筛选γ－分泌酶抑制剂的方法

专利名称：筛选γ－分泌酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及测定γ-分泌酶活性的改进方法，涉及所述方法的各种组分和所述方法的用途。本发明是基于WO00/34511 A2的教导，因此，将WO00/34511 A2的内容并入本文作为参考。
阿尔茨海默氏病(AD)是脑的神经变性疾病，其伴随着细胞水平上边缘系统和大脑皮质中神经元的大量损失。在受侵袭的脑部，可以在分子水平上检测到蛋白质沉积，即所称作的蚀斑，其是阿尔茨海默氏病的基本特征。最经常在这些蚀斑中发生的蛋白质是40到42个氨基酸的肽，其称作Aβ肽。该Aβ肽是695到770个氨基酸的明显更大的蛋白质的切割产物，所述蛋白质称作淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。
APP是整合跨膜蛋白质，其首先穿过脂双层。到目前为止所述蛋白质的最大部分在细胞外，而较短的C末端结构域导向胞质溶胶(

图1)。Aβ肽在图1中以暗灰色显示。约2/3的Aβ肽来自APP的细胞外结构域，约1/3来自APP的跨膜结构域。
除了基于膜的APP，还可以检测到淀粉状蛋白前体蛋白的分泌形式，其由APP的大胞外结构域组成并且称作APPsec(“分泌的APP”)。通过蛋白酶剪切APP形成APPsec，所述剪切通过α分泌酶实现。蛋白酶剪切发生在APP的氨基酸序列位点，其在Aβ肽的氨基酸序列内(Aβ肽的氨基酸残基16后)。从而通过α分泌酶对APP蛋白水解排除了Aβ肽的形成。
从而Aβ肽可以仅以备选加工途径从APP形成。推测两种其他蛋白酶参与该加工途径，一种蛋白酶称作β分泌酶，其在APP中的Aβ肽的N-末端切割，另一种蛋白酶称作γ-分泌酶，其释放Aβ的C-末端(Kang，J.等人，Nature，325，733)(图1)。
更多地了解分泌酶(α分泌酶、β分泌酶、γ-分泌酶)非常重要，尤其在阿尔茨海默氏病的研究，例如，鉴定参与分泌酶调节和Aβ肽形成的分泌酶或者因子中非常重要(Wolfe，M.S.(2001)，J.Med.Chem.，44(13)，2039-2060)。β分泌酶尤其γ-分泌酶的抑制可以导致Aβ产生的减少，另一方面，α分泌酶的激活可以增加APPsec中APP的加工并从而同时减少Aβ肽的形成。在此类研究过程中发现的一种转基因秀丽隐杆线虫(C.elegans)在德国专利申请DE 198 49 073 A1中描述。
有许多迹象表明Aβ肽(Aβ)是阿尔茨海默氏病发生中的关键因子。假定了Aβ-小纤维在细胞培养物中的神经毒性(Yankner，B.A.等人，(1990)Proc Natl Acad Sci USA，87，9020)。在患有唐氏综合征(其中编码APP的基因以一个额外的拷贝存在)的患者中，阿尔茨海默氏病的神经病理学特征甚至也在30岁年龄发生。这里，假设APP的过表达导致向Aβ肽的转化增加(Rumble，B.等人，(1989)，N.Engl.J.Med.，320，1446)。
可能Aβ肽的中心角色的最有力证据是阿尔茨海默氏病的家族形式。这里，在APP基因中β-和γ-分泌酶切割位点的周围区域或者在两种其他AD相关基因(早老蛋白)中发现突变，其在细胞培养中导致Aβ肽产生显著增加(Scheuner，D.等人，(1996)，Nature Medicine，2，864)。有许多迹象表明APP在其加工期间首先由β-分泌酶切割成Aβ肽以便随后作为γ-分泌酶的底物。因此γ-分泌酶在Aβ肽的形成中起关键作用(Wolfe，M.S.(2001)，loc.cit)。
通常，Aβ肽的检测是困难的，因为仅少量APP被转化(Simons M，等人，Neurosci(1996)1；16(3)899-908)。此外，Aβ肽是约4kDa的非常小的片段，其由于其疏水性特征极倾向于自身聚合。因此，Aβ肽在生理条件下容易沉淀(Hilbich，C.等人，(1991)J.Mol.Biol.，218，149)并且其沉淀形式不能用于检测。
真核细胞中Aβ肽的检测通过免疫学方法进行，所述方法为例如，ELISA、免疫沉淀和蛋白质印迹(Suzuki，N.等人，Science 1994，27，264(5163)1336；Haass，C.等人，(1992)Nature，359，322)。此外，Wolfe等人(1999)描述了用于从纯化的含有PS1(早老蛋白1)的膜级分测定γ-分泌酶活性的体外测定法。这些方法非常耗时，因为它们包括与适宜抗体的孵育步骤、破坏从适宜的细胞培养物或者模式生物(例如，秀丽隐杆线虫)所得的细胞。所述方法不适于自动化测定系统，例如，用于高通量筛选以鉴定特异抑制或者减小γ-分泌酶活性的化合物。这部分是由于γ-分泌酶活性取决于蛋白质的装配(Mattson，(2003)Nature 422，385)，所述蛋白质迄今仅在复杂膜脂质环境中有活性。
此外，根据WO00/34511A2的教导可以阐明γ-分泌酶的活性，WO00/34511A2描述了通过检测Aβ肽测定γ-分泌酶活性和检测γ-分泌酶的方法。WO00/34511A2的方法利用编码融合蛋白的转基因，所述融合蛋白含有作为γ-分泌酶的酶靶标位点的氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)、5’末端的信号肽(SP)、启动子，和如果适宜，还包括编码和/或非编码核苷酸序列，所述转基因掺入到细胞以便表达所述融合蛋白。
