专利名称：第17号染色体数量性状基因座精细定位及其在标记辅助选择中的应用的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及动物之中遗传差异的检测。更特别地，本发明涉及作为与更高的肉品质和生长速度及脂肪沉积相关的可遗传表型的指征的遗传变异。本发明还揭示了使用与动物基因分型中的变化和选择相关的特异遗传标记和染色体区域的方法和组合物。
背景技术：
研究人员发现数量性状表型在天然群体中连续分布，这是由于不同区域中多个基因的等位基因分离所致。这些数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)组合QTL等位基因的环境敏感性中的差异可影响表型。确定数量性状变化的遗传和环境基础对于人体健康、农业和进化的研究具有重要作用。但是对数量性状的完全的遗传剖析目前仅在易于遗传处理的及良好鉴定的模型系统中可行(Mackay，Nat.Rev.Genet.211-20(2001)；Wright et al.，Genome Biol.22007.1-2007.8(2001))。例如，参与数量遗传变异的基因数目还未知，这些基因的各个等位基因的数目和效应或者所述基因的作用一般也未知。迄今为止，几乎没有数量性状基因和其变体被检测到。例如，这种数量性状如牛的双倍肌肉(double-muscling)(Grobet et al.，Mamm.Genome9210-213(1998))、果实大小的改变(Frary et al.，Science 28985-88(2000))、猪的生长和生产性能(Kim et al.，Mamm.Genome 11131-135(2000))、猪骨骼肌中过量的糖原含量(Milan et al.，Science2881248-1251(2000))、及绵羊的排卵和胎仔数增加(Wilson et al.，Biol.Reprod.641225-1235(2001))。在大多这些实例中突变的效应也如此大以至于表型几乎如孟德尔性状一般分离。
为了理解及利用复杂的数量性状的遗传学，衍生自感兴趣的性状显著不同的两个谱系的实验群体已经成功地用于模型物种(Belknap etal.，Behav.Genet.23213-222(1993)；Talbot et al.，Nat.Genet.21305-308(1999))、植物(Paterson et al.，Nature 335721-726(1988))和家畜(Andersson et al.，Science 2631771-1774(1994))中以检测数量性状基因座(QTL)。这些研究已经针对在亲代群体之间例如在商业性农业培育品种与野生型群体之间发生次数方面不同的等位基因成功定位QTL(Paterson et al.，Nature 335721-726(1988)；Andersson et al.，Science 2631771-1774(1994))。除了理解数量性状的构筑之外，包括农业物种的杂交也通过潜在性利用原种群内的变异而促进；商业性植物和动物群通常不基于QTL检测研究中使用的杂种，但是谱系杂交中连锁研究的能力通常高于群体内研究的能力。例如在商业性猪种群中，原种群包含闭锁杂交繁殖种群，其在许多世代上已经进行了选择以改良其商业性能，而野猪(Andersson et al.，Science 2631771-1774(1994))和中国梅山猪(Walling et al.Anim.Genet.29415-424(1998)；De Koning et al.，Genetics 1521679-1690(1999)；De Koning et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 977947-7950(2000)；Bidanel et al.，Genet.Sel.Evol.33289-309(2001))群通常用于QTL研究中。使用趋异谱系的许多QTL研究中的固有假说是群体之间遗传变异的知识可以推断其它种群或物种中的遗传变异。商业种群中QTL的分离可由育种者通过基因或标记辅助选择程序加以利用(例如Dekkers and Hospital，Nat.Rev.Genet.322-32(2002))。
例如对猪肉和脂肪产生的选择已经进行了几个世纪，但是使用现代统计学方法的深入选择仅在过去的50年进行了实践(Clutter，A.C.，and E.W.Brascamp，1998 Genetics of performance traits，pp.427-462 inThe Genetics of the Pig，edited by M.F.Rothschild and A.Ruvinsky.CAB International，Wallingford，UK)。
直至最近还不可以鉴别与连续性状变异相关的基因或者直接观测其不同的等位基因的效应。但是现在遗传标记的丰富使得可以鉴别数量性状基因座(QTL)-与性状变异相关的染色体区域或个体序列变体(Barton et al.，Nat.Rev.Genet 311-21(2002))。就该基因在物种和动物之中是保守的而言，期望不同的等位基因也与某(些)基因以及经济或产肉动物物种如牛、羊、鸡等中的可变性相关。在物种之中存在保守的多态性。例如，Nonneman等最近发现了在猪TBG基因的外显子2中的多态性，其导致共有的组氨酸改变为天冬酰胺。这个SNP位于成熟多肽的配体结合结构域，梅山猪等位基因是在人、牛、羊和啮齿动物TBG中发现的保守的等位基因。人TBG的这个区域中的突变导致热稳定性及配体亲和性降低。功能研究表明了TBG同种型的结合特性改变(Nonneman et al.，Plant & Animal Genomes XIIConference，″Functional Validation of A Polymorphism for Testis Size onthe Porcine X Chromosome″，January 10-14，2004，Town & CountryConvention Center，San Diego，CA.)。另外，Winter等发现在不同的品种中奶中脂肪含量增加与在由牛DGAT编码的蛋白质的第232位的赖氨酸显著相关。不同的植物和动物物种的DGAT1氨基酸序列对比表明了在牛序列的第232位的一个保守的赖氨酸残基(Winter et al.，Proc Natl Acad Sci USA.July 9；99(14)9300-9305(2002)))。另外，已经鉴别了MATP基因中的一个保守突变，其导致马的乳白色皮毛色。这个保守的突变也在小鼠和人中进行了描述，但在青鳉中未进行描述(Mariat et al.，Genet Sel Evol.Jan-Feb；35(1)119-33(2003))。
在物种间也存在基因保守的例子。参与基础生物学过程的许多基因在物种进化后还是保守的，即许多基因在不同的物种中是相似的。已经表明MC1-R基因是一种良好保守的基因，除了染色之外无其它基本功能。在一些物种中，MC1-R基因中的突变已经示出导致黑色素的显性表达(Klungland et al.，Pigmentary Switches in DomesticAnimal Species Annals of the New York Academy of Sciences，994331-338(2003))。已发现一种特异蛋白质-DNA相互作用由糖皮质激素受体蛋白(GCR)的结合位点中的一个单一碱基对改变而阻断。另外，据报道所有三个推定的结构域(类固醇结合结构域、免疫反应性结构域和DNA结合结构域)在两个趋异物种猪和大鼠之间是保守的(Marks et al.，J Steroid Biochem.Jun；24(6)1097-103(1986))。
保守的基因次序的实例由Seroude等(Mammalian Genomics，Jun；10(6)565-8(1999))论证，其中构建了含有RN基因的染色体15q2.3-q2.6区域的辐射杂交图，其对肌中糖原含量和肉品质具有很大作用。对10个微卫星和8个基因定位。他们发现基因AE3和INHA的相对次序在猪物理图谱中与小鼠连锁图相比是倒转的，但是在小鼠中已经定位的其它基因的次序与猪相同。另外，他们发现在猪染色体15和人染色体2q中基因次序之间无明显差异。基于动物的进化连锁和比较基因组，可以确定基因中的变异是否或可能与紧密连锁的物种之间的功能性状相关。
事实上，遗传改良经济性状的最佳方法是发现相关的染色体区域，然后在选择下在群体中直接发现遗传标记。可以对来自育种机构的核心群体的一些动物持续进行表型测定。收集这个表型数据以使得可以检测相关的遗传标记，并使用实验群验证鉴别的标记或者测试候选基因。
不是所有的基因均具有可用于相关研究中的可易于鉴别的普通功能性变体，在许多基因情况中，研究人员仅在个体核苷酸中鉴别了无已知功能意义的改变(即单核苷酸多态性(SNP))。然而，SNP在缩小染色体内连锁区域中具有潜在用途。另外，SNP可示出与一个数量性状的统计学显著相关性，如果由于连锁不平衡而位于该基因内或邻近该基因。
然后显著的标记或基因可直接包括在选择方法中。分子信息的一个优势是我们可以在非常幼龄的育种动物中获得它们，这意味着动物可以基于DNA标记预先进行选择，之后完成生长性能测试。这对于所有的测试和选择系统是一个巨大优势。
多态性可期望被用作遗传标记以确定哪些基因有助于多基因或数量性状，适当的标记及应用这些标记的适当的方法已经开始应用于涉及生长和肉品质的基因。
从前述可以看出需要鉴别与基因组区域相关或与基因组区域连锁不平衡的遗传变异，这可用于通过鉴别并选择在遗传水平具有改良的特性的动物而改良动物中经济学有益的特性。
本发明的另一目的是鉴别一个遗传基因座，其中存在的变异对育种者感兴趣的表型性状具有数量效应。
本发明的另一目的是提供一种确定这种遗传变异存在的特殊分析方法。
本发明的再一目的是提供一种增加选择精确性的评价动物的方法及针对希望的性状进行育种的方法。
本发明的又一目的是提供一种PCR扩增测试以大大加速对这种数量性状变异的标记存在的确定。
本发明的另外目的和优点有一部分在如下的描述中进行说明、有一部分通过描述而显而易见，或者通过实施本发明而获知。本发明的目的和优点将通过在所附权利要求书特别指出的手段和组合而获得。
发明概述本发明的方法包含与经济重要性状相关的基因座遗传连锁的核酸标记的应用。所述标记用于对在育种程序中使用的和/或已经发展出的动物的遗传物质进行遗传定位，使得可以进行标记辅助选择以鉴别性状或将性状移至原种生殖质中。本发明涉及基因组区域中与之相关或连锁不平衡或另外遗传连锁的、可用于预知动物的表型性状的遗传变异的揭示。根据本发明的实施方案，对第17号染色体的特定区域已经精细定位并示出是各种性状的数量性状基因座。也就是说已经鉴别了第17号染色体的70-108cM区域是生长性状的数量性状基因座。在这个区域内已经鉴别了与肉品质和肥胖度(fatness)相关的更特异的区域。另外，位于这个区域内的一些基因示出是多态性的，并因此用作这些QTL的遗传标记。这包括PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D。在这个意义上这些基因在物种和动物之中是保守的，并期望本发明揭示的不同的等位基因也与这些基因在其它经济或产肉动物如牛、羊、鸡等中的可变性相关。
本发明的一个实施方案是一种鉴别与肉品质性状相关的等位基因的方法，所述方法包括从动物获得组织或体液样品；扩增所述样品中存在的包含与一个核苷酸序列连锁的第17号染色体的70-107cM区域的DNA，所述核苷酸序列编码PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1，DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D；检测所述核苷酸序列的多态性变体的存在，其中所述变体与肉品质中的表型变化相关。
本发明的另一个实施方案是一种确定遗传标记的方法，所述遗传标记可基于动物的肉品质或生长性状而用于鉴别和选择动物，所述方法包括从所述动物获得组织或体液样品，所述样品包含DNA；扩增所述样品的第17号染色体的区域中存在的DNA，所述区域包含编码可表达的来自第一种动物的所述样品中存在的PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D的一个核苷酸序列；将所述样品与参考样品或序列对比以确定所述样品中存在的多态性等位基因的存在；将所述动物中生长或肉品质的可变性与所述多态性等位基因联系起来；由此所述等位基因在给定的类群、种群或物种中可用作遗传标记。
本发明的另一个实施方案是一种鉴别动物的生长或肉品质性状倾向的方法，所述方法包括从所述动物中获得核酸样品，并确定一种等位基因的存在，所述等位基因特征在于所述样品中存在的PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D编码序列的多态性，或者与之连锁不平衡的多态性，所述基因型是或已被示出与指示生长或肉品质的性状显著相关的基因型。
另外的实施方案在“发明详述”及“实施例”中阐述。
附图简述
图1显示了作为SSC 17上与肉品质相关的QTL的证据的F-比率(F-ratio.)曲线。X轴表示连锁图上的相对位置。Y轴表示F比率。X轴上的箭头表示标记存在的位置。图中示出了感兴趣的性状AVGP＝平均糖酵解潜力；AVLAC＝平均乳酸盐(Average Lactate)；COLOR＝肉色；LABLM＝腰肌Minolta lab值(Lab Loin Minolta)；LABLH＝腰肌Hunter lab值(Lab Loin Hunter)。
