专利名称：用于离体非杂交瘤生产多克隆和单克隆抗体以及产生永生化的细胞群的方法
背景技术：
本申请要求2003年4月14日提交的美国临时专利申请号60/462,631和2003年11月24日提交的60/524,701的优先权，所述申请号全文在此引用作为参考。
1.发明领域本发明涉及分子生物学、细胞生物学和免疫学领域。更特别地，本发明涉及在不使用杂交瘤的情况下合成抗体的方法和用途。
2.背景单克隆抗体是在其与靶分子特异性位点反应中具有高度特异性和灵敏性的蛋白。多年来单克隆抗体在现代生物学研究和医学例如在人类疾病的分析和治疗中已成为举足轻重的试剂。然而，自其引入后超过四分之一个世纪以来，单克隆抗体仍然只能由脾细胞与来源于多发性骨髓瘤的细胞融合的体细胞克隆(杂交瘤)产生(Koher和Milstein，1975)。这些“杂交瘤”能够在多年内产生单克隆抗体，但生产涉及被不断面临污染的风险、频繁地需要饲养细胞以及可能的遗传不稳定性所限制的劳动密集的多步骤过程(Harlow和Lane，1988)。所述杂交瘤生产过程少有在两个月内完成的并且通常要花费一年多的时间。
用于生产单克隆的常规方法至少要遭受两个限制(i)很大程度上由于遗传不稳定性导致缺少稳定的杂交瘤细胞系和(ii)选择和筛选克隆的时间受限，因为杂交瘤在培养中仅有2-3周的持续时间并且必需在这段时间内筛选结合特异性。尽管近年来发展了生物技术，例如用于在体外产生单克隆抗体的噬菌体展示技术(Winter等人，1994；Barbas等人，2000)、嵌合化或人源化策略(Winter和Milstein，1991)和适合于杂交瘤形成的人杂交瘤细胞系(Kapas等人，2001)，但仍然需要另外的用于产生永生化的单克隆抗体生产型细胞的策略和方法，并且其将代表所述领域的主要进展。
发明简述本发明实施方案包括用于产生抗体生产型细胞的方法，所述细胞在不需要将抗体生产型细胞与永生化的细胞融合的情况(例如杂交瘤生成)下，产生与想要的抗原结合的抗体。本发明的一个方面包括以有效地诱导抗体生产型细胞产生抗想要的抗原的抗体的方式将所述细胞与所述抗原接触的步骤，其中所述抗原产生细胞在不形成杂交瘤的情况下能被永生化；并且使所述抗体生产型细胞永生化。所述抗体生产型细胞通常包括条件性行使功能的或条件性表达的转化癌基因，并且通过诱导所述转化癌基因的表达或功能(诱导转化癌基因)来实现所述抗体生产型细胞的永生化。在某些实施方案中，所述条件性行使功能的转化癌基因是温度敏感的SV40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)，优选地所述tsSV40Tag是A58S-SV40Tag。在本发明的某些方面，通过在从25℃至35℃的温度范围内，优选地从30℃至35℃和更优选地在大约33℃培养所述抗体生产型细胞以诱导所述转化癌基因。通常，将抗体生产型细胞培养在杂交瘤培养基上。
在更进一步的实施方案中，所述方法进一步包括估计抗体生产型细胞的抗体生产能力。对抗体生产型细胞的估计包括测定抗体与所述想要的抗原以及相似的和不同的抗原的结合能力。通常选择和培养单个细胞以产生生产单克隆抗体的单克隆细胞群。通过稀释克隆可选择单个细胞。在本发明的其它方面，选择和培养多个细胞以产生生产多克隆抗体的多克隆细胞群体。在某些实施方案中，所述抗体生产型细胞包括脾脏细胞(脾细胞)。抗原可以是肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、糖类、病毒、细菌、病原微生物、组织、整个细胞、活检组织(biopsytissue)、来源于患者的细胞、组织提取物、活体或培养的组织、凋亡细胞、亚细胞成分例如膜、细胞质和来自细胞和组织的细胞核部分、纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、激光捕获的组织或石蜡包埋和固定的组织。在优选的实施方案中，所述组织包含来源于受试者的肿瘤组织。
在本发明的其它方面，可从具有在不形成杂交瘤的情况下能被永生化的抗体生产型细胞的转基因小鼠中获得所述抗体生产型细胞。所述抗体转基因小鼠可包含用于产生人抗体的遗传补充物(geneticcomplement)。本发明的抗体生产型细胞可包含于小鼠中，并且将所选择的抗原以有效地诱导所述抗体生产型细胞产生抗体的方式给小鼠施用。在某些方面，所述方法包括通过将抗体生产型细胞和抗原呈递细胞共培养使抗体生产型细胞与想要的抗原接触，优选地所述抗原呈递细胞是树突细胞。在各种实施方案中，所述抗体生产型细胞包含用于人抗体生产的遗传补充物并且产生人抗体。所述方法可进一步包括纯化由所述抗体生产型细胞生产的抗体。在某些方面，所述方法可进一步包括给需要治疗性抗体的受试者施用所述抗体。
本发明进一步的实施方案包括用于产生生产抗想要的抗原的人抗体的抗体生产型细胞。所述方法可包括获取抗体生产型细胞，所述细胞有条件地表达转化癌基因或表达条件性行使功能的转化癌基因并表达用于产生人抗体的遗传补充物。通常通过诱导所述转化癌基因的表达或功能来实现抗体生产型细胞的永生化。所述方法也可包括以有效地诱导所述细胞产生抗所述抗原的人抗体的方式将所述抗体生产型细胞与想要的抗原接触，其中所述抗体生产型细胞在不形成杂交瘤的情况下能被永生化，并且永生化所述抗体生产型细胞。所述条件性行使功能的转化癌基因可以是温度敏感的SV40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)，优选地所述tsSV40Tag是A58S-SV40Tag。本发明的方面包括通过在从25℃至35℃的温度范围内，优选地从30℃至35℃和更优选地在33℃培养所述抗体生产型细胞以诱导所述转化癌基因的表达和功能。
所述方法也可包括选择和培养单个细胞以产生生产单克隆抗体的单克隆群。在其它方面，所述方法可包括选择和培养多个细胞以产生生产多克隆抗体的多克隆群。在某些方面，抗体生产型细胞包括脾细胞。抗原可包括一个或多个肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、糖类、病毒、细菌、病原微生物、组织、完整的细胞、活检组织、来源于患者的细胞、组织提取物、活体或培养的组织、凋亡细胞、亚细胞成分例如膜、细胞质和来自细胞和组织的细胞核部分、纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、激光捕获的组织或石蜡包埋和固定的组织。组织可以包含来源于受试者的肿瘤组织。而在更进一步的实施方案中，可从具有在不形成杂交瘤的情况下能被永生化的抗体生产型细胞的转基因小鼠中获得所述抗体生产型细胞。所述抗体生产型细胞可包含于小鼠中，并且将所选择的抗原以有效地诱导抗体生产型细胞产生抗体的方式给小鼠施用。在其它方面，所述方法可进一步包括纯化由所述抗体生产型细胞产生的抗体。可对需要治疗性抗体的受试者施用所述抗体。
可以预期任何此处描述的方法或组合物可根据任何此处描述的方法或组合物实现。
当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，单词“a”或“an”的使用可表示“一种”，但其也与“一种或更多种”、“至少一种”和“一种或超过一种”的意思相同。
权利要求中的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表明仅指“或”，或者几个可选项是互相排除的，尽管本公开内容支持“或”以及“和/或”。
根据下面详细的描述，本发明的其它目的、特征和有利方面将会变得明显。然而应当理解的是，由于根据该详细描述，对于本领域技术人员而言，在本发明精神和范围内的各种变化和修饰是显而易见的，因此所述详细的描述和特定的实施例(说明本发明特定的实施方案)，仅是用来起说明作用的。
附图
概述下列附图形成了本说明书的一部分并且用于进一步说明本发明的某些方面。通过参考与此处提供的特定实施方案的详细说明相结合的一个或更多的这些附图可更好地理解本发明。
图.1A和1B说明用于在体外产生抗(图.1A)pIII纯化蛋白(5μg/孔)或(图.1B)噬菌体颗粒Fd-Tet(1011TU/孔)的永生化的抗体生产型脾细胞群的示例性方法。
图.2说明用于永生化树突细胞的示例性方法和用抗鼠科动物抗体-CD80、-CD86和-H2k对永生化的树突细胞进行FACS分析。
图.3A-3C说明来源于未成熟永生化的骨髓的细胞(树突细胞，DC)的举例性形态学图像。
图.4A-4C表示用于产生和测定抗肿瘤抗体的示例性方法。图.4A和图.4B表示3×104个呈对数生长的KS细胞的ELISA测定，图.4C表示1.5×104个MSC的ELISA测定。将来自培养上清液的抗体进行直接铺板。在图.4B和图.4C中将多克隆血清用作正对照。用OPD对所述反应进行显色并在450nm读取吸光率。
图.5表示培养两个月后脾细胞培养物的举例性形态学，所述脾细胞来自接受免疫的小鼠。观察到小结树突细胞、浆细胞克隆(产生抗体的B细胞)、巨噬细胞和仍未被鉴定的上皮样细胞(可能是网状上皮细胞)。
图.6A和6B表示用于产生永生化群体和筛选胸腺细胞的示例性方法。显示CD 3染色的图.6A和显示H2K染色的图.6B表示两个细胞表面蛋白群的FACS分析。
图.7表示将抗原引入至培养中的永生化的细胞群的举例性时程曲线(time course)。
图.8表示对产自永生化的脾细胞的抗体，特别是获自暴露于丝状噬菌体(fd-tet)810或重组噬菌体衣壳pIII820的来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化的脾细胞的抗体进行示例性筛选和验证的结果。