当融合蛋白由细胞中存在的γ-分泌酶特异切割时，形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQID NO.2)，并且形成第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。随后，通过使用例如适宜的报道子检测所述第一种和/或第二种部分蛋白质，所述报道子是例如，报道基因，其由与第一种和/或第二种部分蛋白质偶联的转录激活剂的释放激活。
由于伴随Aβ肽的检测的公知的问题，本发明的问题是例如通过减少背景信号和/或增加信号特异性改进WO00/34511A2的方法，以便提高本发明测定法中的信噪比。
令人惊奇地，减少由于非特异蛋白酶活性导致的第一种和/或第二种部分蛋白质的非特异释放可以提高根据WO00/34511A2的方法中信噪比。这通过例如在WO00/34511A2的融合肽中，排除/避免γ-分泌酶切割位点旁蛋白酶切割位点的任何其他序列/基序和/或内化序列来实现。因此，本发明涉及测定γ-分泌酶活性和检测具有γ-分泌酶活性的蛋白质的改进方法。
该方法的具体实施方案涉及鉴定γ-分泌酶、编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，和鉴定药学活性化合物的方法，所述化合物可以调节，例如，减小或者抑制具有γ-分泌酶活性的蛋白质。此类物质如果是药学上可接受的和适于治疗阿尔茨海默氏病则尤其重要。
本发明涉及检测γ-分泌酶的方法，其中1.使用转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)如果适宜，还含有编码和/或非编码核苷酸序列；2.该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白；3.融合蛋白通过细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQID NO.2)，和第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
4.检测第一种部分蛋白质和/或第二种部分蛋白质，其中所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽。
优选地，在所述方法中，所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽(即除了SEQ IDNo.1之外的任意其他肽)。
本发明还涉及检测γ-分泌酶活性的方法，其中1.制备/使用转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，d)如果适宜，还含有编码和/或非编码核苷酸序列；2.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白；3.融合蛋白通过细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)，和第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
4.测定第二种部分蛋白质的量并且从所形成的第二种部分蛋白质的量确定γ-分泌酶的活性，其中所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽。
本发明的方法(“Aβ肽筛选测定法”，“γ-分泌酶测定法”)适于体内检测γ-分泌酶(具有γ-分泌酶活性的蛋白质)或者γ-分泌酶的活性，使得可以普遍利用该方法，例如，用于高通量筛选(“HTS”)测定中。所述方法不具有上文提到的常规检测方法的缺点，尤其避免了费力的分离和检测步骤并显著提高了γ-分泌酶活性的特异信号。通过显著减小背景信号和分别避免由于非特异蛋白酶的作用导致的第一和第二种部分蛋白质释放的减少实现了更特异的信号。
本发明方法的一个基本成分是C-末端APP片段，其由γ-分泌酶切割成两个片段-含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQID NO.3)的第二种部分蛋白质，含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQID NO.3)的第二种部分蛋白质扩散到细胞的胞质溶胶(图2)。该第二种部分蛋白质可以在细胞的胞质溶胶中容易地检测为例如，与转录激活因子(TAF)的融合蛋白，在报道基因的帮助下，所述第二种部分蛋白质可以作为γ-分泌酶的存在的检测工具或者用于定量γ-分泌酶活性。γ-分泌酶切割位点位于APP的跨膜结构域中(Kang，J.等人，(1987)Nature，325，733)。APP跨膜结构域具有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVITLVML。γ-分泌酶在V40、A42或者T43后切割。细胞培养中真核细胞产生的Aβ肽分泌到培养基上清液中。