图2A描述了猪Cathepsin Z(CTSZ)基因的一个330bp片段的PCR-RFLP，示出了期望的酶AlwNI消化模式。
图2B描述了猪GNAS基因的一个321bp片段的PCR-RFLP，示出了期望的酶BbsI消化模式。
图2C描述了猪MC3R基因的PCR-RFLP，示出了期望的酶MnlI消化模式。
图3示出了猪中CTSZ的共有序列。
图4示出了猪中GNAS的共有序列。
图5示出了猪中MC3R的共有序列。
图6提供了定位在第17号染色体的基因图。
图7示出了猪中PKIG的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图8示出了猪中MMP9的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图9示出了猪中PTPN1的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图10示出了猪中ATP9A的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图11示出了猪中CYP24A1的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图12示出了猪中DOK5的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图13示出了猪中AURKA的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图14示出了猪中SPO11的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图15示出了猪中RAE1的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图16示出了猪中PCK1的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图17示出了猪中RAB22A的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图18示出了猪中PPP1R3D的共有序列。粗体字表示的是单核苷酸多态性的位置。
图19示出根据本发明对第17号染色体的QTL的精细定位。
优选的实施方案详述与重要的基因紧密连锁的遗传标记可用于间接选择有利的等位基因，这比直接的表型选择更高效(Lande and Thompson 1990)。因此，对动物育种者及将动物作为商品进行生产和销售的农场主均特别重要的是通过遗传定位鉴别各种经济学有利的性状的数量性状基因座(QTL)，所述有利性状如生长、肉品质和肥胖度。了解与这些性状相关的QTL，则动物育种者可以更好地繁殖具有基因型和表型特性的动物。为了实现这个目的及根据本发明，如本文具体表达及广泛描述的，本发明揭示了另外的染色体区域和基因型，这提供了一种对动物进行遗传分型并筛选动物以确定那些更可能具有有利的生长和低脂肪沉积及肉品质性状的动物，或者选择以排除具有提示低有利生长性状、较肥胖及较差肉品质性状和/或育种效率的等位基因的动物。如本文所述，对肉品质的作用可以通过使用特殊的鉴别标记如pH或滴水损失(drip loss)而表明，但本发明非如此限制。如本文所用，生长或肉品质的表型性状任何特殊标记的使用应该认为是包括与所揭示的与关于肉品质或生长或肥胖度的等位基因相关的变异性的所有标记。如本文所用，“有利的生长、肥胖度或肉品质性状”是指生长或肉品质的任一个可测定标记在给定群体的平均值基础上显著改良(增加或降低)，以便这个信息可用于育种中以达到这些性状最佳化的均一种群。根据希望的特性，这可以包括一些性状增加或者其它性状降低。对一些经济学性状实例的综述，可以参考如下文献Sosnicki，A.A.，E.R.Wilson，E.B.Sheiss，A.deVries，1998″Is there a costeffective way to produce high quality pork？″，Reciprocal MeatConference Proceedings，Vol.51。
分析这些性状的方法通常包括如下步骤1)从动物获得生物学样品；2)分析在1)中获得的基因组DNA或蛋白质以确定存在哪个或哪些等位基因。也可以使用允许在一个选择或鉴别方案中组合一系列连锁的多态性以使每一个这些标记的益处最大化的单元型数据，本发明包括这种使用。
由于一些多态性可包括各自的蛋白质的氨基酸组成的变化或者是存在这种变化的指征，因此分析方法可甚至包含确定本发明的主要效应基因的蛋白质的氨基酸组成。这种分型或纯化和分析的方法典型地包括通过包括使用抗体的荧光标记分离蛋白质、分离和纯化所述蛋白质(即通过反向HPLC系统)、及使用自动蛋白质测序仪鉴别存在的氨基酸序列。这种分析的方案是本领域已知的标准方案，见Ausubelet al.(eds.)，Short Protocols in Molecular Biology，Fourth ed.John Wileyand Sons 1999所揭示。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于鉴别生长、肥胖度和肉品质的遗传标记的方法。一旦鉴别了主要效应基因，则期望在同一基因、等位基因或与之呈有用的连锁不平衡的序列中存在的其它变异可用于鉴别对这些性状相似的效应而不用过分的实验。一旦揭示了主要效应基因，其它这种遗传变异的鉴别则强于本领域技术人员熟知的常规筛选和参数优化，这包含在本发明范围内。
如下术语用于描述两或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系(a)“参考序列”，(b)“对比窗”，(c)“序列相同性”，(d)“序列相同性百分比”，及(e)“实质相同性(substantial identity)”。
(a)如本文所用，“参考序列”是指用作序列对比基础的指定序列。参考序列可以是一指定序列的部分或全部，例如全长cDNA或基因序列的节段或者完整的cDNA或基因序列。
(b)如本文所用，“对比窗”包括参考多核苷酸序列的一个连续的及指定的节段，其中所述多核苷酸序列可以与参考序列对比，并且对于两个序列的最佳对比而言，其中对比窗中所述多核苷酸序列的一部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)。通常地，对比窗长度为至少20个连续的核苷酸，优选地可以是30、40、50、100个核苷酸或更长。
本领域技术人员理解为了避免由于所述多核苷酸序列中存在缺口而与参考序列高度相似，典型地导入缺口罚分(gap penalty)并从匹配数中减去。
本领域熟知序列对比的方法。序列的最佳对比可以通过如下方法进行Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源算法；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源对比算法；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.852444(1988)的查询相似性的方法；这些算法的计算机执行程序，包括但不限于Intelligenetics，Mountain View，California的PC/Gene程序中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；Higgins and Sharp，Gene73237-244(1988)充分描述了CLUSTAL程序；Higgins and Sharp，CABIOS 5151-153(1989)；Corpet，et al.，Nucleic Acids Research1610881-90(1988)；Huang，et al.，Computer Applications in theBiosciences 8155-65(1992)，及Pearson，et al.，Methods in MolecularBiology 24307-331(1994)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN、用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX、用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP、用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN、及用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。见Current Protocols in Molecular Biology，Chapter19，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork(1995)所述。
除非另外指出，则本发明提供的序列相同性/相似性数值是指使用BLAST 2.0程序组应用默认参数获得的(Altschul et al.，NucleicAcids Res.253389-3402(1997))。进行BLAST分析的软件可公开获得，例如通过国立生物技术信息中心网(http://www.hcbi.nlm.nih.gov/)获得。
这个算法包括首先通过鉴别查询序列中长度W的短语(shortword)而鉴别高分值的序列对(HSP)，当其与数据库序列中相同长度的一个字对比时匹配或满足一些正值的阈值T。T是指邻近字分值阈值(Altschul et al.，见上)。这些初始的邻近字标的(hit)作为开始搜索的根据以发现含有其的更长的HSP。然后将字标的沿着每个序列双向延伸，只要可以增加累积的对比分值。累积的分值对于核苷酸序列使用参数M(一对匹配的残基的奖励分值；总是＞0)和N(错配的残基的处罚分值；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，使用分值矩阵计算累积分值。字标的在每个方向的延伸当出现如下情况时停止累积对比分值从其达到的最大值下降数量X；累积分值由于一或多个负值残基对比而为0或之下；或者达到每个序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了对比的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列而言)使用默认参数，字长(W)为11，期望值(E)为10，截断值为100，M＝5，N＝-4，，双链对比。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默认参数，字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62数值矩阵(见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)。
除了计算序列相同性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(见例如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生的匹配的概率指征。
BLAST搜索假设蛋白质可以建模为随机序列。然而，许多实际的蛋白质包含非随机序列区域，其可以是同聚序列段，短期重复或者一或多个氨基酸富集的区域。这种低复杂性区域可以在不相关的蛋白质之间排列匹配，即使所述蛋白质的其它区域完全不同。可以应用许多低复杂性滤过程序以减少这种低复杂性对比。例如，可以单独或组合使用SEG(Wooten and Federhen，Comput.Chem.，17149-163(1993))和XNU(Claverie and States，Comput.Chem.，17191-201(1993))低复杂性过滤。
(c)如本文所用，两个核酸或多肽序列的“序列相同性”或“相同性”是指两个序列在指定的对比窗中最大一致性对比时相同的残基。当关于蛋白质使用序列相同性百分比时，应意识到不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基用具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的另外氨基酸残基取代并因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，序列相同性百分比可以向上调节以校正取代的保守性质。由于这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。本领域技术人员熟知进行这种调节的方法。典型地包括赋予保守取代一个部分错配而不是全部错配得分，从而增加了序列相同性百分比。因此，例如在相同的氨基酸得分为1及非保守取代得分为0的情况中，保守取代的分值为0-1。保守取代的得分例如根据Meyers and Miller，Computer Applic.Biol.Sci.，411-17(1988)所述例如PC/GENE程序执行(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)的算法计算。