图.9表示对产自永生化的脾细胞的抗体，特别是获自暴露于丝状噬菌体(fd-tet)910的来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化的脾细胞的抗体进行示例性筛选和确认的结果。克隆1-3对应于经历冷冻/解冻的克隆。克隆4-9对应于从96孔板到24孔板进行扩增的并培养了6周的不同小孔；克隆10表示使用单独的培养基作为负对照。其它包括的对照是免疫前和免疫后的血清。
图.10表示对产自永生化的脾细胞的抗体，特别是获自暴露于丝状噬菌体(fd-tet)1010或重组噬菌体衣壳pIII 1020或牛血清白蛋白(BSA)1030的来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化脾细胞的抗体进行估量。克隆1，培养基，负对照；克隆2，免疫前血清；克隆3-7对应于来自培养8周后的不同单克隆系的上清液；条形(Bars)对应于平均值。平均值的标准差小于平均值的1％。
图.11表示对来自来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化脾细胞的上清液的反应性进行的western印迹分析，所述脾细胞产生抗噬菌体蛋白的抗体。如所说明的，在用免疫前血清1110、免疫后血清1120、抗噬菌体抗体1130或含有从永生化脾细胞克隆1140分泌的抗噬菌体IgGs的上清液温育后估计反应性。单独的细胞培养基1150作为另外的负对照。在来自来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化脾细胞的上清液中检测到特异性与pIII 1160和pVIII噬菌体衣壳蛋白1170(箭头)反应的抗体。
说明性实施方案的描述单克隆抗体的生产通常需要通过体细胞与骨髓瘤细胞系配偶体融合(杂交瘤形成)进行永生化脾细胞。尽管杂交瘤可以是永生化的，其可能要依赖饲养细胞层并且可能缺乏遗传稳定性。自杂交瘤技术开创以来，提高单克隆抗体生产型细胞系的效率和稳定性的努力尚未产生实质性的进展。此外，用于生产人抗体的合适的来源于人多发性骨髓瘤的细胞系一直难以发展起来。本发明者描述了大大简化抗体生产和消除对杂交瘤需要的策略。
在某些实施方案中，抗体生产型细胞(例如脾细胞)或抗原呈递细胞(例如树突细胞)来源于携带有编码突变的温度敏感癌基因的多核苷酸的转基因小鼠，所述癌基因在合适的允许含有所述多核苷酸的细胞在允许的温度下有条件地永生化的启动子控制之下表达。在优选的实施方案中，所述温度敏感癌基因是小鼠主要组织相容性启动子控制下的猿猴病毒40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)。在允许温度下(例如33℃)下永生化这些脾细胞，且无需形成杂交瘤即可产生抗体。该方法可用于产生和生产多克隆和单克隆抗体。这些非杂交瘤细胞的生长特性和稳定性为高通量发现和基于抗体的免疫治疗方法提供了另外的组合物和方法。
本发明进一步的实施方案包括用于产生和使用非杂交瘤抗体(即在不形成杂交瘤情况下产生的抗体)的工艺、组合物和方法。本发明的一个实施方案包括用于产生非杂交瘤鼠科动物单克隆或多克隆抗体的组合物和方法。
在进一步的实施方案中，所述方法可包括将合适的表达温度敏感癌基因例如猿猴病毒40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)的细胞类型在体外、离体或体内与抗原接触以产生抗体。在某些方面，分离和永生化来自表达tsSV40Tag的小鼠的抗体生产型细胞，优选地为脾细胞。在一个这样的小鼠(ImmortoMouse，H-2Kb-tsA58转基因小鼠)中，编码tsSV40Tag的核酸的表达在主要的组织相容性启动子的控制之下(Jat等人，1991，其全文在此引用作为参考)。如果在33℃进行培养，来源于ImmortoMouse的细胞保持永生化(Jat等人，1991)。各种包含转基因小鼠和来自表达tsSV40Tag的转基因小鼠的细胞的方法和组合物描述于专利文献中，例如参见美国专利6,399,384；5,866,759；5,688,692；和5,270,191，各专利以其全文在此引用作为参考。在其它方面，可从各种tsSV40Tag表达动物的各种组织中分离和培养抗体生产型细胞或抗原呈递细胞，这些组织包括但不限于骨髓、胸腺、脑或生殖组织。此外在其它方面，可从这类组织样品中分离和培养干细胞。
还有在进一步的实施方案中，可将收获的细胞(例如，来自ImmortoMouse)与一种或多种抗原接触，然后估计抗所述抗原的抗体产量，包括估计抗原结合的特异性。可制备或克隆各种细胞亚群并贮藏以备将来使用。
还有在本发明进一步的实施方案中包括将携带条件性表达的或行使功能的转化癌基因的小鼠与包含用于人抗体生产的遗传补充物的小鼠杂交。在一个实施方案中，可获取来自携带条件性表达或行使功能的转化癌基因和用于产生人抗体的遗传补充物的小鼠的细胞(例如，脾细胞、胸腺细胞、B细胞)，以建立生产人抗体的永生化的细胞群。存在各种描述用于在人或异种抗体的生产中使用小鼠的组合物和方法的专利，这种技术的例子参见美国专利6,673,986、6,657,103、6,162,963、6,235,883、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598。各专利以其全文在此引用作为参考。
抗体生产一般地，通过免疫小鼠或其它具有条件性可永生化的细胞，或将永生化的或潜在地可永生化的细胞与目的抗原相接触来生产本发明的抗体。永生化的或有潜力永生化的细胞可表达条件性行使功能例如只在或低于某个温度下行使功能以及只在特定生长条件下表达的转化基因。例如，可使用由猿猴病毒40早期区域突变体tsA58编码的热不稳定性的大T抗原(tsSV40Tag)建立转基因小鼠或可永生化的细胞系。这些细胞系可在许可温度(例如33℃)下或在特定环境中(例如在四环素存在的情况下)连续培养，但一旦转换至非许可温度(37-39.5℃)下或除去或加入调节因子便显示停止细胞生长。停止生长发生在细胞周期的G1或G2期。在生长停止后，根据总体蛋白合成和排除锥虫蓝能力的测定，所述细胞仍保持代谢活性。这些细胞系在非许可温度或条件下不能分裂。
在对转基因动物进行免疫之后，分别选择具有产生抗体或呈递抗原的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)或树突细胞，用于单克隆抗体产生方案中。这些细胞可获自来自一个或多个受试者的进行活体检测的脾、扁桃腺、淋巴结或外周血样品，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、山羊、母牛、马、绵羊或人。脾细胞和外周血细胞是优选的，前者是因为其是处于分裂成浆细胞阶段的抗体生产型细胞的非常丰富的来源，而后者是因为外周血容易获得。通常，对成组的动物进行免疫并将具有最高抗体滴度的动物的脾脏取出，并通过用注射器对脾脏进行匀浆获得脾脏的淋巴细胞。通常，来自免疫过的小鼠的脾脏含有大约5×107至2×108个淋巴细胞。
将表达转化蛋白的动物(例如，H-2Kb-tsA58 ImmortoMouse)进行免疫或将表达转化蛋白的细胞暴露于抗原(例如，丝状fd-tet噬菌体(Zacher等人，1980))以诱导结合目的抗原的抗体产生。在不同的时间段可重复一次或多次免疫或接触，例如可每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多天或周进行一次免疫或抗原接触。在某些方面，可每隔1天或1周，或每3、4、5或更多天或周进行免疫或抗原暴露。也可以在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多周内或甚至数月内，优选大约12周内进行免疫或抗原暴露。通过一条或多条途径，包括静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮内、皮下(s.c.)或其各种组合施用抗原制备物。在每次加强免疫后可对动物放血，并使用ELISA监控血清中抗抗原的抗体的滴度。
可收获或活体检测来自免疫过的动物的器官(例如，脾脏)，或收获接受抗原暴露的细胞并置于细胞培养基中。通常将所述器官放于两片霜冻的载玻片之间对所述器官的囊施以轻柔的压力将细胞从器官中释放出来。接着，将抗体生产型细胞(例如，脾细胞)重新悬浮于合适的生长培养基上，优选地是杂交瘤培养基，并且以低密度进行培养。通过系列地将细胞转移到新的容器中用重力清除组织碎片。通常，将大约2×108个细胞分配至6、24、和96孔板中并在33℃进行培养。在2-3周的过程中至少完全更换培养基2、3、4或更多次。通常在3周后在多于90％的小孔中观察到克隆。对板进行监控，并且每隔3周左右向每个孔中加入新鲜培养基。通过有限稀释可亚克隆阳性小孔(Harlow和Lane，1988)；也将其中一些克隆转到24孔和96孔板中进行扩增以在长期培养后监控反应性。通过小心地将细胞悬浮于各小孔中和通过使用无血清培养基可避免脾细胞“成团”。通常，在计数和以大约每个小孔0.1-0.5个细胞涂覆所述悬浮物后，在显微镜下系统地观察各96孔板。