在适宜报道子系统(例如，TAF和相应报道基因)的帮助下，第二种部分蛋白质的释放可以激活报道子蛋白质的表达，该蛋白质可以在真核细胞中检测到。通过检测报道子蛋白质，可以证明APP中已经发生了γ-分泌酶切割。结果，可以定性和/或定量测定γ-分泌酶的活性。
可以如下更详细地表征本方法的组成第一种核苷酸序列编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)或者其含有SEQ IDNO.1的部分，其中所述APP或者其部分不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽基序。优选地，所述第一种核苷酸序列编码含有包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO.6或者SEQID NO.14的蛋白质。在其他实施方案中，所述第一种核苷酸序列编码截短的APP或者经修饰的APP，例如，通过定点诱变可以得到的截短的APP或者经修饰的APP，以便避免编码除了SEQ ID NO.1之外作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的肽基序。在再一个实施方案中，所述第一种核苷酸序列编码的所述APP或者其部分是来源于人、小鼠的APP的蛋白质(例如，APLP1或者APLP2)。
第二种核苷酸序列优选编码任意适宜的信号肽(“SP”)。该信号肽含有例如，根据SEQ ID NO.5的SP(人APP的SP)、根据SEQ ID NO.12的SP(酵母SUC2的SP，“SP2”)、根据SEQ ID NO.13的SP(BM40的SP，“SP3”)，或者例如，根据Heijne等人(Nucl.Acids Res.(1986)，14(11)4683-4690)公知的任意其他信号肽。
作为启动子，可能使用任意适宜的调节性或组成性启动子。该启动子可以适于例如，在哺乳动物细胞、秀丽隐杆线虫、酵母或者果蝇(Drosophila)中表达。用于哺乳动物细胞的适宜的启动子为例如，CMV、HSV TK、SV40、LTR(所有Clontech，Heidelberg，德国)和RSV(例如，InvitrogenTM lifetechnologies，NV Leek，荷兰)。可用于秀丽隐杆线虫的启动子为例如，unc-119、unc-54、hsp16-2、goa-1和sel-12。为了在酵母中表达，启动子ADH1(组成性)(Vlckova等人(1994)Gene，25(5)，472-4)、GAL1(条件可诱导的)(Selleck等人(1987)Nature 325，173-7)、MET3(条件的)(Cherest等人(1987)Mol Gen Genet 210，307-13)和MET25(参见例如，Kerjan等人(1986)Nucleic Acids Res.14(20)，7861-71)是适宜的。在果蝇中，可能使用例如，启动子MT(金属硫蛋白)、Ac5或者Ds47(所有InvitrogenTMlifetechnologies)。
优选地，真核细胞可以用于本发明方法中，例如，可以使用人细胞或者非人细胞，例如，猴、仓鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼或者酵母，例如，HeLa、HEK293、H4、SH-SY5Y、H9、Cos、CHO、N2A、SL-2或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在本发明的特定实施方案中，使用秀丽隐杆线虫细胞。细胞可以是转基因非人动物的成分。在具体实施方案中，转基因细胞可以是转基因秀丽隐杆线虫的成分。具体地，本发明涉及方法，其中使用例如，来自株系MaV203(InvitrogenTMlife technologies，Rockville，MD，USA)或者EGY 48(OriGene Technologies，Inc.Rockville，MD，USA)的酵母细胞。
转基因编码融合蛋白；其由第一和第二种核苷酸序列和如果适宜，其他的核苷酸序列编码的部分蛋白质组成。从而，所述融合蛋白含有第一种部分蛋白质和第二种部分蛋白质和，如果适宜，另一种部分蛋白质。然而，重要的是该融合蛋白除了SEQ ID NO.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意肽基序。技术人员从蛋白酶数据库，例如，MEROPS(Rawlings等人(2002)MEROPSthe protease database.NucleicAcids Res.30，343-346)可以知道已知的蛋白酶切割位点。
优选地，本发明的融合蛋白不含有蛋白酶切割位点，其是胱天蛋白酶(caspase)切割位点，例如，(IVL)ExD，特别地，VEVA、VEVD，在另一实施方案中，本发明的融合蛋白还不含有胞吞或胞吐的信号肽，其是APP内化的信号，例如，NpxY或者Di-亮氨酸，特别是NPTY。
