与仅使用穿梭质粒pGI18转化的原始醋化醋杆菌木糖亚种IFO3288菌株根据醋酸发酵能力进行比较。
具体地，在装有由17.9％糖化大米溶液、3.2％发酵的醪、7.8％乙醇与71.1％水混合所制备的原料培养基(7.8％的乙醇浓度与0.26％的醋酸浓度)的5升小型发酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生产；KNJ-5A)中进行通气振荡培养(30℃，500rpm，0.20vvm)。在7.3％的醋酸浓度下进行连续发酵。在7.2％的醋酸浓度下进行连续发酵的菌株根据原料培养基添加速率进行比较。结果如表4所示。此外，根据醋酸发酵能力对菌株进行比较，此时将转化子的原料培养基添加速率调整为在7.3％醋酸浓度进行连续发酵时原始菌株的原料培养基添加速率。结果如表4所示。
表4
表5
基于表4与表5的结果，根据连续醋酸发酵、产率(原料培养基添加速率)及所生产醋酸的浓度可以确认转化子明显优于原始菌株。
本文所引用的所有出版物、专利与专利申请均全文引入作为参考。
工业应用根据本发明，提供了一种参与醋酸抗性的新基因。进一步地，使用该基因，可获得高效生产含高浓度醋酸的醋的改良菌株。从而，可提供使用该改良菌株高效生产含高浓度醋酸的醋的方法。
以纯文本列出的序列SEQ ID NO3引物SEQ ID NO4引物序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>醋酸菌的乙醇脱氢酶基因<130>PH-1986-PCT<150>JP2003-066697<151>2003-03-12<160>4<210>1<211>1658<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii<400>1ctgcagcatt tcggcattgg cgcgtcatgg ggtgggtatg aaagccttgt gctgcccacc 60acgggcggga tctcgcgttc gtgcctgtcg gttacgggcg cgggaccggc gtgcaggctg 120catgtcgggc tggaagctgg cgggttgctg gtggacgatc tggcgcgtgg tctggatggc 180atgtctgccg cccgcgcagg gcggtggacg gactgacgta gatcaaggtt gcgacggggc 240agggatggga cacttgcccc atacacgatg cccccgtccg gccatgccgg ccgggcgggt 300ggcgcaggga atggtggctc catggccggg gccgtgacat cggaacggaa ggtgcaagat 360ggctggaaag atgaaggctg cggttgtacg ggaattcggc aagccgctga cgatcgagga 420actggacatt ccgcagatca acaccaacca gatcctggtc aaggtcgatg cctgcggcgt 480ctgccatact gacctgcatg ccgcccgtgg cgactggccc accaagccca ggccgccctt 540tatcccgggg cacgagggaa tcggccatgt ggtcgaggtc ggcagcaacg tcaactggat 600caagaccggc gacgtggtgg gcgtgccgtg gctgtattcg gcctgcgggc attgcgaaca 660ctgtctgggc ggatgggaaa ccctgtgtga aaagcaggag gacaccggct attccgtcaa 720tggctgcttt gccgaatatg tggtggccga ccccaattac gtcgcccatc tgccgaaaga 780catcgacccg atcaagacgg cccccgtgct gtgcgcgggg ctgacggtgt acaagggcct 840gaagatgacg gacacccggg ccggggaatg ggtcgccatt tccggcgcgg gcgggcttgg 900gcagatggcc atccagtacg cggtggccat gggcctgaac gtggcggcgg tggatatcag 960cgatgaaaag ctggaagaag cccgcaagct gggcgcgcgc gtgaccgtca acgcgctgaa1020gcaggatccg gtcgcctata tccgcgaaca gaccggcggc acccacggcg tgctggtcac1080cgccgtgtcg gacaaggcgt tcagccaggc ggtgggttac gcgcggcgcg gcggcacggt1140ggtgctgaac ggcctgccgc ccggtgactt cccgctgtcc atctttgaca tggtgatgaa1200tggcacgacc gtgcgcggat ccattgtcgg cacgcggctg gacatgatcg aagccatgtc1260cttcttcact gatggcaagg tgacgacggt ggtcagcacg gacaaactgg aaaacatcaa1320caccattttc gacaacctgc agcatggccg ggtaaaggga cgcgtggtgc tggatttccg1380taacggggcc tgaaacgacg gcagccgcca ccctgatgcc cgttcagggt ggcgtatcgt1440gtaaccggag ggcgcgaacg ggaaagatgc atcccgtcgt cgcgccgccg tggcaagtgg1500