在已分离出抗体生产型细胞群后，对其进行筛选并选择具有目的特征(例如对特定病原体或蛋白的选择性结合亲和力)的抗体。当选择出细胞子集时，克隆和繁殖所述已鉴定的细胞。通常使用抗目的抗原例如丝状噬菌体和/或重组蛋白的ELISA来筛选和选择产生目的抗体的细胞，在下面以及Harlow和Lane(1988)中描述了示例性方法。负对照可包括BSA、单独的杂交瘤培养基、免疫前血清和二抗，以用于与分离自免疫过的或暴露于抗原的动物的细胞比较。免疫多克隆血清和抗-抗原的抗体可用作正对照。在特定方面，将来自培养上清液中的抗体直接铺板。通过有限稀释将来自正对照孔中的细胞进行亚克隆以获得单克隆系。通过ELISA对从这些步骤中产生的亚克隆进行抗各种抗原的检验。在ELISA读数计中监控反应性。
当生产有前景的抗体的细胞被确认和亚克隆后，进行western印迹分析和其它抗原结合分析以确定和进一步表征所得的抗体。通常，使用SDS/PAGE电泳分离抗原并电转移至聚偏1，2-二氟乙烯膜上(Bio-Rad)。可将所述膜分割成条，用5％的溶于PBS的脱脂奶粉封闭，接着在合适的洗涤缓冲液例如含有0.1％Tween 20的PBS中进行洗涤。用免疫前血清(1∶1,000)、免疫后血清(1∶1,000)、正对照抗体、含有分泌自永生化细胞克隆的IgGs的上清液、或细胞培养基温育膜条。在各种洗涤后，将缀合检测试剂的二抗(过氧化物酶缀合的二抗)(Bio-Rad)加入到所述膜条上并在室温下进行温育。洗涤膜条，并检测反应性，例如通过增强的化学发光法(ECL)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)进行检测。
在2个月的时期内通常每隔2周对小鼠进行腹膜内(i.p.)抗原注射。在第三和第四次免疫后，可通过ELISA测定法分析各免疫小鼠的血清。一般地，从具有最高抗-抗原的抗体滴度的小鼠中取出脾脏，并且分离脾细胞。通过有限稀释可获得单个克隆。使用起始抗原，通过ELISA监控细胞培养上清液中抗体的产生(Harlow和Lane，1988)。
培养提供了可从其中选择出特定亚克隆的永生化的细胞群。通常，通过在微量滴定板中进行单克隆稀释培养所述细胞，接着对所述单个克隆的上清液(大约2至3周后)的想要的反应性进行检验来进行永生化的细胞的选择。所述测定应当是灵敏的、简单和快速的，例如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。在本领域用于制备和表征抗体的普通方法是众所周知的(参见，例如，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988；在此引用作为参考)。
从细胞中成功生产治疗性蛋白的一个标准是获得保持生产稳定性的细胞系。如果不能达到这个标准，就会在加工效益、时间和资金的有效使用和产品的许可方面产生问题。有几个研究已报道了关于从杂交瘤细胞系生产蛋白的不稳定性。造成杂交瘤细胞中蛋白生产不稳定性的原因是很多的，并且在许多情况下，确切的分子机制尚不清楚。
关于多克隆抗体生产，抗体可离体产生，并且可免除多次抗原注射和在目的抗体产生型动物例如小鼠或兔身上放血的需要。该技术允许产生抗体、T细胞、或天然杀伤细胞的多克隆群，其基于暴露于靶抗原或与给定的组织、细胞群或蛋白相关的抗原组的引发和扩增。由于某些克隆超过其它克隆占据主导地位，因此这样的方法对杂交瘤来说更加困难。
如此处所使用的，术语“抗体”是指任何具有抗原结合区域的抗体样分子，并且包括多克隆和单克隆抗体以及抗体片段例如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的结构和片段的技术在本领域众所周知。用于制备和表征抗体的方法在本领域也是熟知的(参见，例如，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988；在此引用作为参考)。
在本发明的某些实施方案中，来源于转基因小鼠的永生化的脾细胞是无限增殖的并且减少对杂交瘤生产的需要，所述转基因小鼠(称作H-2Kb-tsA58转基因小鼠；ImmortoMouse)携带在小鼠主要组织相容性启动子控制下的突变型温度敏感(ts)猿猴病毒40(SV40)大肿瘤抗原(Tag)。
当使用所述方法鉴定抗体后，可将所述合适的基因进行扩增、克隆和转染至另外的细胞中用于生产抗体。例如可参见美国专利5,658,570、6,165,745和6,602,503以及Daniell，2001；Breitling和Dubel，1999，其各在此引用作为参考。
II.转基因小鼠对细胞系的研究已经大大地提高了我们对许多重要生物学问题的理解。通过向目的细胞类型导入永生化癌基因可帮助产生细胞系(Jat等人，1991)。已知在体外永生化许多不同细胞类型的一个基因编码SV40大肿瘤抗原(SV40TAg)。为避开在体外将基因插入以产生细胞系的要求，已建立了携带SV40TAg基因的转基因小鼠(Jat等人，1991)。由于以前的研究已经显示SV40TAg在转基因小鼠中的表达与肿瘤的发生和异常发育有关，因此使用用于转化的温度敏感的热不稳定性SV40Tag(tsA58(tsSV40Tag))以降低在完整生物体中存在的一般条件下功能性SV40TAg的体内水平。
为指导在广泛的组织中表达，使用具有广泛活性并且可被干扰素诱导的小鼠主要组织相容性复合体H-2Kb启动子。tsSV40TAg mRNA在所有携带杂合构建体的动物组织中表达。宏观下所有组织发育正常。通过几代交配使一株H-2Kb-tsA58小鼠获得纯合性并且传递所述转基因的功能拷贝。这些小鼠称为″ImmortoMice″。所述ImmortoMouse是从Charles River Labs，Wilmington，MA商业购得的。许多不同种类的条件性永生化细胞系衍生于ImmortoMouse，但所述很好建立的小鼠模型还未被开发用来产生单克隆抗体生产型细胞。
ImmortoMouse在其产生单个细胞类型的扩增群的能力上得到开发，所述细胞类型能够在体外和体内进行正常分化以用于分化的细胞机制研究和用于涉及组织修复的细胞移植研究。H-2Kb-tsA58小鼠允许通过在合适条件下生长分离的细胞从而从各种组织中直接产生条件性永生化的细胞系。在这些小鼠中由干扰素诱导的I类抗原启动子控制tsSV40Tag。通过在干扰素存在或不存在的情况下将细胞在33℃进行培养，其可在体外长期生长，同时仍保特在体内和体外进行正常分化的能力。
III.人抗体生产在本发明的一个实施方案中，可将含有条件性行使功能的转化癌基因的转基因小鼠例如ImmortoMouse与携带来自其它物种编码各种用于抗体(详情如下)生产的遗传组分的基因的转基因小鼠杂交，以产生生产其它物种抗体例如人抗体的细胞系。
产生多种完全人单克隆抗体库集(repertoire)的能力在人的治疗方法中具有应用价值。一个最有前景的生产治疗性人多克隆或单克降抗体的方法是建立经基因工程改造以在无小鼠或其它非人抗体存在的情况下产生巨大的人抗体库集的小鼠品系(例如，XenoMouse)。近年来，通过向基因靶向所得的缺乏小鼠抗体生成的小鼠生殖系中导入人免疫球蛋白座位片段产生了小鼠。这些小鼠产生显著水平的具有各种成人类库集的完全人抗体，并且当用抗原进行免疫时，产生抗原特异性人抗体。所述XenoMouse配有大约80％的人重链抗体基因和大量的人轻链基因。这些基因的复杂组装以及其半随机配对使得小鼠识别不同的抗原结构库集。此外，所述小鼠能够加工具有极高的亲和力的完全人抗体。可获得多个XenoMouse动物品系。各品系能够产生不同类的抗体以用于各种应用。这些小鼠品系可提供产生对广谱性抗原包括人抗原具有高度亲和力和特异性的抗体的最优化资源。
通过使用经遗传工程改造的小鼠品系所述XenoMouse产生具有完全为人的蛋白序列的抗体，其中所述遗传工程改造的小鼠中的小鼠抗体基因表达被抑制并且被人抗体基因表达功能性取代，同时小鼠免疫系统的其它部分保留完整。通过将人抗体基因导入小鼠基因组，可对具有这类特征的转基因小鼠进行无限繁殖。重要的是，因为在小鼠中表达的唯一人产物(并因此被识别为“自身”)是抗体自身，所以这些转基因小鼠能够产生抗人抗原的人抗体。所有其它机器都是小鼠的机器，因此任何其它人组织或蛋白被小鼠识别为外来物并且将会产生免疫应答。
一些人蛋白例如细胞因子激素和生长因子或其受体的异常合成会促成各种人的疾病。通过使用人抗体中和或完全清除来调节这些蛋白可用于治疗或完全消除所述疾病。这些转基因小鼠产生可用于生产抗人抗原的人抗体的细胞的能力可在治疗、诊断，或医治各种疾病状况上提供有利方面。一直以来一个挑战就是在稳定的细胞系中生产足够的抗给定抗原的人抗体。通过本发明的实施方案可解决这个问题。在一个实施方案中，杂交的小鼠群体(例如，ImmortoMouse/Xenomouse杂交)可产生能够在不需要形成杂交瘤的情况下产生抗任何人抗原的抗体的永生化的脾细胞。
所述Xenomouse，或具有相似遗传修饰的动物，产生具有不同于嵌合和其它人源化技术的100％人蛋白序列。使用这些小鼠的其它有利方面在于通过使用XenoMouse技术产生的抗体可期望提供更好的安全特性并且被较慢地从人体清除掉，减少用药频率。
XenoMouse技术使用天然的体内亲和力成熟过程在通常2至4个月内产生抗体产物候选者。这些抗体产物候选者可具有比在噬菌体展示中观察到的高上百倍至上千倍的亲和力。与使用人源化和噬菌体展示技术产生的抗体相反，不需要任何随后的工程改造(该工程改造有时被证明是费时和具挑战性的过程)。因此，从被选择的最初抗体到最终的商业抗体，抗体的结构保持完整。
过去，当鉴定具有想要的特征的抗体后，可直接从杂交瘤或从重组细胞系中产生临床前材料。除了大大节省时间外，非杂交瘤产品避免了在杂交瘤或重组细胞系中生产抗体的需要。因此，本发明的实施方案可满足在不需要杂交瘤的情况下在长期培养中生产人抗体的需要。