在一个具体实施方案中，融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO.14。除了SEQ.ID No.1，所述融合蛋白不含有作为胞吞或胞吐(例如，APP内化信号)和/或蛋白酶(例如，胱天蛋白酶)切割位点的信号的任意(一个或多个)其他肽基序。
具体地，具有SEQ ID NO.15(SPC55GV TAG)的核酸序列的转基因可以用于本发明。在该方法的尤其优选的实施方案中，转基因存在于载体中。本发明的该具体实施方案还涉及成SP-C55-Gal 4-VP16(即，SPC55GV)。在该情况中，由APP的信号肽、APP的C55片段、GAL4和VP16组成的融合蛋白得到表达。定位于跨膜结构域的该蛋白质在C55片段内切割，并且第二种部分蛋白质，即含有C55片段的一部分、GAL4和VP16的融合蛋白的部分可以借助报道质粒检测。
除了转基因构建体SPC55GV，还设想其他报道子构建体，其中，例如，转录活化结构域可以插入SPC55的跨膜结构域和胞质溶胶结构域之间或者标签(例如，MYC、FLAG)可以在N-和C-末端上和SPC55的跨膜结构域和胞质溶胶结构域之间。
所述另一编码核苷酸序列可以编码例如，蛋白质，其可以用于检测第二种部分蛋白质。优选地，所述另一编码编码核苷酸序列因此位于第一种核苷酸序列的3’末端。所述另一编码核苷酸序列编码例如，从许多结构域构建的嵌合蛋白或者另一种蛋白质，例如，含有DNA结合结构域和转录激活结构域的蛋白质。在本发明的具体实施方案中，所述另一编码核苷酸序列编码由GAL4-结合结构域和VP16的转录激活结构域组成的蛋白质(GAL4-VP16，“GV”)，并且另一部分蛋白质优选具有氨基酸序列SEQ.IDNo.7。在酵母细胞中，所述另一部分蛋白质还可以含有LexA-结合结构域(例如，Lex A-VP16)。该另一部分蛋白质尤其适于其中使用酵母株系EGY48的细胞的方法。
具体地，本发明涉及方法，其中所用的细胞经报道质粒共转染。该报道质粒含有处于可调节的启动子控制下的报告基因，例如，该报告基因可以编码GFP和其衍生物，例如，EGFP(增强的绿色荧光蛋白)、EBFP、EYFP、d2EGFP、GFPuv或萤光素酶(例如，Promega，Mannheim，德国)，CAT(例如，Promega)、SEAP(例如，Clontech)、βGal(例如，Clontech)、造胶珊瑚荧光蛋白(RCFP，Clontech)或者程序性细胞死亡诱导因子，例如，Fas、TNF-R1、死亡结构域和同系物(Tartaglia等人(1993)Cell 74，845-53)、ced3、ced4、ced9。作为可调节的启动子，报道质粒可以含有最小启动子，例如，GAL4结合位点联合HIV、CD4启动子或者mec7启动子的最小启动子。适宜的可调节启动子的选择取决于所用的转录-激活结构域。
本发明的具体实施方案涉及所述方法的实施，其中所用的细胞为酵母细胞。在本发明的特定实施方案中在酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTMlife technologies，荷兰，目录号10835023)中整合MET-25启动子(SEQ IDNO.10)，作为酵母表达载体pDBTrp的备选方案，可以选择许多其他表达载体，它们具有不同的启动予(例如，可诱导的GAL-1启动子、组成性活性ADH1启动子)和不同的选择标记(ADE、LEU、TRP、HIS、LYS、PHE)。
本发明的具体实施方案涉及酵母细胞的用途，所述酵母细胞含有稳定整合到它们的基因组或者为染色体外的GAL4-或者LexA-可诱导的报告基因。在这些实施方案中，优选使用酵母株系MaV203(InvitrogenTMlifetechnologies Inc.，Rockville，MD，USA)或EGY48(OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD，USA)。
本发明方法的一个具体实施方案涉及酵母细胞的用途，所述酵母细胞还用另一重组载体转化。优选地，用于这些实施方案的细胞通常没有或者几乎没有任何内源γ-分泌酶或者内源γ-分泌酶活性并且使用上述方法不能检测到。该细胞可以用另一载体转化，所述载体中含有核苷酸序列-优选cDNA，其编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。例如，可以使用cDNA文库。然后该方法的该实施方案可以用于鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶或者编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA。可以用于搜索γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA文库可以从任意生物体的细胞或者组织制备，所述细胞或者组织为例如，B细胞、神经元、神经胶质细胞、海马、完整脑、胎盘、肾。优选地，从脊椎动物(例如，仓鼠、大鼠、小鼠、狗、猴、人)，特别是从人细胞或人组织制备cDNA。