ctgtccgatg taaaacgaca gggttattgc gcattccggc taaaggatgc cgatacgatg1560cagtaatttt tcggacaggt gcgctatttt attgtcgggt cccggtctca ggtcggaaaa1620ttttattttg ggcggattga atttctttat ttctgcag1658<210>2<211>344<212>PRT<213>Gluconacetobacter entanii<400>2Met Ala Gly Lys Met Lys Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro5 10 15Leu Thr Ile Glu Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ile Asn Thr Asn Gln Ile2025 30Leu Val Lys Val Asp Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala35 4045Ala Arg Gly Asp Trp Pro Thr Lys Pro Arg Pro Pro Phe Ile Pro Gly50 55 60His Glu Gly Ile Gly His Val Val Glu Val Gly Ser Asn Val Asn Trp65 7075 80Ile Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys8590 95Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu Lys100105110Gln Glu Asp Thr Gly Tyr Ser Val Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Val115120125Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Pro Lys Asp Ile Asp Pro130 135140Ile Lys Thr Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys Gly145150 155160Leu Lys Met Thr Asp Thr Arg Ala Gly Glu Trp Val Ala Ile Ser Gly165170 175Ala Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Ile Gln Tyr Ala Val Ala Met Gly180185190Leu Asn Val Ala Ala Val Asp Ile Ser Asp Glu Lys Leu Glu Glu Ala195200205Arg Lys Leu Gly Ala Arg Val Thr Val Asn Ala Leu Lys Gln Asp Pro210215 220Val Ala Tyr Ile Arg Glu Gln Thr Gly Gly Thr His Gly Val Leu Val225 230235240Thr Ala Val Ser Asp Lys Ala Phe Ser Gln Ala Val Gly Tyr Ala Arg245250 255Arg Gly Gly Thr Val Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe Pro260265270
Leu Ser Ile Phe Asp Met Val Met Asn Gly Thr Thr Val Arg Gly Ser275280285Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met Ile Glu Ala Met Ser Phe Phe Thr290295300Asp Gly Lys Val Thr Thr Val Val Ser Thr Asp Lys Leu Glu Asn Ile305310 315 320Asn Thr Ile Phe Asp Asn Leu Gln His Gly Arg Val Lys Gly Arg Val325 330335Val Leu Asp Phe Arg Asn Gly Ala340<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3gtggacggac tgacgtagat caaggttgcg 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4atgcatcttt cccgttcgcg ccctccggtt 30
权利要求
1.一种蛋白ADH，它可以是下述(A)或(B)中的任意一个(A)蛋白ADH，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所组成，并具有乙醇脱氢酶活性。
2.一种基因的DNA，其编码下述蛋白ADH(A)或(B)中任意一个(A)蛋白ADH，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所组成，并具有乙醇脱氢酶活性。
3.一种基因，其由下述DNA(A)、(B)或(C)组成(A)一种DNA，它包含由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸组成的核苷酸序列，(B)一种DNA，它在严谨条件下能够与由与如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸组成的DNA的互补核苷酸序列组成的DNA杂交，并编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白ADH；或者(C)一种DNA，它在严谨条件下能够与由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸序列组成的DNA的一部分所制备的探针的核苷酸序列组成的DNA杂交，并编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白ADH。
4.一个重组载体，其含有权利要求2或3中的DNA。
5.一种转化子，其含有权利要求4中的重组载体。
6.一种微生物，其具有通过在细胞内扩增如权利要求2或3所述的DNA的拷贝数所增强的乙醇脱氢酶活性。
7.权利要求6中的微生物，所述微生物是属于醋酸杆菌属或者葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌。
8.一种生产醋的方法，它包括在含乙醇的培养基中培养权利要求6或7中的微生物，并促使微生物在培养基中生产并富集醋酸。
9.通过权利要求8中的方法获得的含有高浓度醋酸的醋。
10.权利要求9中的醋，其中醋酸浓度为10％至13％。
全文摘要
通过从醋酸菌染色体DNA文库中获得在含醋酸的培养基中具有生产促进功能的基因的方法，在属于葡糖酸醋酸杆菌属的实际应用的醋酸菌中克隆到一种在实际应用水平上具有提高醋酸发酵功能的新基因。将该基因转入醋酸菌获得转化子，当这种转化子在存在乙醇的条件下培养时，有可能显著缩短其生长诱导期并显著提高其醋酸发酵速率。
文档编号C12N1/19GK1788087SQ20048001300
公开日2006年6月14日 申请日期2004年2月17日 优先权日2003年3月12日
发明者中野繁 申请人:株式会社味滋集团公司