(d)如本文所用，“序列相同性百分比”是指通过对比窗对比两个最佳排列的序列确定的数值，其中对比窗中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包含添加和缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)。百分比是通过如下方式计算确定在这两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以对比窗中总位置数再乘以100，产生序列相同性百分比。
(e)术语多核苷酸序列的“实质相同性”是指使用所述对比程序之一使用标准参数对比，一个多核苷酸包含与参考序列有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、最优选地至少95％序列相同性的序列。技术人员意识到这些数值可以被适当调节以考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读框位置等确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。对于这些目的，氨基酸序列的实质相同性一般是指至少60％、或优选地至少70％、80％、90％及最优选地至少95％的序列相同性。
这些程序和算法可以确定靶基因中特殊多态性与本发明揭示的那些多态性的相似性。期望这种多态性将存在于其它动物中，并且其在除了本发明揭示的之外的其它动物中的应用只包括使用本发明教导的参数的常规优化而已。
也可以建立另外的DNA标记的特异性等位基因与已知与特殊基因(例如本发明论述的基因)相关的DNA标记的等位基因之间的联系，所述特殊基因先前已经示出与特殊的性状相关。因此，在目前情况中，利用所述基因的一个或两个，至少就目前而言，可以通过选择另外的染色体标记的特异性等位基因选择相关标记的某些等位基因而选择很可能产生希望性状的动物，或者可以间接排除很可能产生不太希望性状的动物。如本文所用，术语“遗传标记”应不仅包括通过任何方式分析与多态性相关的蛋白质变化所揭示的核苷酸多态性，还包括它们在相同的染色体区域内连锁的遗传标记、微卫星的应用、或者甚至包括分析由标记表明的引起蛋白质变化的其它方式及其影响动物性状的应用。
如本文所用，通常特殊多态性的名称是根据特殊的限制酶命名的。这不是意味着可以鉴别位点的方式只有利用该限制酶。有许多技术人员可获得的数据库和资源可以鉴别可用于鉴别特殊多态性的其它限制酶，例如http://darwin.bio.geneseo.edu基于分析序列和待鉴别的多态性可提供限制酶。事实上，如本发明所揭示的，可以有许多不同方法用多种方式鉴别特殊多态性或者等位基因，其甚至可能不包括限制酶，但是可以检测同样的基因或蛋白质变化了的形式。
本发明包括揭示的序列以及其所有保守修饰的变体。本文所用术语PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D是指包括这些保守修饰的变体。术语“保守修饰的变体”是用于指氨基酸和核酸序列。关于特殊的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或保守修饰的氨基酸序列变体的那些核酸。由于遗传密码的简并，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸。因此，在丙氨酸由一个密码子指定的任何位置，所述密码子可以改变为任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，是指一种保守修饰的变异。编码多肽的每个核酸序列，也称为遗传密码，描述了核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将意识到核酸中的每个密码子(除了AUG及UGG之外，AUG通常只是甲硫氨酸的密码子，UGG只是色氨酸的密码子)均可以修饰以产生功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每个沉默变化在每个所述的多肽序列中是无疑的，这包含在本发明范围内。
对于氨基酸序列，技术人员将意识到编码序列中改变、添加或缺失一个单一氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述变化导致氨基酸用化学相似的氨基酸取代。因此，可以改变选自1-15之间任何一个整数的氨基酸残基。例如可以产生1、2、3、4、5、7或10种变化。保守修饰的变体典型地提供了与从中其衍生的未修饰的多肽序列相似的生物学活性。例如，底物特异性、酶活性或者配体/受体结合力通常是天然蛋白质与其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本领域技术人员熟知提供功能相似的氨基酸保守取代表。
被编码的氨基酸的保守取代包括例如属于如下一组的氨基酸(1)非极性氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu和Ile)；(2)极性中性氨基酸(Cys、Met、Ser、Thr、Asn和Gln)；(3)极性酸性氨基酸(Asp和Glu)；(4)极性碱性氨基酸(Lys、Arg和His)；及(5)芳族氨基酸(Phe、Trp、Tyr和His)。
本领域技术人员会意识到一些取代不改变多肽的活性至多肽的特性或性质实质改变的程度。“保守取代”是其中一个氨基酸由具有相似性质的另一个氨基酸取代，由此肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质实质未改变。可以在本发明的多核苷酸和多肽结构中进行修饰，并仍获得编码具有希望特性的多肽变体或衍生物的功能分子，例如具有肉品质/生长样特性。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等价物或变体或一部分时，本领域技术人员将根据表1所示典型地改变编码DNA序列的一或多个密码子(见下文)。例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以取代其它氨基酸而不明显丧失活性。由于这是说明蛋白质生物学功能活性的蛋白质的相互作用能力和性质，因此在蛋白质序列及其DNA编码序列中可进行某些氨基酸序列取代，仍获得同样性质的蛋白质。因此预期在揭示的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中可以产生各种改变，而不明显丧失其生物学用途和活性。简并密码子是指一个不同的三个字母的密码子用于指定相同的氨基酸。例如，本领域熟知如下RNA密码子(及因此的相应DNA密码子，T取代U)可以互换使用以编码每个特异的氨基酸表1
本发明的实施方案涉及动物的经济学有利性状的遗传标记。所述标记代表与生长和/或肉品质明显相关的多态性变化或等位基因，并因此提供了一种筛选动物的方法以确定更可能产生希望的性状的那些动物。如本文所用，术语“标记”包括能检测的多态性变体，其可以与数量性状基因座连锁并因此用于分析QTL中的特殊性状。
因此，本发明涉及遗传标记和在特殊的品种、品系、种群和类群的动物中鉴别那些标记的方法，从而所述动物更可能产生希望的肉品质或生长或肥胖度性状。
第17号染色体上肉品质、肥胖度和生长性状的遗传关联本发明的遗传分析揭示了第17号染色体上肉品质、肥胖度和生长性状的遗传关联。所述关联鉴别了第17号染色体是与动物的有利肉品质、肥胖度和生长性状相关的一或多个染色体区域/DNA节段或基因的位置及重要的作用大小的位置。特别地，第17号染色体经鉴别含有与有利的肉品质、肥胖度和生长性状相关的至少一个DNA节段或基因。
发现所揭示的遗传标记/多态性与肉品质、肥胖度和生长性状相关表明了在第17号染色体上有一或多个肉品质和生长性状染色体区域/DNA节段或肉品质和生长性状基因，其直接导致或使得生长、肥胖度或肉品质的任一个可测定的指征均在给定群体的平均值上显著改良。
第17号染色体上一或多个生长、肥胖度或肉品质相关的基因的发现(通过第17号染色体与生长、肥胖度或肉品质显著相关的而表明)提供了本发明所述的遗传分析方法的基础，所述遗传分析方法包括鉴别与肉品质、肥胖度和生长性状相关的等位基因的方法；确定可使用的并基于动物的肉品质或生长性状而选择动物的遗传标记的方法；鉴别动物的生长、肥胖度或肉品质性状倾向的方法。
与生长、肥胖度或肉品质性状相关的遗传标记本发明提供了与肉生长或肉品质性状相关的遗传标记。所述标记位于猪第17号染色体上。在关于在PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D中发现的遗传标记的特殊的实施方案中，这些遗传标记针对本发明揭示的性状定位在SSC17QTL峰的下面。所述标记可以通过本发明所述或本领域技术人员已知的连锁不平衡或者关联评估方法鉴别，并且当通过这种评估方法测试时提供了表示与一个染色体区域/DNA节段或基因连锁不平衡的分值或结果，或表示与生长、肥胖度或肉品质相关的分值或结果。所述遗传标记作为与生长或肉品质相关的单独的标记和/或组合的标记(如单元型)与生长或肉品质相关。
猪第17号染色体上的遗传标记遗传标记是在染色体中有可鉴别的位置的DNA节段。遗传标记可在许多遗传学研究中使用，如定位感兴趣的DNA序列的染色体位置或基因座，确定一个对象是否倾向于或具有一特殊的性状。
由于在染色体上相对紧密的DNA序列趋向于一起遗传，因此通过种群的传代而追踪一个遗传标记并将其遗传特征与感兴趣的另一个DNA序列的遗传特征对比，可提供用于确定感兴趣的DNA序列在染色体上的相对位置的信息。特别用于这种遗传学研究的遗传标记是多态性。这种标记也可以具有足够水平的杂合性以允许随机选择的动物有合理的概率是杂合的。
特殊DNA序列例如基因的变体形式的发生是指多态性。其中发生变异的DNA节段的区域可以是指多态性区域或位点。多态性区域可以是一个单一核苷酸(单核苷酸多态性或SNP)，其相同性例如在不同的等位基因中不同，或者可以是两或多个核苷酸长度。例如，DNA序列的变体形式可以通过插入或缺失一或多个核苷酸、插入一个复制的序列、翻转一个序列或者将一个单一核苷酸转变为不同的核苷酸而不同。每个动物可携带两种不同形式的特异性序列或者两种相同形式的序列。
特异的DNA序列的多态性形式之间的差异可以多种方式检测。例如，如果多态性如此则其产生或缺失一个限制酶位点，这种差异可以通过使用识别特异DNA序列的限制酶追踪。限制酶在其特异识别的序列中的位点切割(消化)DNA，产生DNA片段的集合。当DNA序列中存在将由限制酶识别的序列改变为不识别的序列的一个改变时，通过限制酶消化该区域产生的DNA片段将是不同大小的。因此给定区域的各种可能的片段的大小依赖于该区域中的精确DNA序列。产生的片段中的变异称为“限制片段长度多态性(RFLP)”。反映变体DNA序列的不同大小的片段可以通过将消化的DNA根据其大小在琼脂糖凝胶上分离，并通过退火为标记的(例如放射性或另外标记的)DNA“探针”的各个片段进行显影而观测。
PCR-RFLP广泛而言是一种包括获得所研究的DNA、扩增DNA、用限制性核酸内切酶消化DNA、分离所得片段、并检测各种基因的片段的技术。本文揭示的PCR-RFLP是检测多态性的优选的方法。然而，由于使用RFLP分析最终依赖于多态性和核酸分子上的DNA限制位点，也可以使用其它的检测多态性的方法，并包含在本发明范围内。这些方法包括分析多态性基因产物及通过检测基因产物中所得差异而检测多态性。
SNP标记也可以用于精细定位和关联分析中，以及用于连锁分析中(见例如Kruglyak(1997)Nature Genetics 1721-24)。尽管SNP只有有限的信息内容，但SNP组合(大约每100-300个碱基单独发生一次)可产生信息丰富的单元型。可以利用SNP数据库。确定SNP的分析系统包括标记的扩增的DNA与之杂交的合成核苷酸阵列(见例如Lipshutz et al.(1999)Nature Genet.212-24)、单一碱基引物扩展方法(Pastinen et al.(1997)Genome Res.7606-614)、对标记珠的质谱分析、及溶液分析，其中等位基因特异性寡核苷酸在SNP等位基因的位置被切割或结合，产生一种激活的荧光报道系统(见例如Landegren et al.(1998)Genome Res.8769-776)。
第17号染色体猪第17号染色体是充分保守的(与人染色体20和小鼠染色体2同源)。
遗传关联当两个基因座非常接近时，它们之间的重组非常少有，并且两个相邻基因座重组的速度可以如此慢以致于除非经过许多传代而无法观察。所得等位基因关联通常是指连锁不平衡。连锁不平衡可以指在一条染色体上一起观测到的在两或多个基因座的特异等位基因比预期的在种群中的发生次数更多。连锁不平衡的结果是携带产生性状的等位基因的单元型中存在的所有其它等位基因的发生次数与性状阴性或随机对照种群相比也增加(正象产生性状的等位基因在受影响的或性状阳性的种群中增加一样)。因此，性状和与产生性状的等位基因连锁不平衡中的任何等位基因之间的关联足以提示在染色体的特定区域中存在性状相关的DNA节段。基于此，关联研究用于本发明揭示的鉴别与动物肉品质和生长性状相关的等位基因定位和发现方法中。