对于细胞，其没有转化时不显示出γ-分泌酶活性，但是用cDNA文库转化后显示出γ-分泌酶活性，细胞中存在的cDNA编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。可以通过公知的方法从表现出该行为的细胞分离该cDNA，并通过公知方法进一步分析。
本发明还涉及转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)第一种核苷酸序列的3’末端的至少一种其他核苷酸序列，其编码DNA结合结构域和转录激活结构域，其中所述融合蛋白除了SEQ ID NO.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽。
优选地，第一种核苷酸序列编码CPP或者其部分，其除了SEQ ID NO.1外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽基序。所述转基因可以，例如，具有核苷酸序列SEQ ID NO.15。转基因可以存在于适宜的载体，例如，pcDNA 3.1+或pDBTrp中。本发明的另一实施方案是方法，其涉及本发明的转基因和/或载体用于产生转基因细胞的用途，从而，任选地，所述转基因细胞用于成为非人生物体的成分，所述非人生物体适于作为体内报道子生物体。例如，所述转基因和/或载体可以用于产生转基因秀丽隐杆线虫。在另一实施方案中，所述转基因和/或载体可以用于产生转基因酵母细胞，例如，酿酒酵母。
本发明还涉及产生转基因非人生物体，例如，转基因秀丽隐杆线虫的方法，其中含有所述转基因的所述转基因和/或载体经微注射到生物体(例如，秀丽隐杆线虫)的生殖腺。本发明还涉及细胞，其含有本发明的转基因，还涉及转基因秀丽隐杆线虫，其含有所述转基因。本发明还涉及含有本发明的所述转基因的细胞，尤其酵母细胞，所述转基因优选存在于适宜的载体中。此外，本发明涉及分别含有根据本发明的转基因和cDNA文库的细胞，优选酵母细胞，所述细胞适于作为cDNA表达文库(cDNA文库)的受试者。
本发明涉及所述转基因或者重组细胞，优选酵母或者秀丽隐杆线虫的细胞的用途，用于测定或者鉴定γ-分泌酶、编码γ-分泌酶的cDNA、编码γ-分泌酶的亚单位蛋白质的cDNA、编码γ-分泌酶样蛋白质的cDNA或者γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白质的活性的方法中，所述细胞用于鉴定γ-分泌酶活性(γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶)或者其过程的抑制剂的方法中的用途。
具体地，本发明涉及鉴定调节(即抑制、减小、增加或者改变)γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质(效应物)的方法，该方法包括下面的步骤1.产生转基因非人生物体，例如，转基因秀丽隐杆线虫或者酿酒酵母，或者转基因细胞，所述转基因非人生物体或者转基因细胞含有本发明的转基因。所述转基因非人生物体或者转基因细胞还含有报道质粒，该报道质粒携带蛋白质结合位点、最小启动子和报告基因和如果适宜，cDNA，其编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶，其中所述转基因非人生物体或者转基因细胞表达转基因和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶；2.将所述转基因非人生物体或者转基因细胞与所要研究的受试物质孵育；和3.检测第二种部分蛋白质的量。
本发明还涉及鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的效应物的方法，其中1.制备/使用本发明的转基因；2.所述转基因和报道质粒和如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA整合到细胞的基因组并且所述转基因编码的融合蛋白和如果适宜，cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶在将要研究的物质存在下表达。
3.融合蛋白a)被细胞中存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而b)形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质；和4.定量或定性测定所述第二种部分蛋白质。
本发明还涉及鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中编码含有信号肽和SEQ IDNO.1的蛋白质的转基因在所要研究的物质和报道质粒的存在下表达，并且测定所要研究的物质对形成的第二种部分蛋白质的量的效果，所述第二种部分蛋白质含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