通常，小鼠产生的单克隆抗体受到患者的排斥，所述患者的免疫系统因为该单克隆抗体不是人蛋白将其识别为外来物。所述患者经常产生人抗小鼠抗体或HAMA。这种应答通过中和结合活性降低了抗体的有效性。任何随后施用小鼠抗体也可能证明是有毒害的。通过使用此处描述的方法，可产生抗几乎任何医学相关的抗原(人或其它的)的抗体。产生供选择的多种抗体的能力在选择最佳抗体产品方面可能是很重要的。在本发明的一个实施方案中，通过所述公开的方法可产生永生化的人单克隆抗体生产型脾细胞群。
此外，Medarex(Princeton，NJ)已经发展出称为UltiMAb HumanAntibody Development SystemSM的系统。该系统已产生了各种类型的完全为人(100％人蛋白序列)的抗体。这些小鼠含有编码人抗体的基因。这些单克隆抗体最可能具有有利的安全特性并且较慢地从人体中被清除，大大地减少了满足对疾病目标起作用的用药频率和剂量。也可将这些小鼠与此处描述的非杂交瘤抗体生产方法组合进行使用。
简短地，此处描述的方法可产生用于治疗或诊断目的的抗肿瘤抗原或在各种疾病状态(例如炎症)下表达的蛋白的抗体。一个实施方案可使用人单克隆抗体靶向或增强药物(如细胞毒素)递送至靶细胞群，这是利用了抗体对靶细胞群(如肿瘤细胞)的亲和力和选择性。在另一方面，人单克隆抗体可用于抑制在许多疾病状态和各种类型肿瘤中过表达的受体(例如生长因子受体，例如表皮生长因子受体(EGFR))的功能。EGFR信号传导可被阻断而导致细胞死亡或增殖受到抑制。其它应用包括用结合靶细胞群体例如肿瘤细胞的荧光抗体对肿瘤进行成像。
在某些实施方案中，由此处描述的方法生产的抗体可用于鉴定或靶向至用噬菌体展示技术确定的脉管邮递区号(vascu1ar zip code)。脉管邮递区号是在人体中药物可被更有效地和更起作用地递送的特异性的和唯一的地址，例如参见美国专利5,622,699、6,174,687和6,232,287，其各在此引用作为参考。通过将药物在肿瘤位置上集中同时限制在身体健康部位出现，脉管靶向可提高例如治疗的有效性。通过施用以称为噬菌体的微小颗粒展现的超过10亿个肽序列的集合，所述肽可优选地找到身体的特异性区域。这种大规模筛选显示循环肽的组织分布是非随机的并且某些肽指向和结合至不同器官上。
这些肽通常结合至存在于组织和器官内的血管上的受体。当在身体中旅行时，肽可模仿配体(肽结合蛋白)行为并且与受试者的细胞、组织、血管或器官内的细胞受体相互作用。通过在体内筛选肽文库可鉴定配体并且反过来所述配体可用来鉴定受体。然后使用此处描述的方法可制备针对所述受体的人单克隆抗体。另外的应用可以是通过在患者体内鉴定循环抗体集库来确定靶标(Mintz等人，2003)，然后生产针对这些靶标的人抗体以在某些情况下发展靶向治疗方法或被动免疫。
历史上新的药物产品在开始人临床试验前要花费近6年的临床前开发。使用完全人单克隆抗体技术，就可能将所述时间减少至低于两年。此外，开发的费用可能是通过制药工业常规开发的化学化合物的费用的一部分。
IV.用于抗体生产的抗原本发明的实施方案包括免疫转基因小鼠或将表达条件性行使功能的转化基因的细胞暴露于各种抗原中以产生抗体生产型细胞或抗原呈递细胞的稳定系。本发明范围内的抗原可包括任何能够激起受试者体液和细胞免疫应答的分子或大分子组装物(assemblage)，包括但不限于肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、病毒、细菌、病原微生物和患病的人细胞。在某些实施方案中需要重要地指出，使用用于产生抗体的离体方法(即，在要接受治疗的患者体外产生抗体)允许生产抗可能不在哺乳动物内例如人中产生的抗原的抗体。通过本发明方法生产抗体使人避开在受试者中的耐受效应。因此，可产生种类扩大了的抗体。这些抗体可靶向以前难以靶向的抗原。
在某些实施方案中，制备抗已确定的靶向肽(例如，靶向特异性器官的肽)或其受体或甚至整个细胞例如肿瘤细胞的抗体可能是想要的。通过连接体、多连头或衍生氨基酸可将合适的靶向肽或受体或其部分偶联、结合、束缚、缀合或化学连接至一个或多个试剂上，包括佐剂。在某些方面佐剂包括胶体金的使用(Dykman等人，1996，其全文在此引用作为参考)。可进行该方法以产生双特异性或多价组合物或疫苗。进一步想到用于制备这些组合物的方法对本领域技术人员来说是很熟悉的并且应当适合于对人受试者进行施用，即药物可接受的。优选的试剂包括载体例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。在各种实施方案中，受试者可以是高等脊椎动物，包括但不限于小鼠、兔、鸡、山羊、绵羊、母牛、狗和人。
在某些实施方案中，可产生抗独特型抗体或抗靶向肽受体的抗体。“靶向肽”是包含连续氨基酸序列的肽，所述肽的特征在于选择性地定位至受试者的器官或组织。例如通过下面公开的方法可确定选择性的定位，其中假定的靶向肽序列被整合入展现在噬菌体外表面的蛋白内。给受试者施用这种噬菌体的文库，然后收集来自所述受试者的一个或多个器官或组织并确定在所述器官或组织中发现的噬菌体，所述噬菌体已经过遗传工程改造以表达大量这类具有不同氨基酸序列的靶向肽。表达靶向肽的噬菌体被认为选择性地定位于组织或器官，如果与对照组织或器官比较，其在所述组织或器官上表现出更多的结合。
总地说来，与对照器官或组织相比，靶向肽的选择性定位应当导致所述噬菌体在靶器官或组织上至少两倍的富集。与对照器官或组织相比，导致在靶器官或组织上至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多的富集是优选的。可选择地，当将从靶器官中回收的噬菌体重新注射入第二个宿主中进行另一轮筛选时，与对照器官相比，表达展现选择性定位的靶向肽的噬菌体应当在所述靶器官内显示增加了的富集。另一个确定选择性定位的方式是与表达非特异性肽或未进行遗传工程化以表达任何推定靶肽的对照噬菌体相比，表达推定靶肽的噬菌体在靶器官中显示至少两倍，优选至少三倍的富集。另一个确定选择性定位的方法是表达靶向肽的噬菌体的靶器官定位至少部分被共同施用的含有所述靶向肽序列的合成肽所阻断。此处所使用的“靶向肽”和“回归肽”同义。
用于抗体生产的其它抗原可包括来自活检组织、来源于患者的细胞、来源于患者的鲜活的肿瘤组织、组织提取物、鲜活的和培养的组织的样品。非常重要的是包含组织成分而并不仅仅是细胞，因为一些相关抗原可能存在于细胞外成分中和/或存在于基质中。其它用于抗体产生的抗原可包括但不限于来自细胞和组织的细胞核部分、细胞质、膜成分、凋亡细胞、纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、激光捕获的组织、石蜡包埋或固定的组织。
A.噬菌体展示使用噬菌体展示可鉴定抗原或抗原候选者。所述方法可包括体内施用噬菌体展示文库。在本发明的各种实施方案中，可确定配体，然后将其用于进一步确定这些配体的受体，之后可将所述受体用于产生永生化的单克隆抗体生产型脾细胞。噬菌体展示的各种方法和用于产生各种肽群的方法在本领域是众所周知的。例如，参见美国专利5,223,409、5,622,699和6,068,829，其各在此处引用作为参考并且描述了用于制备噬菌体文库的方法。
所述噬菌体展示技术通常涉及操作噬菌体以使小肽可在其表面表达(Smith等人，1985，1993)。该技术的潜在应用范围相当广阔，并且在过去的十年中在构建噬菌体展示文库和在发展筛选方法上已经取得相当大的进步，在所述筛选方法中所述文库用于分离肽配体。例如，肽文库的使用已经使得表征许多蛋白内(例如涉及炎症反应的抗体或介导细胞粘附的整合蛋白)的受体-配体结合基元和相互作用位点成为可能。该方法也已被用于鉴定新的作为肽模拟药物或成像试剂开发的前导物的肽配体(Arap等人，1998a)。
通过“生物淘选法”可分离用于靶向给定器官或组织的最有效的氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti，1996；Pasqualini，1999)。简而言之，可施用含有假定的靶向肽的噬菌体文库或使其与细胞群(例如，脾细胞)、动物或人受试者接触并且可收集含有噬菌体的器官或组织的样品或细胞提取物。在一个使用丝状噬菌体的实施方案中，在菌毛阳性的细菌中在进行生物淘选轮回之间可在体外繁殖所述噬菌体。所述细菌不被所述噬菌体裂解但分泌多拷贝的展示特定插入子的噬菌体。结合至靶分子的噬菌体可从靶器官或组织中洗脱出来，然后通过将其在宿主细胞中培养进行扩增。如果想要，可将扩增的噬菌体给人宿主施用并且重新收集器官或组织的样品。可进行多轮生物淘选直至获得选择性结合剂(binder s)群体。通过对对应于所述噬菌体基因组中的所述靶向肽的DNA进行测序来确定所述肽的氨基酸序列。然后可通过标准的蛋白质化学技术以合成肽的方式产生所述确定的靶向肽(Arap等人，1998a，Smith等人，1985)。该方法使得循环靶向肽在无需考虑关于其靶目标本质的情况下在无偏功能测定中能被检测到。
当候选靶被确定为靶向肽的受体后，可使用标准的生物化学方法将其分离、纯化和克隆(Pasqualini，1999；Rajotte和Ruoslahti，1999)。然后将这些纯化的蛋白用作抗原免疫或暴露于细胞群，所述细胞群是例如来自ImmortoMouse的脾细胞、ImmortoMouse杂交产生的人源化细胞群或其它条件性永生化的细胞例如单克隆抗体生产型脾细胞。然后可将这些抗体生产型细胞用于产生抗所述被靶向的受体或抗原的特异性抗体群。