标记基因座必须与性状基因座紧密连锁以使得基因座之间存在连锁不平衡。特别地，基因座必须非常接近以具有可用于关联研究的适当的连锁不平衡。关联研究依赖于在经过祖先的许多传代后相邻DNA变体的保持，因此理论上性状关联区域在杂交繁殖随机交配的种群中较小。
遗传关联分析对检测性状的遗传学贡献的能力比连锁研究更高。连锁分析可受到缺少排除作用不大的区域的能力或缺少检测作用不大的基因座的能力的限制。关联测试能检测具有较小效应的基因座(Risch andMerikangas(1996)Science 2731516-1517)，这个效应通过连锁分析检测不到。
关联研究当用于揭示与表型性状相关的基因中遗传变异时，其目标是在种群水平鉴别与表型相关的特殊遗传变体。在种群水平的关联可用于鉴别基因或DNA节段的方法中，因为其提供了一种指征，即一个特殊标记是性状的功能变体(即直接参与产生特殊性状的多态性)或者与染色体上的性状基因非常接近。当针对与表型性状的关联分析的标记是一种功能变体时，则关联是基因型对表型结果的直接作用结果。当针对关联进行分析的标记是一种匿名标记时，则关联的发生是所述标记与功能变体之间的连锁不平衡的结果。
有许多典型用于评估遗传关联作为连锁不平衡指征的方法，包括不相关的动物的个案对照(case-control)研究及使用基于家族对照的方法。尽管个案对照设计相对简便，但其主要倾向于鉴别DNA变体，证实其与性状假相关(即无连锁相关性)。假相关可以是由于被研究的种群结构而不是连锁不平衡所致。然而这种假相关的等位基因变体的连锁分析不能检测显著连锁的迹象，因为没有变体的家族隔离。因此，对在个案对照研究中鉴别的在标记等位基因与肉品质、肥胖度和生长性状之间推定的关联应在作出可能的连锁不平衡结论之前测试标记与疾病之间的连锁迹象。避免标准个案对照研究中一些问题的关联测试利用基于家族的对照，其中不被遗传影响子代的亲代等位基因或单元型用作对照。
与遗传连锁(基因座的一种性质)相反，遗传关联是等位基因的一种性质。关联分析包括确定单一的特异等位基因与性状之间在种群而不是仅在单独的类群中的关联。因此，通过关联研究发现与肉品质或生长或肥胖度相关的等位基因连锁不平衡中的特殊等位基因可构成在任何动物中确定性状诱因或者确定性状发生的方法的基础。这些方法不包含确定等位基因的期相(phase)，并因此不受在所述方法中可以筛选的动物的限制。
鉴别与肉品质、生长或肥胖度性状相关的遗传标记的方法本发明还提供了确定遗传标记的方法，所述遗传标记基于动物的肉品质或生长性状可用于鉴别和选择动物。所述方法包括测试第17号染色体上与肉品质或生长性状相关的多态性标记的步骤。所述测试可包括使用本发明所述的和/或本领域技术人员已知的方法确定动物的DNA的基因型，并可在给定的类群、种群或物种中针对多态性标记同样用作遗传标记，及包括分析与肉品质或生长性状相关的基因分型数据。
候选基因方法候选基因方法(candidate gene approach)典型地考虑到疾病的生物学进程的知识作为选择编码预期参与生物学进程的蛋白质的基因的基础。例如，造成血压异常的候选基因可以是参与肾素-血管紧张肽系统的蛋白质和酶。通过对候选基因区域中的标记进行连锁和/或关联研究可以从遗传学角度评估候选基因是可能的疾病基因。
鉴别候选肉品质、肥胖度和/或生长基因的方法鉴别候选肉品质、肥胖度和/或生长基因的方法包括选择第17号染色体上一个基因的步骤，该基因是或编码具有与一或多种肉品质、肥胖度或生长现象相关的一或多种性质的产物。图6提供了位于第17号染色体上的许多基因的列表。本领域也已知已经定位在第17号染色体上的另外的基因。因此，基于例如基因或其产物的功能和/或其在肉品质和生长中的呈现或改变的知识可以评估第17号染色体上的基因是可能的候选基因。
与肉品质、肥胖度和生长中的现象相关的性质在本发明提供的鉴别候选的肉品质和生长基因的方法中，选择第17号染色体上的基因，在特别的实施方案中，选择位于第17号染色体的特定区域上的基因，其是或编码具有与肉品质和生长中的一或多种现象相关的性质的产物。该性质可以是基因或基因产物的任何方面或特征，包括但不限于其物理组分(例如核酸、氨基酸、肽和蛋白质)、功能属性(例如酶的能力如酶催化剂、抑制功能如酶抑制、抗原性质、及结合能力如受体或配体结合)、细胞位置、表达模式(例如在相关的细胞和组织中表达)和/或与其它组分的相互作用。
在鉴别候选的肉品质、肥胖度和生长基因的方法中选择的基因或基因产物的性质是与肉品质和生长中的一或多种现象相关的那些性质。这种在本领域已经广泛描述并为技术人员所已知的现象有很多，包括形态学、结构、生物学和生物化学现象。如本发明所述，对肉品质的效应可以通过使用特定的鉴别物如pH或滴水损失而论证。
本发明的候选基因一般地，在使用多态性标记的关联分析鉴别性状基因的候选基因方法中，在候选性状基因周围或其中的一或几个标记，特别是具有假定功能重要性的那些标记，在几百个个案和对照动物中被测定了基因型。
关于候选基因功能的相关等位基因的特异特征通常提供了对相关等位基因与性状之间关系(因果关系或连锁不平衡)的进一步洞察。如果迹象表明候选基因内的相关等位基因不是最可能的产生性状的等位基因但与真正的产生性状的等位基因连锁不平衡，则产生性状的等位基因可以通过对相关的标记邻近进行测序并用经重复方式揭示的多态性进行进一步关联研究而发现。
本发明人将候选基因方法部分用于猪的肉品质、肥胖度和生长性状中。迄今为止已知控制猪的肉品质和生长速度的基因的数目很少，但其各个作用在大多数情况中很大。通常地，这是由于观测到的多态性或突变对动物的功能的作用很大所致。从似乎是良好的候选物的这些或其它基因中，本发明人选择本发明揭示的其候选基因。当候选基因在其生物学或生理学途径中发挥似是而非的作用时，候选基因分析明确提供了一种捷径来鉴别与特殊的表型性状相关的基因和基因多态性。对人或小鼠性状的突变效应的基本原理提示了同样的基因在家畜相应性状中的作用。
根据本发明，PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ、和PPP1R3D基因均已经全部鉴别是主要效应基因，并且这些基因的可变性已经示出与动物特别是猪的肉类生产的表型性状或生长性状相关。因此，可发展一些筛选方法用于针对可预告表型变异的这些基因的内在或与其连锁的变异。
寡核苷酸用于基因组DNA的PCR扩增以测序，之后针对单核苷酸多态性(SNP)检测和基因型确定来设计特异性寡核苷酸。PCR条件如实施例章节所例证。
多态性的检测通过限制片段长度多态性检测方法而进行。确定PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D的基因型是基于在PCR扩增的DNA片段(PCR-RFLP)中多态性位点的限制位点的存在与否而进行。基因型根据电泳凝胶上解离的产物而鉴别。
在SEQ ID NO所示的猪CTSZ基因的外显子2上检测到一个突变。RFLP检测到引起氨基酸改变的一个A/G取代(赖氨酸改变为精氨酸)。用Alw NI消化扩增的CTSZ片段产生图2A所示的RFLP。纯合的等位基因1基因型产生一个330碱基对(bp)的限制片段，而纯合的等位基因2基因型产生260和206bp的限制片段。杂合的12基因型示出所有三个片段330、260和70bp。
在SEQ ID NO所示GNAS的内含子7上检测到一个T/C取代。RFLP在外显子1的编码区中检测到一个T/C取代，但这不引起氨基酸改变。用BbsI消化产生图2B所示的RFLP。纯合的等位基因1基因型产生一个321碱基对(bp)的限制片段，而纯合的等位基因2基因型产生274和47bp的限制片段。杂合的12基因型示出所有三个片段321、274、和47bp。
在MC3R中的外显子1的编码区中检测到一个T/C取代，但这种突变不引起氨基酸改变。表18示出了鉴别的各种其它多态性。
对于上述性状，PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ、和PPP1R3D定位在SSC17QTL峰的下面。这些QTL峰包括SSC17上大约从80至100cM的区域。原始图谱上基因的位置如下PKIG定位在大约66.8cM、PTPN1定位在大约77.4cM、MC3R定位在大约88.5cM、GNAS定位在大约96.2cM、CTSZ定位在大约97.2cM、PPP1R3D定位在大约101.3cM(图1)。这个图谱在本发明中有更具体的详述，见图19所示。
可以使用鉴别这些多态性存在与否的任何方法，包括例如单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析、碱基切除序列扫描(base excision sequence scanning，BESS)、RFLP分析、异源双链体分析、变性梯度凝胶电泳及温度梯度电泳、等位基因PCR、连接酶链反应直接测序、小型测序(mini sequencing)、核酸杂交、主要效应基因或等位基因的微阵列类型检测，或者其它同样连锁的序列。本发明还包括检测在存在这种多态性的情况中发生的蛋白质构象或序列改变。多态性也许是也许不是原因性突变，但是是这种改变存在的指征，技术人员可以针对表型差异的遗传或蛋白质基础进行分析。基于这些标记的检测，对于一给定种群可以计算等位基因发生次数以确定动物组间等位基因发生次数的差异，即使用定量确定基因型方法进行。这提供了针对相关性状选择特异种群的能力。
通常地，用作本发明的遗传标记的多态性在本领域已知的任何方法中均发现用途，以表明基因型与表型之间的统计学显著关联。
在一个实施方案中，本发明包含一种鉴别与肉品质性状相关单独等位基因的方法。本发明还包含确定基于动物的肉品质、肥胖度或生长性状而可用于鉴别和选择动物的遗传区域或标记的方法。本发明的另一个实施方案提供了一种鉴别动物的生长、肥胖度或肉品质性状倾向的方法。
本发明还提供了检测基因型与表型之间关联的方法，包括如下步骤a)根据本发明的确定基因型的方法对性状阳性群中的至少一个候选基因相关标记确定基因型；b)根据本发明的确定基因型的方法对对照群中的候选基因相关标记确定基因型；c)确定所述基因型与所述表型之间是否存在统计学显著关联。另外，本发明的检测基因型与表型之间关联的方法涵盖了具有在这个揭示或如下单独或组合说明所述的任何进一步限制的方法。优选地，所述候选基因相关的标记存在于SEQ ID NO_至_的一或多个中，更优选地选自Alw NI、Bbs I、Dde I、Msp I、Nae I、Afl III、Alw NI、Bse RI、Taa I、Mse I、Bst UI、Bcc I、Taq I、Nae I和Mnl I。所述确定基因型的步骤a)和b)均是单独对得自所述种群中的每头猪的生物学样品或其子样品进行的。优选地，表型是包含动物的生长、肥胖度和肉品质特性的一种性状。
本发明涵盖了可用于进行关联研究的另外的方法基因组范围的关联研究、候选区域关联研究和候选基因关联研究。在优选的实施方案中，本发明的标记用于进行候选基因关联研究。另外，本发明的标记可以掺入猪基因组的任何遗传标记图中以进行基因组范围的关联研究。本领域技术人员熟知产生标记的高密度图谱的方法。本发明的标记可进一步掺入基因组的特异候选区域的任何图谱中(例如特异染色体或特异染色体节段)。
关联研究是颇有价值的，因为其可以分析偶发的或多因素的性状。另外，关联研究代表了一种精细尺度上定位的有力方法，与连锁研究相比能更精细地定位产生性状的等位基因。一旦鉴别了感兴趣的染色体节段，则在感兴趣的区域中候选基因如本发明的候选基因的存在可提供一个鉴别产生性状的等位基因的捷径。用作本发明的遗传标记的多态性可以用于论证候选基因与性状相关联。这种用途特别涵盖在本发明和权利要求中。
关联分析使用衍生自携带候选基因的标记进行关联研究的一般策略是对两组动物(个案对照群)进行分析，以测量并统计学对比这两组中本发明的标记的等位基因发生次数。
如果与性状的统计学显著关联是针对至少一个或多个分析的标记鉴别的，则可以假定相关的等位基因是产生该性状的直接原因(相关的等位基因是产生性状的等位基因)，或者更可能地相关的等位基因与产生性状的等位基因连锁不平衡。相关的等位基因关于候选基因功能方面的特性通常提供了对相关的等位基因与性状之间关系(因果关系或连锁不平衡)的进一步洞察。如果迹象表明候选基因内相关的等位基因很可能不是产生性状的基因但与真正的产生性状的等位基因连锁不平衡，则产生性状的等位基因可以通过对相关的标记的邻近进行测序而发现。
关联研究通常在两个连续步骤中进行。在第一阶段，在性状阳性和性状阴性群中确定来自候选基因的标记数减少的发生次数。在分析的第二阶段，与给定性状相关的遗传基因座的位置使用相关区域的较高密度的标记进一步确定。然而，如果所研究的候选基因长度相对较短，则一个阶段足以建立显著的关联。
关联测试确定表型与基因型(在这种情况中是标记的等位基因或者由这种等位基因组成的单元型)之间相关性的统计学意义的方法可以通过本领域已知的任何统计学测试确定并具有所需要的具有统计学意义的任何公认的阈值。本领域熟练技术人员熟知特殊方法和意义阈值的应用。
测试关联性是以一种方式进行的，通过确定标记等位基因在个案和对照群中的发生次数并将这些发生次数与统计学测试对比，以确定发生次数中的显著差异，这种差异表示性状与所研究的标记等位基因之间的相关性。相似地，单元型分析通过估计在个案和对照群中给定系列标记的所有可能的单元型的发生次数，并将这些发生次数与统计学测试对比以确定在所研究的单元型和表型(性状)之间是否具有统计学显著相关性。可以使用用于测试基因型和表型之间统计学显著关联的任何统计学工具，并且这种工具有很多。优选地，所应用的统计学测试是具有一个自由度的x方检验。计算P值(P值是与观测值同样或大于其的统计量偶然发生的概率)。其它方法包括线性模型及方差技术(variance technique)分析。