本发明还涉及通过本发明方法鉴定的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂。
本发明方法可以例如结合C55-Gal 4-VP16系统(即由C55、GAL4和VP16组成的融合蛋白或者使用编码相应融合蛋白的核酸)用于1.鉴定和测定(定性和/或定量)γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
2.鉴定不同组织、细胞或者生物体或物种中γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。鉴定和分离编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的相关cDNA和该cDNA的进一步用途。
3.体内筛选，例如在酵母细胞(例如，酿酒酵母)、秀丽隐杆线虫或者细胞培养物中体内筛选以能够测定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性而不用免疫生物学方法。
4.使用本发明的方法鉴定和表征物质，例如，药学活性化合物，所述物质调节γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的酶活性或者生物活性，例如，γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的效应物(抑制剂、激活剂、调节剂)。具体地，该方法可以用于HTS(高通量筛选)。通过使用HTS系统，可以鉴定用于治疗阿尔茨海默氏病和/或预防性治疗的物质。
5.阿尔茨海默氏病的研究或背景下例如，促进更深入了解突变的APP或者其片段，或者基于膜的蛋白酶的功能。
6.所描述的融合蛋白/转基因，例如，SP-C55-Gal 4-VP16中的C55可以由本发明的其他片段替换，并且利用本发明方法可以研究γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶、其活性和调节。
本发明的另一实施方案是含有药学活性化合物的药物组合物，所述药学活性化合物抑制已经通过本发明的方法鉴定的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
本发明的另一实施方案是制备药物组合物的方法，该方法包括本发明的方法和配制所述鉴定的药学活性化合物。
本发明的再一实施方案是是制备药物的方法，所述方法包括a)根据本发明的方法和b)将所鉴定的药学活性化合物与药学惰性无机和/或有机赋形剂混合。
本发明的另一实施方案是用于检测γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的测试试剂盒，其含有本发明的转基因、载体或者细胞。
图1图1显示了淀粉状蛋白前体蛋白(同种型APP695和同种型APP770或APP751)和分泌酶切割产物。
图2示意性显示了本发明的原理N-末端的β-分泌酶切割位点；跨膜结构域中的γ-分泌酶切割位点；C100＝APP的C100片段；GAL4-VP16＝DNA结合结构域、转录激活结构域(由DNA结合结构域和转录激活因子组成)，其结合报道质粒的DNA上的蛋白质结合结构域。
图3表达质粒SP-C100-GAL4-VP16的构建aa＝氨基酸；限制性切割位点Sac I、Hind III和Kpn I指出质粒上切割位点的位置。
图4表达质粒pDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16用于在酵母中表达转基因的表达质粒的构建。
下面的实施例将阐明本发明并且不应认为是限制发明构思。
实施例实施例1构建含有SP-C100-GAL4/VP16的表达质粒pcDNA3.1+该质粒编码与APP的C末端100个氨基酸残基(C100)融合的APP信号肽(SP)。C100以Aβ肽的N-末端开始并以APP的C末端结束。其必须被γ-分泌酶额外地切割以便释放Aβ肽。
GAL4/VP16(Seq ID No.7)与SP-C100(Seq ID No.6)的C末端融合。GAL4/VP16含有酵母转录激活因子GAL4的前147个氨基酸残基和来自单纯疱疹病毒的转录激活因子VP16的78个C末端氨基酸残基。作为融合蛋白，GAL4片段接收DNA结合的功能，而VP16片段激活转录(Sadowski等人，1988)。pcDNA3.1+(InvitrogenTMlife technologies，荷兰，目录号V79020)作为质粒载体。
实施例2报道质粒pGL2-MRG5-EGFP的构建哺乳动物细胞报道质粒pGL2-MRG5是pGL2(Promega)，其中pGL2中含有人免疫缺陷病毒(HIV)核心启动子(Kretzschmar等人，1994)上游的GAL4 DNA结合位点的来自pMRG5(Ikeda等人，1998)的DNA片段插入到pGL2的萤光素酶报道基因的上游。为了容易在细胞培养中检测，将萤光素酶报道基因用从载体pEGFP-N1(Clontech Laboratories，Heidelberg)得到的EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的基因替代。