前面在小鼠中进行的体内选择性研究优选地使用在fUSE5载体(Pasqualini和Ruoslahti，1996)中作为与基因III荚膜蛋白融合的蛋白表达的随机肽文库。在给定的文库中存在的单个克隆的数目和种类是体内选择成功的重大因素。优选地使用较少可能具有过度代表缺陷噬菌体克隆(Koivunen等人，1999)的原始文库。应当将所述文库的制备优化至108-109转导单位(T.U.)/ml之间。在某些实施方案中，在各轮筛选之间使用大批量扩增策略。
可将展示线性、环状或双环状肽的噬菌体文库用于本发明范围内。然而，在环状插入子中展现3-10个随机残基(CX3-10C)的噬菌体文库是优选的，因为单个环状肽倾向于具有比线性肽更高的对靶器官的亲和力。已经成功地使用了展示双环状肽(例如CX3C X3C X3C；Rojotte等人，1998)的文库。然而，由于不同的二硫键排列造成多种构象，因此相关(cognate)合成肽的生产尽管是可行的，但是会很复杂。
V.蛋白和肽在某些实施方案中，抗原组合物可包含至少一种可用于抗体生产的蛋白、肽或肽样化合物。如此处所使用的，蛋白或肽通常是指但不限于，大于大约200个氨基酸，达到由基因翻译的全长序列的蛋白；大于大约100个氨基酸的多肽；和/或从大约3至大约100个氨基酸的肽。为方便，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在此处可互换使用。在某些实施方案中，蛋白是由此处描述的方法产生的抗体。
在某些实施方案中，至少一个蛋白或肽的大小可包含但不限于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，大约110，大约120，大约130，大约140，大约150，大约160，大约170，大约180，大约190，大约200，大约210，大约220，大约230，大约240，大约250，大约275，大约300，大约325，大约350，大约375，大约400，大约425，大约450，大约475，大约500，大约525，大约550，大约575，大约600，大约625，大约650，大约675，大约700，大约725，大约750，大约775，大约800，大约825，大约850，大约875，大约900，大约925，大约950，大约975，大约1000，大约1100，大约1200，大约1300，大约1400，大约1500，大约1750，大约2000，大约2250，大约2500或更多氨基酸残基。
如此处所使用的，“氨基酸残基”是指任何天然发生的氨基酸、任何在本领域已知的氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白或肽的残基是连续的，不具有任何中断氨基酸残基序列的非氨基酸。在其它的实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在特定的实施方案中，蛋白或肽的残基序列可被一个或多个非氨基酸部分打断。
因此，术语“蛋白或肽”包括至少包含天然发生的蛋白中发现的20种普通氨基酸之一或至少一个修饰的或非常规氨基酸的氨基酸序列。
通过本领域技术人员已知的技术可制备蛋白或肽，所述技术包括通过标准的分子生物学技术表达蛋白、多肽或肽，从天然资源中分离蛋白或肽，或化学合成蛋白或肽。之前已经公布了对应于不同基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽的序列，并且可在对本领域技术人员公开的计算机化的数据库中查到。一个这样的数据库是National Center forBiotechnology Information’s Genbank和GenPept数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。使用此处公开的技术或本领域技术人员已知的技术可扩增和/或表达已知基因的编码区。可选择地，各种商业制备的蛋白、多肽和肽对本领域技术人员是已知的。
A.肽模拟物另一用于制备根据本发明的多肽的方法是使用用作抗原的肽模拟物。模拟物是包含肽的模拟蛋白质二级结构组成部分的分子。参见，例如，Johnson等人，1993，其全文在此引用作为参考。使用肽模拟物的基本原理是蛋白的肽主链主要起着以有利于分子相互作用(例如抗体和抗原的相互作用)这样的方式对氨基酸侧链进行定向的作用。肽模拟物可期望允许具有与天然分子相似的分子相互作用。这些原理可用于对抗原进行基因工程改造，所述抗原具有此处描述的靶向肽的许多天然特性，但同时具有改变的和甚至改善的特性。
B.融合蛋白本发明的其它实施方案涉及使用融合蛋白作为抗原。这些分子通常将目的肽的整体或绝大部分通过N-或C-端连接至第二个多肽或蛋白的整体或部分上。例如，融合体可使用来自其它物种的前导序列以允许蛋白在异源宿主中进行重组表达。另外的有用的融合包括加入具有免疫学活性的结构域例如抗体的抗原决定部位，以有助于纯化融合蛋白。在融合连接处或附近包含切割位点将有助于在纯化后除去额外的多肽。其它有用的融合包括功能性结构域例如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区的连接。在优选的实施方案中，实施方案中的融合蛋白包含连接至引起免疫应答的抗原性蛋白或肽上的肽。
在其它实施方案中，融合蛋白包括由发明的方法产生的可能与治疗性肽融合的抗体。可整合至融合蛋白的蛋白或肽的例子包括抑制细胞生长的蛋白、杀细胞蛋白、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽类药物、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。
这些例子并不是限制性的，并且可预期事实上在本发明范围内任何蛋白或肽可整合入用于本发明的融合蛋白中。产生融合蛋白的方法对本领域技术人员来说是众所周知的。例如可通过使用双功能交联试剂进行化学附着、通过从头合成完整的融合蛋白或通过将编码第一个肽的DNA序列加至编码第二个肽或蛋白质的DNA序列上，然后通过所述完整融合蛋白的表达来产生这些蛋白。
C.蛋白纯化在某些实施方案中可分离或纯化蛋白(例如抗体)或肽。蛋白质纯化技术对本领域技术人员来说是熟知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞、组织或器官匀浆并粗略地分离成多肽和非多肽部分。使用层析和电泳技术可进一步纯化目的蛋白或多肽以获得部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合于纯肽制备的分析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、HPLC(高效液相色谱)、FPLC(AP Biotech)、聚丙酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦方法。在美国专利号5,206,347中描述了通过亲和层析纯化受体蛋白的例子，其全文在此引用作为参考。其中一个更有效的纯化肽的方法是快速液相层析(FPLC)或甚至HPLC。
纯化的蛋白或肽倾向于称作可从其它组分中分离的组合物，其中将所述蛋白或肽纯化至相对于其天然可获得状态的任何程度。因此，分离的或纯化的蛋白或肽也指脱离其可能天然发生的环境的蛋白或肽。通常，“纯化的”是指已通过分离除去各种其它组分的蛋白质或肽组合物，并且所述组合物基本上保持其表达的生物学活性。在使用术语“基本纯化的”时，该名称是指这样的组合物，其中所述蛋白或肽构成了该组合物的主要成分，例如构成所述组合物的大约50％、大约60％，大约70％，大约80％，大约90％，大约95％或更多的蛋白质。
根据本公开内容，各种用于定量蛋白或肽纯化程度的方法对本领域技术人员来说是熟知的。例如，这些方法包括确定活性部分的比活性或通过SDS/PAGE分析估计级分内的多肽含量。用于估计级分纯度的优选方法是计算所述级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，并因此计算其中的纯度，根据“-纯化倍数(fo1d purificationnumber)”进行估计。当然，用于表示活性量的实际单位依赖于在纯化后所选择的特定测定技术，和依赖于所表达的蛋白或肽是否表现出可检测的活性。
各种适用于蛋白纯化的技术对本领域技术人员来说是熟知的。例如，这些技术包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过加热变性，然后进行离心、层析步骤例如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和层析、等电聚焦、凝胶电脉和这些与其它技术的组合。如通常在本领域已知的，据信进行的各种纯化步骤的顺序是可以改变的，或者可以省去某些步骤，但仍能产生合适的用于制备基本纯化的蛋白或肽的方法。
通常没有要求所述蛋白或肽总是要以其最纯的状态进行提供。事实上，可以想象较不纯化的产物在某些实施方案中会有用处。通过使用较少的纯化步骤组合或通过使用相同的一般纯化方案的不同形式可获得部分纯化产物。例如，可以想到使用HPLC装置进行的阳离子交换柱层析通常会比使用低压色谱系统的相同技术产生更高的纯化倍数。表现较低相对纯度的方法在蛋白产品的总体回收或在维持表达的蛋白的活性方面可具有有利方面。