如下是可用于分析本发明多态性的技术一般综述。
在本发明中，遗传物质的样品得自动物。样品可以得自血液、组织、精液等。通常地，外周血细胞用作来源，遗传物质是DNA。获得足够量的细胞以提供足够量的DNA进行分析。这个量为本领域技术人员所已知并可易于确定。所述DNA通过本领域技术人员已知的技术分离自血细胞。
核酸的分离和扩增基因组DNA样品分离自任何便利的来源，包括唾液、口腔细胞、毛根、血液、脐带血、羊水、组织液、腹水、绒毛膜绒毛，及具有完整的间期核或中期细胞的任何其他合适的细胞或组织样品。细胞可以得自固体组织如来自新鲜或保藏的器官或者得自组织样品或活检组织。样品可以含有与生物血材料非天然混和的化合物，如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、定色剂、营养素、抗生素，等等。
从这些各种来源中分离基因组DNA的方法见例如Kirby，DNAFingerprinting，An Introduction，W.H.Freeman & Co.New York(1992)所述。基因组DNA也可以分离自培养的原代或传代细胞培养物，或者分离自衍生自任何前述组织样品的转化细胞系。
也可以使用动物RNA样品。RNA可以分离自表达本发明的主要效应基因的组织，如Sambrook等如前所述。RNA可以是总细胞RNA、mRNA、聚A+RNA，或者这些RNA的任何组合。为获得最佳结果，RNA是纯化的，但也可以是未纯化的胞质RNA。RNA可以逆转录以形成DNA，其然后用作扩增模板，由此PCR间接扩增RNA转录体的一特定群体。见例如Sambrook(如前)，Kawasaki et al.，Chapter 8in PCR Technology，(1992)如前，及Berg et al.，Hum.Genet.85655-658(1990)所述。
PCR扩增最常用的扩增方式是聚合酶链反应(PCR)，如在此均并入参考的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,965,188所述。如果使用PCR扩增血细胞中的靶区域，则应将肝素化的全血吸入密封的真空管中，与其它样品分开保持并用干净的手套持握。为获得最佳结果，血液应在收集后立即处理；如果不可能立即处理，则应在密封容器中在4℃保持直至使用。对其它生理体液中的细胞也可以进行分析。当使用任何这些液体时，所述液体中的细胞应通过离心从液体成分中分离。
组织应使用无菌的一次性解剖刀和无菌针头(或者两把解剖刀)在5mm Petri平皿中粗略切碎。从组织切片中除去石蜡的方法在本领域技术人员熟知的许多专业手册中有描述。
为通过PCR扩增样品中的靶核酸，所述序列必须是扩增系统中的成分可接触的。分离靶DNA的一种方法是用于相对大的样品的粗提方法。简而言之，来自血液样品的单核细胞及来自羊水、培养的绒毛膜绒毛细胞等的羊水细胞是经过标准程序通过在无菌Ficoll-Hypaque梯度上铺层而分离的。收集界面细胞并在无菌磷酸盐缓冲的盐水中洗涤3次，之后进行DNA提取。如果测试来自外周血淋巴细胞的DNA，则建议进行渗透压休克(osmotic shock)(用蒸馏水对沉淀处理10秒钟)，如果在最初的洗涤之后可见到剩余的红细胞则随后进行两次额外的洗涤。这样可以防止由血红蛋白携带的血红素基对PCR的抑制作用。如果在收集样品后不立即进行PCR检测，则可将106个细胞等份在无菌Eppendorf试管中沉淀并将干燥沉淀在-20℃冷冻直至使用。
将细胞重悬(106个有核细胞/100μl)于补加了100μg/ml蛋白酶K的50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.5％Tween20、0.5％NP40缓冲液中。在56℃温育2小时后，将细胞加热至95℃进行10分钟以使蛋白酶K失活并立即移至湿冰上(速冷)。如果出现总体聚集，则在相同的缓冲液中进行另一循环消化。这个提取物的10μl用于扩增。
当从组织例如绒毛膜绒毛细胞或铺满培养的细胞中提取DNA时，上述具有蛋白酶K的缓冲液的数量可以根据组织样品的大小而变化。将提取物在50-60℃温育4-10小时，然后在95℃保温10分钟以使蛋白酶失活。在较长的温育期间，新鲜的蛋白酶K应在大约4小时后以初始浓度加入。
当样品含有少量的细胞时，提取可以通过并入参考的如Higuchi，″Simple and Rapid Preparation of Samples for PCR″，in PCR Technology，Ehrlich，H.A.(ed.)，Stockton Press，New York所述方法完成。PCR可用于扩增衍生自骨髓和外周血液培养物的各个集落的极少数目(1000-5000个)的细胞中扩增靶区域。将样品中的细胞悬浮于20μl PCR裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml凝胶，0.45％NP40，0.45％Tween 20)中，冷冻直至使用。当进行PCR时，向在PCR裂解缓冲液的细胞中加入0.6μl蛋白酶K(2mg/ml)。然后将样品加热至大约60℃并温育1小时。通过将样品加热至95℃进行10分钟然后在冰上冷却而使蛋白酶K失活，从而终止消化。
相对容易的提取DNA以进行PCR的方法是盐析方法，如并入参考的Miller et al.，Nucleic Acids Res.161215(1988)所述。单核细胞在Ficoll-Hypaque梯度上分离。将细胞重悬于3ml裂解缓冲液(10mMTris-HCl，400mM NaCl，2mM Na2EDTA，pH 8.2)中。将50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液和150μl的20％SDS溶液加入细胞中，然后在37℃温育过夜。在温育期间摇动试管将改善样品的消化。如果蛋白酶K消化在过夜温育后不完全(仍可见到片段)，则在溶液中另外混和50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，在轻轻摇动或旋转平台上在37℃另外温育过夜。在完全消化后，向样品中加入1ml的6M NaCl溶液，并充分混和。所得溶液在3000rpm离心15分钟。沉淀中含有沉淀的细胞蛋白质，上清中含有DNA。将上清移至含有4ml异丙醇的15ml试管中。将试管的内容物轻轻混和直至水相和醇相混和并形成白色的DNA沉淀。移出DNA沉淀并浸入70％乙醇溶液中，轻轻混和。将DNA沉淀从乙醇中移出并通风干燥。将沉淀置于蒸馏水中并溶解。
用于提取PCR所用的高分子量DNA的试剂盒包括基因组分离试剂盒A.S.A.P.(BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind.)、基因组DNA分离系统(GIBCO BRL，Gaithersburg，Md.)、Elu-Quik DNA纯化试剂盒(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)、DNA提取试剂盒(Stratagene，LaJolla，Calif.)、TurboGen分离试剂盒(Invitrogen，San Diego，Calif.)等等。根据厂商指导使用这些试剂盒一般适于纯化DNA，之后实践本发明的方法。
提取的DNA的浓度和纯度可以通过分光光度法分析稀释的等份在260nm和280nm的吸光度而确定。在DNA提取后，可进行PCR扩增。PCR的每次循环的第一个步骤包括分离由引物延伸形成的核酸双链体。一旦链被分离，则PCR的下一个步骤包括将分离的链与位于靶序列侧翼的引物杂交。然后将引物延伸形成靶链的互补拷贝。为成功进行PCR扩增，设计引物以便每个引物沿着双链序列杂交的位置是这样的，即从一个引物中合成延伸产物，当其从模板(互补体)中分离时作为其它引物延伸的模板。根据需要重复多次变性、杂交和延伸循环以获得希望数量的扩增的核酸。
在PCR扩增的一个特别有用的实施方案中，链分离是通过加热反应至足够高的温度维持足够长的时间，以引起双链体的变性但不引起聚合酶的不可逆变性(见U.S.Pat.No.4,965,188，在此并入参考)而达到的。典型的热变性包括温度范围从大约80℃-105℃，时间为几秒至几分钟。然而，链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括通过物理的、化学的或酶方式进行。链分离可以通过例如解旋酶或者能呈现解旋酶活性的酶诱导。例如，酶RecA在存在ATP的情况下具有解旋酶活性。本领域已知适于通过解旋酶进行链分离的反应条件(见KuhnHoffinan-Berling，1978，CSH-Quantitative Biology，4363-67；和Radding，1982，Ann.Rev.Genetics 16405-436所述，在此并入参考)。
PCR中引物的模板依赖性延伸是在存在足够量的4种三磷酸脱氧核苷酸(典型地dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的情况下，在由适当的盐、金属阳离子和pH缓冲系统组成的反应介质中由聚合剂催化的。合适的聚合剂是已知催化模板依赖性DNA合成的酶。在一些情况中，靶区域可以编码至少一部分由该细胞表达的蛋白质。在这种情况中，mRNA可用于扩增靶区域。或者，可以使用PCR从RNA中产生cDNA文库以进一步扩增，进行引物延伸的最初的模板是RNA。适于从RNA模板中合成互补的拷贝-DNA(cDNA)序列的聚合剂是逆转录酶(RT)，如禽成髓细胞瘤病毒RT、莫洛尼鼠白血病毒RT或者嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)DNA聚合酶、由Perkin Elmer Cetus公司销售的具有逆转录酶活性的耐热DNA聚合酶。典型地，基因组RNA模板在最初逆转录步骤之后，在第一次变性步骤期间加热降解，仅剩下DNA模板。与DNA模板一起使用的合适聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I或其Klenow片段，T4DNA聚合酶，Tth聚合酶及Taq聚合酶，分离自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的热稳定的DNA聚合酶，并可购自Perkin Elmer Cetus公司。热稳定的聚合酶广泛用于核酸的扩增和测序中。本领域已知使用Taq聚合酶的反应条件，如Gelfand，1989，PCR Technology所述。
等位基因特导性PCR等位基因特异性PCR区分在存在或不存在变异或多态性方面的靶区域。选择只结合靶序列的特定等位基因的PCR扩增引物。这种方法由Gibbs，Nucleic Acid Res.1712427-2448(1989)描述。
等位基因特异性寡核苷酸筛选方法进一步的诊断筛选方法应用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)筛选方法，如Saiki et al.，Nature 324163-166(1986)所述。对于任何特殊的等位基因产生具有一或多个碱基对错配的寡核苷酸。ASO筛选方法检测变体靶基因组DNA或PCR扩增的DNA与非突变的寡核苷酸之间错配，示出所述寡核苷酸与突变的寡核苷酸相比结合降低。寡核苷酸探针可以设计为在低严格条件下结合等位基因的这两种多态性形式，但在高严格条件下结合其相应的等位基因。或者，可以设计严格条件，在该条件下获得基本的二元应答，即相应于靶基因变体形式的ASO与该等位基因杂交，而不与野生型等位基因杂交。
连接酶介导的等位基因检测方法可以通过连接酶介导的等位基因检测将测试对象DNA的靶区域与未受影响和受到影响的家族成员中的靶区域相对比。见Landegrenet al.，Science 241107-1080(1988)所述。连接酶也可以用于检测连接扩增反应的点突变，如Wu et al.，Genomics 4560-569(1989)所述。连接扩增反应(LAR)使用模板依赖性连接的顺序循环扩增特异DNA序列，如Wu，如前及Barany，Proc.Nat.Acad.Sci.88189-193(1990)所述。
变性梯度凝胶电泳使用聚合酶链反应产生的扩增产物可以通过使用变性梯度凝胶电泳分析。不同的等位基因可以基于不同的序列依赖性解链性质和DNA在溶液中的电泳迁移而鉴别。DNA分子在温度增加或变性的条件下解链为节段，该节段称为解链结构域(melting domain)。每个解链结构域均在独特的碱基特异性解链温度(TM)协同解链。解链结构域长度为至少20个碱基对，并且可以直至几百个碱基对。
等位基因之间基于序列特异性解链结构域的差异可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳评定，如Erlich，ed.，PCR Technology，Principles andApplications for DNA Amplification，W.H.Freeman and Co.，New York(1992)第7章所述，文献内容在此并入参考。