实施例3人成神经细胞瘤细胞的共转染人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)用实施例1和2的质粒共转染然后在波长480nm的光的照射下通过显微术分析，在所述波长下EGFP被激发。可能检测到显示出强绿色荧光的表达EGFP的细胞。为了确保绿色荧光特异依赖于报道质粒表达EGFP，仅用报道质粒pGL2-MRG5-EGFP转染SH-SY5Y细胞。在这些细胞中，不能检测到绿色荧光。该表达通过GAL4-VP16激活，其假定GAL4/VP16从SP-C100-GAL4/VP16的C末端蛋白水解释放。
实施例4使用C100-Ga14/VP16系统检测编码cDNA文库中γ-分泌酶的cDNA通过将含有ADH启动子和GAL4DB结构域的pDBTrp的部分(位于CYH2基因和多克隆位点之间)用含有SP-C100-GAL4/VP16上游的来自p415MET25(Mumberg等人，1994)的MET25启动子的DNA片段替换将SP-C100-GAL4/VP16克隆到酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTMlifetechnologies，荷兰，目录号10835023)中处于MET25启动子控制下。用该构建体转化酵母株系MaV203(InvitrogenTMlife technologies)。MaV203经遗传修饰并且含有三种GAL4-可诱导的报道基因(URA3、HIS3、lacZ)，它们稳定整合到基因组中(Vidal等人，1996)。在MaV203中，GAL4/VP16从SP-C100-GAL4/VP16蛋白质的蛋白水解释放导致URA3和HIS3读出的激活，从而允许在缺乏尿嘧啶和组氨酸的平板上生长。
SP-C100-GAL4/VP16 cDNA在MaV203中的表达仅导致报道子的低活性，从而该体内功能测定系统适于筛选和检测cDNA文库中编码γ-分泌酶的cDNA的表达。
实施例5通过筛选人B细胞cDNA文库鉴定γ-分泌酶来自实施例4的重组MaV203酵母株系用于对人B细胞cDNA文库(ATCC 87286；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，U.S.A.；Elledge等人，1991)筛选编码具有γ-分泌酶活性的蛋白质的cDNA。备选地，整合到酵母表达载体p415-MET25(Mumberg等人，1994)或者p415-ADH1(Mumberg等人，1995)的人海马cDNA文库可以用于筛选编码γ-分泌酶或者具有γ-分泌酶样活性蛋白质的cDNA。
实施例6克隆SP2-C100和SP2-C100-GAL4/VP16将SP-C100-GAL4/VP16(实施例1中描述)的人信号肽编码区用来自酵母SUC2基因(SP2；SEQ ID NO.12)的信号肽替代，导致编码SP2-C100-GAL4/VP16(SEQ ID NO.19)的构建体。
通过用5’引物和3’引物扩增C100的成熟形式的编码区(没有信号序列，参见SEQ ID NO.4)构建SP2-C100，其中所述5’引物包括SUC2-信号肽的编码序列(SEQ ID NO.12)，所述3’引物相应于天然终止密码子(Kang等人，(1987))。为了方便交换信号肽，设计引物EH47(SEQ ID NO.23)和EH49(SEQ ID NO.24)使得所得PCR产物含有额外的NheI位点，其连接信号肽的编码区和成熟肽。
EH475’-GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCC AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC-3’EH495’-CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC-3’通过EcoRI切割切除SP2-C100的C100片段并用C100-GAL4/VP16代替得到SP2-C100-GAL4/VP16。将该片段克隆到如实施例4中描述的含有MET25启动子的酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTMlifetechnologies，荷兰，目录号10835023)。