亲和层析法是基于要分离的物质和可特异性与其结合的分子之间的特异性亲和力的层析方法。这是受体-配体类型的相互作用。通过将其中一种结合伴侣共价连接至不溶性基质上合成柱材料。然后所述柱材料能特异性吸附来自溶液中的物质。通过将条件改变(例如，改变pH、离子强度、温度等)至使结合不能发生的条件时，进行洗脱。所述基质应当是其自身不会以任何明显程度吸附分子并且具有广泛的化学、物理和热稳定性的物质。所述配体应当以不影响其结合特性的方式被连接。所述配体也应当提供相对紧密的结合。并且应当可以在不破坏样品或配体的情况下洗脱所述物质。
D.合成的肽由于其相对较小的大小，按照常规技术可在溶液或在固体支持物上合成一些抗原性肽。各种自动合成仪可商业购得并且可按照已知的方法进行使用。参见，例如，Stewart和Young，(1984)；Tam等人，(1983)；Merrifield，(1986)；和Barany和Merrifield(1979)，各在此引用作为参考。通常从大约6个至高达大约35至50个氨基酸的短肽序列可容易地通过这类方法合成。可选择地，可使用重组DNA技术，其中将编码本发明的肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染至合适的宿主细胞中，并在适合表达的条件下进行培养。
实施例下面的实施例用于说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当意识到，公开于下面实施例中的技术代表了本发明者发现以良好实施本发明的技术，因此可被认为构成了其实践的优选的模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当意识到在不违背本发明精神和范围的情况下，在公开的特定实施方案中可进行许多改变并且仍能获得类似或相似的结果。
实施例1产生永生化的脾脏细胞A.方法分离脾细胞在Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)上收集来自H-2Kb-tsA58小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的脾脏。通过对置于两块结霜的载玻片之间的所述器官的被膜施加轻柔的压力将细胞释放出来。使用氯化铵裂解红细胞并将脾细胞重新悬浮于15ml具有10％CPSR的杂交瘤增强补充物的杂交瘤培养基中。通过尼龙网过滤除去组织碎片。将所述细胞分配至24孔板(2×106/孔)中并且在33℃下进行培养。每隔一周更换培养基。
尽管可使用其它大小的板，但发现24孔板(1ml来自55ml脾的脾悬浮液)可能是优选的。可周期性地更换培养基(例如，每隔一周)。三周后在多于90％的小孔中观察到克隆。
小鼠免疫在12周中每隔一周用丝状fd-tet噬菌体免疫H-2Kb-tsA58小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。简而言之，通过4条途径(静脉内、腹膜内、皮内和皮下)施用含有107转导单位(TU)/μl(总体积＝1ml)的噬菌体制备物。在每次增强免疫后将小鼠放血并用ELISA监控血清中抗噬菌体的抗体滴度。动物实验涉及由来自the University of Texas M.D.Anderson Cancer Center的theInstitutional Animal Care and Use Committee批准和审阅的标准的已建立的方法。
筛选和产生克隆的抗体生产型脾细胞.
如前所述(Harlow和Lane，1998)进行抗丝状噬菌体和抗重组噬菌体衣壳pIII蛋白的ELISA。牛血清白蛋白(BSA)、单独的杂交瘤培养基、免疫前血清和二抗用作负对照。免疫多克隆血清和抗噬菌体抗体用作正对照。直接将来自培养上清液的抗体进行涂板。通过有限稀释(在96孔板中每孔0.1或0.5个细胞)将来自阳性小孔的细胞亚克隆以获得单克隆系。通过使用ELISA对两个月后产生的亚克隆进行抗完整噬菌体颗粒和pIII噬菌体衣壳蛋白的检验。在ELISA读数计上监控反应性。
Western印迹分析.
将丝状fd-tet噬菌体(109TU/泳道)煮沸，通过梯度4-20％SDS-PAGE(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)进行分离并电转移至Immuno-Blot聚偏1，2-二氟乙烯膜(PVDF；Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)上。将所述膜分成条，在室温下用5％的溶解于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的脱脂奶粉封闭1小时，接着用含有0.1％Tween20(PBS-T)的PBS洗涤一次。用免疫前血清(1∶1,000)、免疫后血清(1∶1,000)、抗-fd-tet噬菌体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、含有分泌自永生化脾细胞克隆的抗噬菌体IgGs的上清液或单独的细胞培养基在室温下温育膜条2小时。洗涤3次后，向膜条上加入过氧化物酶缀合的二抗(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)并在室温下温育1小时。洗涤膜条三次并且通过增强的化学发光法(ECL；Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)检测反应性。
ELISA下面是用于估计所述单克隆抗体产物存在或不存在的测定法的一个例子。被选择的抗原可在PBS中被固定在(109颗粒或5μg/小孔)高结合测定板(High Binding Assay Plates)(Costar例如，24，48或96孔板)上。用2mg溶于PBS的牛血清白蛋白(BSA)涂覆对照小孔，于4℃过夜。然后在室温下以一系列的浓度温育一抗或对照多克隆种类IgG(Sigma)1小时。加入二抗(抗种类-Fab碱性磷酸酶缀合体，Sigma，1∶3000于3％的BSA中)并温育1小时。用对硝基苯磷酸(Sigma)显色ELISA，并可在1-4小时后在405nm进行读数(Reader 520，Organon Teknika)。
免疫沉淀和Western印迹分析可在蛋白酶抑制剂存在的情况下将目的抗原稀释在50mMTris-HCl pH 7.6，1％NP-40，150mM NaCl，和0.1mM ZnOAc中。通过Lowry方法(Bio-Rad)可确定蛋白浓度。在蛋白质G-琼脂糖(Pharmacia)存在的情况下和在正被讨论的克隆存在的情况下可以大约5μg/ml单克隆抗体的浓度免疫沉淀蛋白。可通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的蛋白，转移至硝酸纤维素膜，用抗单克隆抗体(例如，小鼠或人)IgG HRP(Jackson Laboratories)进行印迹杂交，并且通过增强的化学发光法(Renaissance，NEN)进行显示。可选择地，可通过SDS-PAGE凝胶首先对目的蛋白进行分离，然后将所述蛋白转移至硝酸纤维素纸上并用正被讨论的单克隆抗体群探测，并使用抗单克隆抗体(例如，小鼠或人)IgG HRP(Jackson Laboratories)显示结果，并通过增强的化学发光法(Renaissance，NEN)进行显示。
永生化的脾培养物的离体免疫在回收自脾脏的细胞铺板大约5天后，小孔可接受抗原剂量，例如浓度变化范围从0.5×1010至1×1012TU/2×106个细胞的噬菌体(fd-Tet)。该步骤可被当作“引发步骤”或“第一次离体免疫”。在引发(spleen I)后第18和25天和引发(spleen II)后14和21天进行进一步的免疫增强(例如，可加入相同量的噬菌体)。可选择地，在并行的实验中，通过与已经暴露于噬菌体(用噬菌体负载)的树突细胞(DC)共温育引发脾细胞。在该实施例中，没有随后的免疫增强。可按图.7中时间线所显示的进行离体免疫。为用完整细胞进行离体免疫，如上所述与用凋亡的B16-F10细胞负载的DC或单独的凋亡细胞进行共温育。
B.结果抗Fd-Tet的体外免疫结果显示于图.1A和1B。用pIII纯化蛋白(5μg/小孔)或Fd-Tet(1011TU/孔)涂覆ELISA板于4℃过夜。在“第一次免疫”后7天和“第二次免疫”后4天收集来自指明的小孔中的条件培养基。作为对照，使用来自一个用Fd-Tet(3次注射)接种疫苗的动物的免疫前和免疫后血清。用缀合(ZYMED)的抗鼠科动物总Ig HRP和和OPD对板进行显色。
用确定的抗原(丝状噬菌体)免疫H-2Kb-tsA58小鼠并通过ELISA监控血清中的抗噬菌体抗体滴度。在最终的增强免疫后第7天抗噬菌体IgG滴度达至最高水平(以1∶3,200稀释时OD450＞3，相比之下免疫前血清的＜0.1)(图.8)。进一步系列稀释检验表明抗噬菌体IgG滴度平均为大约1∶6,400。此外，抗pIII蛋白(以10μg/孔涂覆)的血清滴度平均为大约1∶1,600(数据未显示)。收集小鼠的脾脏并在DMEM中制备细胞悬浮液。将所述细胞分配至96孔板中并于33℃下培养。在2-3周期间完全更换培养基3次。3周后在多于90％的小孔中观察到克隆。为检测抗体的反应性，在涂覆有噬菌体颗粒的微量滴定板中对上清液进行ELISA。高达58％的克隆呈抗噬菌体IgG反应阳性。
尽管细胞密度低但观察到脾细胞是健康的，并且在来自大部分小孔的上清液中产生极高水平的反应性。为获得单克隆细胞系，通过有限稀释克隆来自阳性小孔的细胞并且大部分克隆保持阳性。重复两次单克隆系的亚克隆，并且几乎所有所得的克隆都呈阳性，为所述产生的细胞系实际上来自单个克隆提供了有力的证据。