通常地，将待通过变性梯度凝胶电泳分析的靶区域使用位于靶区域侧翼的PCR引物扩增。将扩增的PCR产物用于具有线性变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳，如Myers et al.，Meth.Enzymol.155501-527(1986)和Myers et al.，in Genomic Analysis，A Practical Approach，K.Davies Ed.IRL Press Limited，Oxford，pp.95-139(1988)所述，文献内容在此并入参考。所述电泳系统保持在略低于靶序列解链结构域的Tm的温度。
在变性凝胶梯度电泳的另一种方法中，靶序列最初可以附于一段GC核苷酸序列上，称为GC夹(GC clamp)，如Erlich(如前)在第7章所述。优选地，GC夹中至少80％的核苷酸是鸟嘌呤或胞嘧啶。优选地，所述GC夹长度为至少30个碱基。这个方法特别适于具有高Tm的靶序列。
通常地，靶区域是通过如上述聚合酶链反应扩增的。寡核苷酸PCR引物之一在其5’末端携带GC夹区域(至少30个碱基的GC富集序列)，其在扩增期间掺入靶区域的5’末端。所得扩增的靶区域在如上述的变性梯度条件下在电泳凝胶上运行。由于一个单一碱基改变而不同的DNA片段将通过凝胶迁移至不同位置，这可以通过溴化乙啶染色而观测。
温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳(TGGE)基于与变性凝胶电泳相同的原理，除了变性梯度由温度不同改变为化学变性剂浓度不同而产生。标准TGGE利用具有沿着电泳通径的温度梯度的电泳仪。当样品通过具有均一浓度化学变性剂的凝胶迁移时，它们遇到升高的温度。另一种TGGE方法是暂时温度梯度凝胶电泳(TTGE或tTGGE)，其使完整凝胶的温度稳定增加以达到相同的结果。当样品通过凝胶迁移时，整块凝胶温度增加，导致当样品通过凝胶迁移时遇到增加的温度。样品的制备，包括掺入GC夹的PCR扩增及产物的显色与变性梯度凝胶电泳相同。
单链构象多态性分析在特定基因座的靶序列或等位基因可以使用单链构象多态性分析区别，这种分析通过单链PCR产物的电泳迁移中的改变而鉴别碱基差异，如Orita et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.852766-2770(1989)所述。扩增的PCR产物可以如上述产生，并加热或另外变性以形成单链的扩增产物。单链的核酸可以部分依赖于碱基序列而再折叠或形成二级结构。因此，单链扩增产物的电泳迁移率可以检测等位基因或靶序列之间的碱基序列差异。
错配的化学切割和酶切割靶序列之间的差异也可以通过错配的碱基对的差异化学切割而检测，如Grompe et al.，Am.J.Hum.Genet.48212-222(1991)所述。在另一种方法中，靶序列之间的差异可以通过错配的碱基对的酶切割而检测，如Nelson et al.，Nature Genetics 411-18(1993)所述。简而言之，动物和受影响家族成员的遗传物质可以用于产生无异源杂交DNA双链体的错配。如本文所用，“异源杂交体”是指DNA双链，其包含一个DNA链来自一种动物，另一个DNA链来自另一种动物，通常这两种动物的感兴趣的性状表型不同。阳性选择无错配的异源杂交体可以确定与多态性相关的小插入、缺失或其它多态性。
非凝胶系统其它可能的技术包括非凝胶系统如TaqManTM(Perkin Elmer)。在这个系统中，寡核苷酸PCR引物设计为位于所涉及突变的侧翼并允许该区域的PCR扩增。然后设计第三个寡核苷酸探针以与含有在基因的不同等位基因之间将要进行改变的碱基的区域杂交。这个探针用荧光染料在5’和3’末端都进行标记。选择这些染料由此在彼此的这种接近中，其中一种染料的荧光被另一种猝灭并不可检测。通过TaqDNA聚合酶从位于相对于探针的模板5’位置的PCR引物的延伸导致附着于退火的探针5’末端的染料通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性而切割。这样除去了可以检测在探针3’末端的染料发出的荧光的猝灭作用。不同的DNA序列之间的辨别通过这样的事实产生，即如果探针与模板分子的杂交不完全，即存在一些形式的错配，则染料的切割不发生。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列完全互补于其结合的模板分子时，猝灭才会被消除。反应混合物可含有两个不同的探针序列，每一个均是针对也许存在的不同等位基因设计，因此使得可以检测荧光反应中的两个等位基因。
另一技术包括侵入分析(Invader Assay)，其包括依赖于荧光的催化释放的等温扩增。见www.twt.com的第三次浪潮技术(Third WaveTechnology)。
基于非PCR的DNA诊断与等位基因序列连锁的DNA序列的鉴别可以不使用扩增步骤，而是基于动物及家族成员中的多态性包括限制片段长度多态性进行。杂交探针通常是通过互补碱基对与所有或部分靶核酸结合的寡核苷酸。探针依赖于杂交条件的严格性而典型地结合与探针序列缺少完全互补性的靶序列。所述探针优选地直接或间接标记，由此通过分析探针的存在与否可以检测靶序列的存在与否。直接标记方法包括放射性同位素标记，如用32P或35S标记。间接标记方法包括荧光标记、可结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素的生物素复合物、或者肽或蛋白质标记。目视检测方法包括光致发光物、德克萨斯红、罗丹明及其衍生物、红无色染料及3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、荧光素及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等或者具有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等杂交探针包括能与其中存在主要效应基因之一的猪染色体杂交的任何核苷酸序列，并因此能限定与主要效应基因之一连锁的遗传标记，包括限制片段长度多态性、高可变区域、重复元件或可变数目的串联重复。杂交探针可以是任何基因或合适的类似物。另外合适的杂交探针包括已知定位在染色体相关区域的cDNA或基因的外显子片段或一部分。
根据本发明使用的优选的串联重复杂交探针是那些一些探针，其在高度严格杂交条件下在特异的基因座识别小数目的片段，或者当严格条件降低时在该基因座识别较大数目的片段。
可以使用一或多种另外的限制酶和/或探针和/或引物。另外的酶、构建的探针和引物可以由本领域技术人员通过常规实验确定，这包含在本发明的范围内。
尽管本发明所述方法是关于单一限制酶和单一系列引物的应用，但所述方法不限于此。如果需要则可以使用一或多种另外的限制酶和/或探针和/或引物。确实在一些情况中优选地使用提供特异性单元型的标记组合。另外的酶、构建的探针和引物可以通过常规实验组合本发明提供和引用的教导确定。
根据本发明的一个实施方案，已经鉴别了主要效应基因中的多态性，其与生长和肉品质性状相关。在一个实施方案中，标记的存在与否可使用限制性核酸内切酶通过PCR RFLP分析检验，并且扩增引物由于多态性周围的区域高度相似而可以使用相似的人、猪或其它序列设计，或者可以使用GenBank中例证的已知序列(例如人)设计，或者基于本发明的教导和参考甚至从得自基因周围区域的连锁数据的序列中设计。多态性周围的序列促进交替PCR测试的发展，其中具有取自与多态性紧密相邻的序列的大约4-30个连续碱基的引物与聚合酶链反应结合使用，以在用希望的限制酶处理之前显著扩增该区域。引物不需要精确的互补体，基本相同的序列即可。本领域技术人员已知进行PCR扩增的引物的设计，详见于Ausubel(ed.)，ShortProtocols in Molecular Biology，Fourth Edition，John Wiley and Sons1999所述。如下是引物设计的简要描述。
引物设计策略越来越多地应用聚合酶链反应(PCR)方法刺激了许多程序的开发以有助于用作PCR引物的寡核苷酸的设计或选择。可以通过Internet自由获得的这种程序的四个实例是Whitehead Institute的Mark Dalyand Steve Lincoln的PRIMER(UNIX，VMS，DOS，and Macintosh)；寡核苷酸选择程序(OSP)，Washington University in St.Louis的Phil Greenand LaDeana Hiller(UNIX，VMS，DOS，and Macintosh)；Yoshi的PGEN(DOS)；及the University of Wisconsin的Bill Engels的Amplify of(Macintosh)。通常这些程序有助于PCR引物的设计，通过搜索已知重复序列元件的比特数(bit)，然后通过分析推定的引物的长度和GC含量以优化Tm而进行。也可以利用商购软件，引物选择程序包含在最一般的序列分析程序包中。
测序和PCR引物设计用作测序或PCR引物的寡核苷酸需要选择特异性识别靶位的合适序列，然后测试该序列以消除该寡核苷酸具有稳定的二级结构的可能性。序列中的反向重复可以使用如上述重复鉴别程序或RNA折叠程序鉴别(见“核酸结构的预测”)。如果观测到可能的主干结构，则引物的序列可以在任一个方向转变几个核苷酸以使预测的二级结构最小化。寡核苷酸的序列也应与合适的载体和插入DNA的双链序列对比。显而易见，测序引物应仅具有与靶DNA的一个单一匹配。排除与非希望的靶DNA序列仅具有一个单一错配的引物也是明智的。对于用于扩增基因组DNA的PCR引物而言，引物序列应与GenBank数据库中的序列对比，以确定是否存在任何显著的匹配。如果所述寡核苷酸序列在任何已知的DNA序列中均存在，或者更重要地在任何已知的重复元件中均存在，则所述引物序列应改变。
本发明的方法和材料也可以更一般地使用以评估动物DNA，对各个动物进行遗传分型，并检测动物中的遗传差异。特别地，动物的基因组DNA样品可以参考一或多个对照组加以评估，以确定某一序列中是否存在多态性。优选地，对于动物序列进行RFLP分析，并将结果与对照组对比。对照组是不同动物的一或两个序列的RFLP分析结果，所述动物基因的多态性已知。相似地，动物的基因型可以通过获得其基因组DNA样品、对该DNA中的基因进行RFLP分析，并将结果与对照组对比而确定。再一次地，所述对照组是不同动物的序列之一的RFLP分析结果。所述结果通过指定其基因中的多态性而对动物进行遗传分型。最后，动物之中的遗传差异可以通过从至少两个动物中获得基因组DNA，鉴别核苷酸序列之一中多态性的存在与否，并对比结果而确定。
如前面所讨论的，这些分析用于鉴别与生长和肉品质相关的遗传标记，用于在与其它特性可能相关联的相同基因或等位基因中鉴别其它多态性，及用于对动物的基因型和表型进行一般性科学分析。
一旦鉴别了多态性并且与特殊的性状建立联系，则本领域技术人员理解有许多方式可以针对这种多态性而对动物进行基因分型。这种可替换的测试的设计仅代表本领域技术人员已知的参数的优化，这方面如本文充分描述的包含在本发明范围内。
根据本发明可以使用本领域的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中有充分说明。见例如Maniatis，Fritsch& Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；DNACloningA Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis.M.J.Gait ed.1984)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985))；Transcriptionand Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984))；Animal CellCulture(R.I.Freshney，ed.(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning，(1984)。
如下实施例是更好地举例示出本发明而无任何限制之意。本领域技术人员将意识到可以使用常规的实验而可改变一些不同的参数，这些包含在本发明范围内。
实施例1组织蛋白酶Z(CTSZ)PCR-RFLP测试AlwNI多态性引物CT04F5′GGC ATT TGG GGC ATC TGG G 3′(SEQ ID NO)CT04R5′ACT GGG GGA TGT GCT GGT T 3′(SEQ ID NO)PCR条件混合物1
将10μL的混合物1和DNA在反应试管中组合并用矿物油覆盖。运行如下PCR程序94℃3分钟；94℃30秒，62℃30秒及72℃30秒，共35次循环；随后在72℃5分钟进行最后延伸。
将4μL PCR反应在标准1％琼脂糖凝胶上检测以证实成功扩增并清除阴性对照。产物大小为大约330碱基对。使用如下程序进行消化
将所述缓冲液、酶和水制成混合物。将5μL加入含有DNA的每个反应试管中。在37℃温育至少4小时，优选地消化过夜。将4μL的加样染料与6μL的消化的PCR产物混和并将总体积加样于3％琼脂糖凝胶中。期望的AlwNI模式示于图2A。
实施例2GNAS PCR-RFLP测试BbsI多态性A.引物GN03F5′AAG CAG GCT GAC TAC GTG 3′(SEQ ID NO)GN03R5′TCA CCA CAA GGG CTA CCA 3′(SEQ ID NO)PCR条件混合物1
将10μL的混合物1和DNA在反应试管中组合并用矿物油覆盖。运行如下PCR程序94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒及72℃30秒，共35次循环；随后在72℃5分钟进行最后延伸。
将4μL PCR反应在标准1％琼脂糖凝胶上检测以证实成功扩增并清除阴性对照。产物大小为大约321碱基对。使用如下程序进行消化
将所述缓冲液、酶和水制成混合物。将6μL加入含有DNA的每个反应试管中。在37℃温育至少4小时，优选地消化过夜。将4μL的加样染料与6μL的消化的PCR产物混和并将总体积加样于3％琼脂糖凝胶中。期望的BbsI模式示于图2B。
实施例3MC3R PCR-RFLP测试MnlI多态性引物正向5′GCC TCC ATC TGC AAC CTC T 3′(SEQ ID NO)反向5′AGC ATG GCG AAG AAG ATG AC 3′(SEQ ID NO)PCR条件混合物1
将混合物1和DNA在反应试管中组合并用矿物油覆盖。运行如下PCR程序94℃ 3分钟；94℃ 30秒，54℃ 1分钟及72℃ 30秒，共36次循环；随后在72℃ 10分钟进行最后延伸。
将2μL PCR反应在1.6％琼脂糖凝胶上检测以证实成功扩增并清除阴性对照。可使用如下程序进行消化MnlI消化反应
将PCR产物、缓冲液、酶和水混和。温育至少4小时，优选地在37℃温育过夜。将消化物于加样染料混和(2∶5)并在3％NuSieve琼脂糖凝胶上运行。期望的MnlI模式示于图2C。
实施例4CTSZ、GNAS和MC3R基因型与一些经济性状之间的关联在Berkshire×Yorkshire杂种中研究(分别见表3、4和5所示)表3CTSZ基因型与猪资源群中的一些肉品质性状的关联
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，1-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表3的结果表明CTSZ基因型与5种肉品质QTL性状相关。与肉色、LabLH和LabLM的关联最强。另外，还检测了与其它肉品质性状如平均滴水损失和嫩度的关联，事实强化了这种标记在针对改良的肉品质而对猪进行选择中的潜在应用。
表4GNAS基因型与猪资源群中一些肉品质性状的关联
所用的显者水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001根据针对CTSZ确定的结果，还发现GNAS基因型与SSC17上5种QTL肉品质性状相关。这个标记的结果表明与肉色、LabLH和LabLM的最强关联，这与CTSZ基因型的作用一致。其它肉品质性状(平均滴水损失、嫩度值)也受这个标记的影响，进一步表明定位在SSC17的这个特异性区域上的这些遗传标记作为选择具有更高肉品质的猪的工具中的用途。
表5MC3R基因型与猪资源群中一些生长、肥胖度和肉品质性状的关联
所用的显者水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001MC3R基因型对肉品质的3种SSC 17QTL性状(肉色、LabLH和LabLM)无任何明显作用。然而，当与CTSZ和GNAS基因型对平均糖酵解潜力和平均乳酸盐的影响相比较时检测到这个标记对这两种性状具有更明显的作用。另外，MC3R变体与一些生长、肥胖度和畜体成分性状明显相关，这表明这个标记可用于具有改良的肉品质和生长性状的猪的选择中。
除了在猪资源群中进行的研究之外，这三种基因的作用也在一些商购的纯的及合成品系(Landrace、Large White及Synthetic)中进行了分析。结果示于表6至表15。
表6CTSZ对商购的Landrace种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表7CTSZ对商购的Large White种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表8CTSZ对商购的Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表9CTSZ对商购的Landrece、Large White和Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应的整体分析
表10GNAS对商购的Landrace种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表11GNAS对商购的Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表12GNAS对商购的Landrace和Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表13MC3R对商购的Landrece种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表14MC3R对商购的Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应的分析
所用的显著水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001表14表明了MC3R基因型对商购的Synthetic种群中一些性状的效应。由于在此种群中只检测到一只携带MC3R基因型的动物，此对比基本上是在MC3R基因型11和12之间作出的。
表15MC3R对商购的Landrece和Synthetic种群中肉品质和生产性状的效应的整体分析
所用的显者水平a，b-0.3；c，d-0.1；e，f-0.05；g，h-0.01；i，j-0.005；k，l-0.001；m，n-0.0005；o，p-0.0001在这些商购的品系中确定的结果提示与肉色相关的性状(腰肌和后腿minolta值)及其它肉品质性状以及生长和肥胖度的明显关联。这些对于养猪业均是有价值的性状。这些标记也可以一起使用；在这种策略中不仅可以针对肉品质还可以针对生长和肥胖度性状进行选择。
实施例4在猪第17号染色体(SSC17)上检测到一些肉品质性状的数量性状基因座(QTL)，包括肉色、腰肌Hunter lab值、腰肌Minolta lab值、平均乳酸盐和平均糖酵解潜力(Malek et al.，2001)。见最初的QTL图1。本发明人将三个基因定位在SSC17QTL区域上PKIG(蛋白激酶抑制剂γ)、PTPN1(蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体类型1)和PPP1R3D(蛋白质磷酸酶1，调节亚单位3D)。根据这些结果，将另外的3个基因也定位于相同的SSC17QTL区域CTSZ(组织蛋白酶Z)、GNAS(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(S)、α亚单位-腺苷酸环化酶刺激的Ga蛋白)和MC3R(黑色素-3(melanocortin-3)受体)。
已知上述6个基因在SSC17图中的位置，则对SSC17上这个QTL区域进行精细定位。使用可获得的人与猪基因组之间的对比图，选择一些位置候选基因进行研究，试图发现观测的与SSC17上表型变异相关的基因。
共分析了9个基因，即MMP9[基质金属蛋白酶9(明胶酶B，92kDa明胶酶，92kDa IV型胶原酶)]、ATP9A(ATPase，II类，9A型)、CYP24A1(细胞色素P450，家族24，亚家族A，多肽1)、AURKA(aurora激酶A)、DOK5(停靠蛋白5)、RAE1[RAE1RNA输出1同系物(S.pombe)]、SPO11[与DSB-样蛋白(S.cerevisiae)共价结合的SPO11减数分裂蛋白]、RAB22A(RAB22A，RAS致癌基因家族成员)及PCK1[磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(可溶的)]。
已知这些基因的图谱位置，它们被认为是良好的候选基因以解释在SSC17猪肉品质性状QTL中检测到的变异。针对这些基因的多态性开发并进行PCR-RFLP测试并针对肉色、腰肌Hunter lab值、腰肌Minolta lab值、平均乳酸盐和平均糖酵解潜力将大多数这些基因定位在SSC17QTL峰的下面。这些QTL跨越SSC17上从大约70至107cM的区域。
图谱上基因的位置如下PKIG定位在70.4cM，MMP9定位在72.6cM，PTPN1定位在80.4cM，ATP9A定位在83.6cM，CYP24A1定位在85.3cM，DOK5定位在88.3cM，MC3R定位在88.3cM，AURKA定位在90.4cM，SPO11定位在97.4cM，RAE1定位在98.9cM，RAB22A定位在100.3cM，GNAS定位在102.5cM，CTSZ定位在103.4cM及PPP1R3D定位在107.5cM。有两个基因(PCK1和C20orf43)在图谱中的位置还未确定。PCK1期望定位在RAE1与RAB22A之间。分析的所有16个基因的变体对一些经济学性状的效应在爱奥瓦州立大学(Iowa State University)Berkshire×Yorkshire杂种中进行研究(表16)。
表16.ISU猪资源种群中一些生长、畜体组成和肉品质性状的相关性的结果
显著效应(P＜0.1)以粗体字表示。与生长、肥胖度和肉品质性状相关的染色体区域分别以橙色、绿色和紫色标出。每个基因对几个性状的单独作用用黄色标出。脂肪性状＝平均背膘、胆固醇、末端肋间背膘、腰部背膘、大理石纹评分、第十肋间背膘；生长性状＝畜体重量、眼肌深度、长度、平均日增重、日增重测试、出生重量、I型纤维、II型纤维比率、和幼崽重量；其他性状是肉品质性状。
结果表明在一些基因与SSC17上的QTL性状之间存在很强的关联。另外，还检测到对生长和肥胖性状的额外的及非常明显的作用，以及与其它肉品质性状的一些关联。
PKIG和MMP9示出主要与肥胖和生长性状相关。这个染色体区域与平均日增重显著相关。另外，PKIG还示出对长度具有显著效应。MMP9显著影响一些背部脂肪性状，包括末端肋间(last rib)、腰部(lumbar)、第十肋间和平均背膘，并且对大理石纹评分也有影响。
当分析定位接近于SSC17上QTL峰的基因时，检测到一些基因即含有PTPN1-ATP9A-CYP24A1-DOK5的染色体区域(80.4cM-88.4cM)与所有QTL性状之间的显著关联。事实上，PTPN1-ATP9A染色体区域(80.4cM-83.6cM)示出与平均糖酵解潜力和平均乳酸盐显著相关，而包含ATP9A-CYP24A1-DOK5的区域(83.6cM-88.3cM)对肉色、腰肌Hunter lab值和腰肌Minolta lab值具有显著作用。另外，这种间隔还影响另外的重要肉品质性状，即平均滴水损失(drip)。另外，还发现ATP9A-CYP24A1(83.6cM-85.3cM)区域与长度(生长性状)和腰部背膘(脂肪性状)相关。ATP9A单独影响三种肉品质性状(风味、异味、和多汁评分)，而CYP24A1变体对平均背膘、平均日增重和测试的平均日增重具有显著作用。
定位在QTL峰下面的一些基因未示出与所有QTL性状显著的关联。然而，包括CYP24A1-DOK5-MC3R-AURKA(85.3cM-90.4cM)的区域对平均和腰部背膘具有显著作用。另外，DOK5显著影响末端肋间背膘、大理石纹评分和总脂质百分比，以及其它肉品质性状(后腿pH、风味和异味评分)。
染色体区域MC3R-AURKA(88.3cM-90.4cM)对一些生长(畜体重量、眼肌面积、测试的平均日增重、出生重量、II型纤维比率)和脂肪性状(平均及腰部背膘测定)具有显著作用。另外，MC3R也与两种QTL性状(平均糖酵解潜力和平均乳酸盐)以及相关的性状(平均糖原含量)显著相关。
发现SPO11和RAE1不仅与脂肪性状(平均和腰部背膘)相关，也与一些肉品质性状(后腿hunter值、后腿Minolta值和烹饪损失)相关。PCK1影响两种生长性状(长度和畜体重量)及一种肉品质性状(烹饪损失)。这个性状显著受到染色体区域SPO11-RAE1-PCK1-RAB22A(97.4cM-100.3cM)的影响。
含有RAB22A-GNAS-CTSZ的染色体区域(100.3cM-103.4cM)显著影响一些QTL性状(肉色、腰肌Hunter lab值，腰肌Minolta lab值)及两种其它的肉品质性状(平均滴水损失和嫩度评分)。另外，RAB22A单独影响后腿hunter值、后腿Minolta值和平均Instron压力，所有肉品质性状。再者，这个基因对生长(平均日增重，幼崽重量)和脂肪(腰部背膘)性状也有显著作用。GNAS和CTSZ单独影响一些肉品质性状，包括持水力、烹饪损失及咀嚼、风味和汁液评分。
腰部背膘受到染色体区域CTSZ-PPP1R3D(103.4cM-107.5cM)的显著影响。最后，PPP1R3D与一些生长性状(畜体重量、眼肌面积、测试的平均日增重、出生重量及幼崽重量)显著相关。
所有这些结果表明这些标记可以用于具有改良的肉品质和生长性状的猪的选择中。
除了在ISU猪资源群中进行的研究之外，还在一些商购的纯的及合成的品系中对9个基因的效应进行了分析。结果示于表17。