通过抗噬菌体颗粒和抗小噬菌体衣壳蛋白(pIII)的ELISA检验4-8周后出现的克隆。另外，从96孔移至24孔板中扩增时或在冷冻和解冻后，绝大部分阳性克隆继续起反应(图.9)。观察到抗完整噬菌体的强反应性，并且其中一些克隆也起着抗重组pIII融合蛋白的反应(图.10)。将处于所有阶段的原始的板和克隆保持培养达3个月。
为确定通过ELISA筛选的抗体在Western印迹方法中能否识别特定的蛋白，通过SDS-PAGE分离丝状噬菌体制备物获得pIII和pVIII噬菌体衣壳蛋白，并针对这些衣壳蛋白评估来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化脾细胞的上清液。用免疫前血清、免疫后血清、商业购得的抗噬菌体或含有分泌自永生化的脾细胞克隆的抗噬菌体IgGs的上清液温育含有噬菌体蛋白的PVDF膜。单独的细胞培养基用作另外的负对照。在来自源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的永生化脾细胞的上清液中检测到特异性地与对应于pIII和pVIII噬菌体衣壳的条带起反应的抗体(图.11)。该结果证明由此处描述的方法学产生的抗体也可用于例如免疫印迹(图.11)或细胞表面抗原荧光激活的细胞分选(FACS)(未显示数据)的应用中。
似乎来自H-2Kb-tsA58转基因小鼠的脾细胞可产生高滴度的抗确定抗原的IgG。该细胞培养系统确保可靠的和可重复的单克隆抗体来源并且消除对产生杂交瘤的需要。
本发明的几个有利方面值得进一步评注。第一，在培养过程中抗体合成细胞稳定数月和可能数年，能忍受有限稀释克隆和冷冻-解冻技术，而在抗体产生方面没有损失或失活。已将多克隆群体冷冻并且可分泌给定IgG的可存活的克隆得以恢复(未显示数据)。
第二，永生化的克隆在33℃下生长缓慢并且在遗传上是稳定的，允许适时处理大量的样品(并且，从逻辑上可能获得“稀有”抗体)。来源于H-2Kb-tsA58的脾细胞使得能从含有已经长期培养的克隆的小孔中产生大量的特异性多克隆IgGs。相反地，因为处于克隆的随机混合物中，非分泌克隆通常超过分泌克隆从而使杂交瘤产生问题。初步的数据表明来源于H-2Kb-tsA58转基因小鼠的IgG分泌和非分泌脾细胞之间的繁殖速率是相似的(未公开的观察结果)。
第三，通过其它脾脏来源的有助于抗体产生的永生化细胞类型(例如巨噬细胞和成纤维细胞)的存在增强了体外免疫，然而用有限增殖的脾细胞或杂效瘤进行体外免疫是无效率的。考虑到在腹水生产上近来所受到的限制，这项新技术有利于离体方便地大规模生产单克隆抗体。
第四，将H-2Kb-tsA58小鼠与表达用于人抗体生产的遗传补充物的小鼠杂交也可使得能够生产人单克隆抗体。此处描述的策略可替代杂交瘤生产并且使小鼠和人单克隆抗体的生产简化并更有效率，具有深远的和现时的科学和医学利益。
使用fd-Tet进行离体免疫的结果显示于图.1A和1B。用pIII噬菌体衣壳蛋白(5μg/小孔)或完整的噬菌体颗粒(1011TU/小孔)涂覆ELISA板于4℃下过夜。在引发后的第11和22天(spleen I)以及第19和26天(spleen II)收集在不同实验条件下来自培养细胞的条件培养基。作为噬菌体反应性的正对照和负对照，使用免疫前和免疫后抗噬菌体多克隆血清。收集来源于在12周内每隔一周用fd-Tet噬菌体免疫的小鼠的血清。用抗小鼠Ig-过氧化物酶(ZYMED)的二抗和TMB(Calbiochem)对板进行显色。在ELISA读数计上监控光密度。
永生化脾细胞的形态学来自免疫动物的永生化的脾细胞的一般形态学显示于图.3A、3B和3C。图片是培养2个月后照的。可观察到小结树突细胞、浆细胞(产生抗体的B细胞)克隆、巨噬细胞和仍未鉴定的上皮样细胞。
来自免疫小鼠的脾细胞的形态学在培养2个月后对来自免疫小鼠的脾细胞进行可视分析。观察到几种不同的细胞，例如小结树突细胞、浆细胞(产生抗体的B细胞)克隆、巨噬细胞和仍未鉴定的上皮样细胞(可能是网状上皮细胞)。
尽管已证明脾脏和骨髓细胞培养物对抗原呈递表现良好，但数据显示淋巴结也对抗原呈递表现良好(未显示数据)。
实施例2从骨髓(BM)中产生永生化的树突细胞(DCs)在并行的研究中，通过与已经暴露于噬菌体(加入噬菌体)或其它抗原的树突细胞(DC)共培养来引发脾细胞。
A.方法获取和分离骨髓细胞通过将27G的针穿入髓腔从H-2Kb-tsA58小鼠的股骨、胫骨和骺的长骨中获取骨髓(BM)。用氯化铵裂解红细胞。将单一细胞悬浮液涂覆在皮氏培养皿上。将细胞于33℃下进行培养。在各板中加入7mlRPMI 1640，所述RPMI 1640含有10％的FBS以及鼠科动物(mu)GM-CSF(10ng/ml)和r-muIL-4(10ng/ml)。三天后，向板中补充3ml加入了细胞因子的完全培养基。培养5天后，细胞群体中大约50％具有未成熟树突细胞。收集松散粘附的正在增殖的DC聚集体并重新涂板。将未成熟DCs与丝状噬菌体(fd-tet)(1.5×1012TU/1×106未成熟DCs)或凋亡的B16-F10细胞(2∶1，DCs/B16)共培养。在TNF-α(已知诱导DCs成熟的因子)存在或不存在的情况下连续温育48小时。
制备凋亡的B16-F10细胞通过对大约1×106个细胞/ml的B16-F10细胞悬浮液使用UV辐射(UV Stratalinker，Stratagene 4焦尔/cm2进行20min)在B16-F10细胞中诱导凋亡。24小时后，67％的所述细胞呈现膜联蛋白阳性，表明所述细胞开始凋亡。
诱导T细胞或B细胞应答为了诱导T和/或B细胞介导的应答，可将DC细胞与来源于脾的细胞混合。然后，在不同实验条件(加入或不加入抗原，例如噬菌体或凋亡的细胞)下以5∶1的比例(SDC/DCs)将DCs与分离的来源于脾的细胞(sDC)共培养以诱导T和/或B细胞介导的应答。
B.结果树突细胞根据其对生物学因子的特性和应答，在条件性永生化的DC细胞中树突细胞在体外的标准行为发生了改变。对于B细胞可能存在选择压力，所述B细胞对由相同小孔中的树突细胞持续呈递的抗原有应答。离体免疫也可用于本发明的各种实施方案中以提供恒定的抗原呈递。
通过FACS分析可估计所述“永生化的”未成熟DCs中的特异性细胞表面抗原的存在。涂板5天后，使用几种抗体抗CD80、抗CD86和抗H2k(BD)抗体，对细胞的表面抗原进行估计(Weigel等人.，2002)(图.2)。用来自骨髓的细胞因子进行分化的DCs的特征形态学显示于图.2中。
干细胞永生化的细胞的另一用途可能是替代患病受试者的干细胞群。在一个实施例中，可对动物例如小鼠的骨髓进行辐射，并用来源于永生化的动物例如ImmortoMouse的骨髓或任何干细胞源替换其。为了对任何结果进行分析，可杀死正常动物以鉴定可能无限增殖的任何干细胞，所述干细胞来自无限增殖的小鼠。这将允许鉴定靶向特定器官的干细胞。此外，将ImmortoMouse与Rosa小鼠(在所有细胞中表达Lac Z)杂交也将不仅有助于来自ImmortoMouse的细胞的生长也有助于对其进行标记以使能在受者中进行跟踪。
已经分离和表征了来自ImmortoMouse的脑干细胞。由图.5中的圆形细胞培养的最小细胞(图上最右下部)看来是脾脏干细胞。因此，分离永生化的干细胞和导入该群体可在将来用于提高受试者例如癌症患者的存活机会。
实施例3抗完整细胞的单克隆抗体的产生A.方法免疫三周内每隔一周用5×106个间叶细胞干细胞(MSC)对H-2Kb-tsA58小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)进行免疫。使用ELISA和FACS估计血清中的抗MSC抗体滴度。动物实验中使用了University of Texas M.D.Anderson Cancer Center的Institutional Animal Care and Use Committee审阅和批准的标准的已建立的方法。
永生化脾细胞的获得杀死小鼠并在Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中收集其脾脏。对置于两块结霜的载玻片之间的器官的被膜施以轻柔压力以释放出细胞。然后，将脾细胞重新悬浮于15ml具有10％CPSR和杂交瘤增强补充物的杂交瘤培养基中。通过尼龙网过滤除去组织碎片。将所述细胞重新悬浮于55ml培养基中并以不同密度分配至6、24和96孔板中。将板于33℃下进行温育。在2-3周期间内完全更换培养基3次。在大部分小孔中观察到克隆。
涂板方案如下将所述脾在55ml中重新悬浮；播种至一个6孔板和一个24孔板中，将剩下的细胞稀释至大约280ml并分配至20×96小孔、5×24小孔和3×6小孔中。研究进行3个月后，通过ELISA本发明者评估来自96孔板中的59个克隆(83％为+)、来自24孔板中的61个克隆(82％为+)。很明显在该系统中从55ml播种至24孔板是最有可能的培养条件。数月后细胞看起来很健康并且所有小孔都呈阳性。可成功地获得来自这些小孔的亚克隆。
实施例4抗卡波西肉瘤(KS)细胞和间充质干细胞(MSC)的抗肿瘤反应性A.方法收集血清开始进行免疫方法之前和在2或3周后(免疫后血清12次注射后，免疫后血清23次注射后)给小鼠放血。测定抗KS和MSC细胞的血清特异性反应性，所述细胞涂板于多孔平板中并如下列所述用2％PAF固定(图.4A)。