表17PKIG、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、MC3R、RAE1、RAB22A、GNAS和CTSZ基因型与商购的猪资源群中的一些生长、畜体成分和肉品质性状的关联
显著效应(P＜0.1)以粗体字表示。与生长、肥胖度和肉品质性状相关的染色体区域分别以橙色、绿色和紫色标出。
在这些商购品系中确定的结果提示与肉色相关的性状(腰肌和后腿minolta值评分)及其它肉品质性状以及生长和肥胖度的显著关联。这些对于养猪业均是有价值的性状。我们确信养猪业可以应用这个信息的最佳方式是同时使用这些基因作为遗传标记。如果采用这个策略，则非常可能不仅选择肉品质性状，也可以选择生长和肥胖度性状。特别地，PKIG、MMP9、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D可以用作标记以选择改良的生长相关性状。另外，PKIG、MMP9、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、AURKA、SPO11、RAE1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D可以用作标记以选择改良的脂肪相关性状。最后，PKIG、PTPN1、ATP9A、CYP24A1、DOK5、MC3R、SPO11、RAE1、PCK1、RAB22A、GNAS、CTSZ和PPP1R3D可以用作标记以选择改良的肉品质性状。因此，可以保证作为遗传标记的定位在SSC17的肉品质QTL区域的基因的单独或组合应用有助于选择改良的生长、肥胖度和肉品质测定。
所有PCR测试均使用前文列举的条件进行。如下是用于产生先前的数据的引物、碱基改变和限制酶的列表。所有数据均是针对切割等位基因而报道的。通过引物扩增的区域的序列(包括碱基改变)示于图3-5和7-18。
参考文献本文中引用的所有参考文献均以其全文并入参考。
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权利要求
1.一种通过与生长性状相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约70cM至大约104cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与生长性状相关的数量性状基因座。
2.权利要求1的方法，其中所述标记是选自如下一组的一个多态性限制位点Dde I、Msp I、Nae I、Afl III、Alw NI、Bse RI、Taa I、Mse I、Bst UI、Bcc I、Taq I和Mnl I。
3.一种通过与糖酵解潜力和平均乳酸盐相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约80cM至大约84cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与糖酵解潜力和平均乳酸盐相关的数量性状基因座。
4.权利要求3的方法，其中所述标记是Nae I限制位点。
5.权利要求3的方法，其中所述标记是Afl III限制位点。
6.一种通过与肉色、腰肌Hunter lab值，平均滴水损失和/或腰肌Minolta lab值相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约83cM至大约88cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与肉色、腰肌Hunter lab值，平均滴水损失和/或腰肌Minoltalab值相关的数量性状基因座。
7.权利要求6的方法，其中所述标记是Afl III限制位点。
8.权利要求6的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
9.权利要求6的方法，其中所述标记是Bse RI限制位点。
10.一种通过与长度和/或腰部背膘相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约83cM至大约85cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与长度和/或腰部背膘相关的数量性状基因座。
11.权利要求10的方法，其中所述标记是Afl III限制位点。
12.权利要求10的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
13.一种通过与腰部背膘相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约85cM至大约90cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与腰部背膘相关的数量性状基因座。
14.权利要求13的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
15.权利要求13的方法，其中所述标记是Bse RI限制位点。
16.权利要求13的方法，其中所述标记是Taa I限制位点。
17.一种通过与生长和脂肪性状相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约88cM至大约91cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与生长和脂肪性状相关的数量性状基因座。
18.权利要求17的方法，其中所述标记是Mnl I限制位点。
19.权利要求17的方法，其中所述标记是Taa I限制位点。
20.一种通过与烹饪损失相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约97cM至大约100cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与烹饪损失相关的数量性状基因座。
21.权利要求20的方法，其中所述标记是Mse I限制位点。
22.权利要求20的方法，其中所述标记是Bst UI限制位点。
23.权利要求20的方法，其中所述标记是Bcc I限制位点。
24.权利要求20的方法，其中所述标记是Taq I限制位点。
25.一种通过与肉色、腰肌Hunter lab值、腰肌Minolta lab值、平均滴水损失和/或嫩度相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约100cM至大约104cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与肉色、腰肌Hunter lab值、腰肌Minolta lab值、平均滴水损失和/或嫩度相关的数量性状基因座。
26.权利要求25的方法，其中所述标记是Taq I限制位点。
27.权利要求25的方法，其中所述标记是Bbs I限制位点。
28.权利要求25的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
29.一种通过与生长性状相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约103cM至大约107cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与生长性状相关的数量性状基因座。
30.权利要求29的方法，其中所述标记是Nae I限制位点。
31.权利要求29的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
32.一种鉴别与生长性状相关的等位基因的方法，所述方法包括从动物中获得组织或体液样品；扩增所述样品中存在的包含第17号染色体大约70cM至大约107cM的区域的DNA；检测所述染色体区域中一种多态性标记的存在，其中所述标记与生长性状中的表型变化相关。
33.一种确定可用于基于动物生长性状而鉴别和选择动物的遗传标记的方法，所述方法包括从所述动物获得组织或体液样品，所述样品包含DNA；扩增第一种动物的所述样品中第17号染色体大约70至大约107cM区域中存在的DNA；通过将所述样品与参考样品或序列对比以确定所述样品中存在的多态性等位基因的存在；将所述动物的生长、肥胖度或肉品质的可变性与所述多态性等位基因联系起来；由此所述等位基因在给定的类群、种群或物种中可用作遗传标记。
34.一种确定可用于基于动物的肉品质或生长性状而鉴别和选择动物的遗传标记的方法，所述方法包括确定与权利要求33中揭示的标记呈有用的连锁不平衡的多态性等位基因。
35.一种确定可用于基于动物的肉品质、肥胖度或生长性状而鉴别和选择动物的遗传标记的方法，所述方法包括从所述动物获得组织或体液样品，所述样品包含DNA；扩增第一种动物的所述样品第17号染色体大约70cM至大约90cM或者大约97cM至大约107.5cM的区域中存在的DNA；通过将所述样品与参考样品或序列对比以确定所述样品中存在的多态性等位基因的存在；将所述动物的生长、肥胖度或肉品质的可变性与所述多态性等位基因联系起来；由此所述等位基因在给定的类群、种群或物种中可用作遗传标记。
36.一种确定可用于基于动物的肉品质或生长性状而鉴别和选择动物的遗传标记的方法，所述方法包括确定与权利要求35中揭示的标记呈有用的连锁不平衡的多态性等位基因。
37.权利要求35的方法，其中所述确定步骤选自如下一组限制片段长度多态性(RFLP)分析、微测序、MALD-TOF、SINE、异源双链分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
38.权利要求35的方法，其中所述动物是猪。
39.权利要求35的方法，其中所述扩增包括如下步骤选择能扩增第17号染色体所述区域的正向和反向引物。
40.一种通过与平均日增重相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约70cM至大约72cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与平均日增重相关的数量性状基因座。
41.权利要求40的方法，其中所述标记是Dde I限制位点。
42.权利要求40的方法，其中所述标记是Msp I限制位点。
43.一种通过与大理石纹评分相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约72cM至大约80cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与大理石纹评分相关的数量性状基因座。
44.权利要求43的方法，其中所述标记是Msp I限制位点。
45.权利要求43的方法，其中所述标记是Nae I限制位点。
46.一种通过与平均背膘相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约85cM至大约90cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与平均背膘相关的数量性状基因座。
47.权利要求46的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
48.权利要求46的方法，其中所述标记是Bse RI限制位点。
49.权利要求46的方法，其中所述标记是Taa I限制位点。
50.一种通过与平均背膘、后腿hunter值和/或后腿minolta值相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约97cM至大约99cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与平均背膘、后腿hunter值和/或后腿minolta值相关的数量性状基因座。
51.权利要求50的方法，其中所述标记是Mse I限制位点。
52.权利要求50的方法，其中所述标记是Bst UI限制位点。
53.一种通过与Aloca背膘厚度p2位置相关的数量性状基因座的标记辅助选择法选择第一种猪的方法，所述方法包括确定第一种猪中一个基因座的存在，其中该基因座位于第17号染色体上大约100cM至大约103cM的区域中并且与选择包含该基因座的所述第一种动物的多态性标记遗传连锁，从而选择与Aloca背膘厚度p2位置相关的数量性状基因座。
54.权利要求53的方法，其中所述标记是Alw NI限制位点。
55.权利要求53的方法，其中所述标记是Taq I限制位点。
56.权利要求53的方法，其中所述标记是Bbs I限制位点。
全文摘要
本发明揭示了对第17号染色体上一个数量性状基因座的精细定位，该基因座与肉品质、生长和肥胖度相关。数量性状基因座与一些主要效应基因相关，所述主要效应基因与动物生长和肉品质具有表型相关性，可用于标记辅助育种。本发明揭示了这些基因的特异多态性等位基因进行动物测试筛选，以确定更可能产生希望的性状的那些基因。
文档编号C12Q1/68GK1809644SQ200480014257
公开日2006年7月26日 申请日期2004年5月24日 优先权日2003年5月23日
发明者马克斯·F.·罗斯柴尔德, 安东尼奥·拉莫斯, 金关束 申请人:衣阿华州立大学研究基金公司