ELISA测定通过ELISA测量血清抗肿瘤反应性。将3×104个呈对数生长的KS(图.4A和4B)或1.5×105个MSC细胞/孔(图.4C)涂覆在96孔板中。于37℃过夜后，用PBS洗涤细胞一次，在室温下于2％PFA中固定10分钟并用PBS漂洗一次。将板保存在-20℃直至使用。在用PBS-2％BSA于室温下封闭1小时后，按一式两份加入于PBS-0.5％BSA中稀释至1/500或1/1000的血清(图.4A)并于4℃温育过夜。将来自培养上清液的抗体进行直接涂覆(图.4B和4C)。第二天，用PBS-0.5％BSA，0.01％Tween 20漂洗板3次和只用PBS漂洗一次。将100μl按1/2000稀释于PBS-0.5％BSA的缀合(ZYMED LaboratoriesInc.，California，USA)的兔抗鼠Ig辣根过氧化物酶(HRP)加入至所述板中。在室温下震荡温育90分钟后，如上洗涤板三次。用邻苯二胺(OPD)(Sigma-FAST，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA Fast-tabs)对反应进行显色并以50μl/孔3M的硫酸终止反应。在微量培养板读数计中于450nm读取吸光率。估量了超过100个克隆。
阳性细胞的亚克隆通过有限稀释(0.1或0.5细胞/孔，于96孔板中)亚克隆来自阳性小孔的细胞以获得单克隆细胞系。
实施例5产生永生化的胸腺细胞在第14天时从H-2Kb-tsA58中取出胸腺并在Dulbecco’smodified Eagle’s培养基(DMEM)中进行收集。对置于两块结霜的载玻片之间的器官的被膜施以轻柔压力以释放出细胞。然后，将胸腺细胞重新悬浮于15ml具有10％CPSR和杂交瘤增强补充物的杂交瘤培养基中。通过70μm尼龙网过滤除去组织碎片。将所述细胞分配至24孔培养板中并于33℃下培养。
使用抗鼠科动物抗体CD3、B220、H2k、CD86、CD80、CD11c和MAdCAM-1(识别上皮网状细胞)通过FACS对剩下的细胞进行分析。FACS结果显示下列阳性细胞的百分比(图.6A和6B)CD 3+75％和H2k+20％。CD45RA(B220)3.5％(未显示数据)、CD86+4％(未显示数据)、CD80+0％(未显示数据)、CD11c+0％(未显示数据)、MAdCAM-1+0％(未显示数据)。
根据本公开内容无需过度实验即可使用和制备此处要求保护和公开的所有方法、组合物和装置。对于本领域技术人员来说，在不背离要求保护的主题的概念、精神和范围的情况下对此处描述的方法、组合物和装置进行改变是显而易见的。更特别地，很明显某些化学和生理学相关的试剂可用于取代此处描述的试剂，而仍能取得相同或相似的效果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这样的相似替代和修饰被认为是在所述要求保护的主题的精神、范围和概念之内。
参考文献下列参考文献提供示例性方法，并对本公开内容进行详细补充，它们在此明确引用以作参考。
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权利要求
1.用于产生抗体生产型细胞的方法，所述细胞产生抗想要的抗原的抗体，所述方法包括步骤(a)以有效地诱导抗体生产型细胞产生抗想要的抗原的方式将所述细胞与所述抗原接触，其中所述抗体生产型细胞在不形成杂交瘤的情况下能被永生化；和(b)使所述抗体生产型细胞永生化。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体生产型细胞包含条件性行使功能或条件性表达的转化癌基因，并且通过诱导所述转化癌基因实现所述永生化。
3.权利要求2的方法，其中所述条件性行使功能的转化癌基因是温度敏感的SV40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)。
4.权利要求3的方法，其中所述tsSV40Tag是A58S-SV40Tag。
5.权利要求4的方法，其中通过将所述抗体生产型细胞在25℃至35℃下培养来诱导所述转化癌基因。
6.权利要求5的方法，其中所述抗体生产型细胞在30℃至35℃下培养。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体生产型细胞培养在33℃下。
8.权利要求5的方法，其中所述抗体生产型细胞培养在杂交瘤培养基中。
9.权利要求5的方法，进一步包括估计所述抗体生产型细胞的抗体生产能力。
10.权利要求9的方法，其中所述估计包括估计抗体与所述想要的抗原的结合。
11.权利要求1的方法，其中选择单个细胞并进行培养以产生生产单克隆抗体的单克隆群体。
12.权利要求11的方法，其中通过稀释克隆来选择单个细胞。
13.权利要求1的方法，其中选择多个细胞并进行培养以产生生产多克隆抗体的多克隆群体。
14.权利要求1的方法，其中所述抗体生产型细胞包括脾细胞。
15.权利要求1的方法，其中所述抗原选自肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、糖类、病毒、细菌、病原微生物、组织、完整细胞、活检组织、来源于患者的细胞、组织提取物、活体或培养的组织、凋亡细胞、亚细胞成分、膜、细胞质和来自细胞和组织的细胞核部分、纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、激光捕获的组织、石蜡包埋和固定的组织。
16.权利要求15的方法，其中所述组织包括来源于受试者的肿瘤组织。
17.权利要求1的方法，其中所述抗体生产型细胞获自具有在不形成杂交瘤的情况下能被永生化的抗体生产型细胞的转基因小鼠。
18.权利要求17的方法，其中所述转基因小鼠包含用于生产人抗体的遗传补充物。
19.权利要求1的方法，其中所述抗体生产型细胞包含于小鼠中，并且将所选择的抗原以有效地诱导所述抗体生产型细胞生产抗体的方式给所述小鼠施用。
20.权利要求1的方法，其中与想要的抗原接触包括将所述抗体生产型细胞与抗原呈递细胞共培养。
21.权利要求20的方法，其中抗原呈递细胞是树突细胞。
22.权利要求1的方法，其中所述抗体生产型细胞包含用于人抗体生产的所述遗传补充物。
23.权利要求1的方法，进一步包括纯化由所述抗体生产型细胞生产的抗体。
24.权利要求23的方法，进一步包括给需要治疗性抗体的受试者施用所述抗体。
25.用于产生抗体生产型细胞的方法，所述细胞产生抗想要的抗原的人抗体，所述方法包括步骤(a)获得条件性表达转化癌基因或表达条件性行使功能的转化癌基因和表达用于人抗体生产的遗传补充物的抗体生产型细胞，其中通过诱导所述转化癌基因的表达或功能实现所述抗体生产型细胞的永生化；和(c)将所述抗体生产型细胞与想要的抗原以有效地诱导所述细胞产生抗所述抗原的人抗体的方式接触，其中所述抗体生产型细胞能在不形成杂交瘤的情况下被永生化；和(b)永生化所述抗体生产型细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述条件性行使功能的转化癌基因是温度敏感的SV40大肿瘤抗原(tsSV40Tag)。
27.权利要求26的方法，其中所述tsSV40Tag是A58S-SV40Tag。
28.权利要求27的方法，其中通过将所述抗体生产型细胞在从25℃至35℃下进行培养来诱导所述转化癌基因。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体生产型细胞在从30℃至35℃下进行培养。
30.权利要求29的方法，其中所述抗体生产型细胞培养在33℃下。
31.权利要求25的方法，其中选择单个细胞并进行培养以产生生产单克隆抗体的单克隆群体。
32.权利要求25的方法，其中选择多个细胞并进行培养以产生生产多克隆抗体的多克隆群体。
33.权利要求25的方法，其中所述抗体生产型细胞包括脾细胞。
34.权利要求25的方法，其中所述抗原选自肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、糖类、病毒、细菌、病原微生物、组织、完整细胞、活检组织、来源于患者的细胞、组织提取物、活体或培养的组织、凋亡细胞、亚细胞成分、膜、细胞质和来自细胞和组织的细胞核部分、纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、激光捕获的组织、石蜡包埋和固定的组织。
35.权利要求34的方法，其中所述组织包括来源于受试者的肿瘤组织。
36.权利要求25的方法，其中所述抗体生产型细胞获自具有在不形成杂交瘤的情况下能被永生化的抗体生产型细胞的转基因小鼠。
37.权利要求25的方法，其中所述抗体生产型细胞包含于小鼠中，并且将所选择的抗原以有效地诱导所述抗体生产型细胞生产抗体的方式给所述小鼠施用。
38.权利要求25的方法，进一步包括纯化由所述抗体生产型细胞生产的抗体。
39.权利要求38的方法，进一步包括给需要治疗性抗体的受试者施用所述抗体。
全文摘要
本发明包括用于在不需要杂交瘤形成的情况下产生抗体生产型细胞的方法和组合物。在一个实施方案中，所述方法包括通过从具有永生化细胞群体的转基因小鼠中获取细胞来产生单克隆抗体生产型细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括使用具有永生化的细胞群体的转基因小鼠与能够产生人源化抗体的转基因小鼠杂交以产生人的和永生化的单克隆抗体生产型细胞系。
文档编号C12N5/10GK1852922SQ200480013258
公开日2006年10月25日 申请日期2004年4月14日 优先权日2003年4月14日
发明者R·帕斯奎利尼, W·阿拉普 申请人:得克萨斯大学体系董事会