实施例7克隆SP2-C-GAL4/VP16-100为了得到构建体SP2-C-GAL4/VP16-100(SEQ ID NO.17)，通过使用下面的引物进行了三次独立的PCR反应EH535’-ACTATATCTAGAATGCTTTTGC-3’EH545’-TTCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAA-3’EH555’-TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAA-3’EH565’-ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATT-3’EH575’-AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCAT-3’EH595’-CGATAAGCTTGATATCGAATTC-3’1)使用SP2-C100作为模板，通过使用引物EH53(SEQ ID NO.25)和EH54(SEQ ID NO.26)扩增C100的胞外结构域和跨膜结构域从而PCR产物还含有3’侧翼区，其与GAL4/VP16编码区重叠。
2)使用引物EH55(SEQ ID NO.27)和EH56(SEQ ID NO.28)，和作为DNA模板的GAL4/VP16，进行PCR反应以扩增编码区与相应于SP2-C100的每一边的5’-和3’-侧翼区。
3)通过使用引物EH57(SEQ ID NO.29)和EH 59(SEQ ID NO.30)扩增编码C100的细胞质结构域的SP2-C100的3’-片段，导致与GAL4/VP16编码区5’重叠。所得PCR产物(约200bp，720bp，和100bp)经纯化并用于EH53和EH59存在下的最后PCR，EH53和EH59相应于SP2-C100的5’-和3’-末端。将约1000bp的最终PCR产物克隆到来自如实施例4描述的含有MET25启动子的pDBTrp(InvitrogenTMlife technologies，荷兰，目录号10835023)的酵母表达载体中。
实施例8克隆SP3-C100、SP3-C100-GAL4/VP16和SP3-C-GAL4/VP16-100为了在哺乳动物细胞系统中产生表达SP3-C100、SP3-C100-GAL4/VP16(SEQ ID No.21)和SP3-C-GAL4/VP16-100(SEQ IDNO.32)的三种质粒载体，将C100、C100-GAL4/VP16或C-GAL4/VP16-100从来自实施例6或7的酵母表达载体亚克隆到哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen，目录号V75020)中，该载体含有BM40信号肽(SP3；SEQ IDNO.13)的编码区。C100、C100-GAL4/VP16或C-GAL4/VP16-100的编码区连接到实施例6中描述的唯一NheI限制性位点中与SP3编码区处于框内。
实施例9提高C100-GAL4/VP16在酵母中的表达来自经转化的酵母的粗裂解物中不同构建体的表达水平的定量揭示与用编码与酵母suc2信号肽融合物的载体转化的酵母细胞的裂解物相比，SP-C100-GAL4/VP16的表达非常低。例如，SP-C100-GAL4/VP16的表达导致预期大小的特定带的强烈表达。然而，通过免疫印迹也可以检测到具有更高电泳迁移率的带，表明酵母中重组蛋白质的非特异降解。对于C-GAL4/VP16-100，蛋白质的稳定性提高了(见下文)，在C-GAL4/VP16-100中，GAL4/VP16结构域插入到C100框内，接近γ-分泌酶切割位点。两种融合蛋白都得到与编码没有GAL4/VP16的C100的构建体相当的表达水平，表明C100和GAL4/VP16之间两种不同的融合不干扰蛋白质表达。
实施例10改善酵母中背景由于信号肽交换导致C100-GAL4/VP16的增加的表达与酵母株系MaV203中URA3、HIS3和lacZ报道子系统的非特异活化的强烈增加相关。因为酵母缺少γ-分泌酶活性，所以这最可能是由于细胞蛋白酶对C100-GAL4/VP16的非特异加工和活性GAL4/VP16的释放。
通过将GAL4/VP16结构域移动到更接近γ-分泌酶切割位点，基本上消除了用C100-GAL4/VP16检测到C100跨膜结构域和GAL4/VP16结构域的氨基末端之间位点上的非特异蛋白质水解切割。
通过检查报道子系统的GAL4/VP16-独立的激活在MaV203中试验了多种构建体的切割。用SP-C100-GAL4/VP16转化MaV203显示出Ura+，His-表型(参见实施例4)。通过用SP2肽替换SP信号肽(得到SP2-C100-GAL4/VP16)增加表达水平导致所有读出强烈激活到类似于在阳性对照——组成性表达全长GAL4蛋白质(由质粒pCL1编码；ClontechLaboratories)的MaV203——中检测到的水平。相比，表达SP2-C-GAL4/VP16-100(其以与SP2-C100-GAL4/VP16相当的水平表达)的MaV203细胞显示出Ura--、His--表型，如通过用空载体对照转化MaV203所显示的。
因此，SP2-C-GAL4/VP16-100可以在酵母中高水平表达，但是仍然表现出GAL4-独立报道子的极低非特异激活。SP2-C-GAL4/VP16-100蛋白质的高水平表达联合非特异切割/报道子激活的低背景是读出系统具有令人惊奇的优化信噪比的前提条件。
实施例11在哺乳动物中通过γ-分泌酶加工SP3-C-GAL4/VP16-100为了阐明哺乳动物细胞中表达的SP3-C-GAL4/VP16-100蛋白质被γ-分泌酶活性正确加工，将SP3-C-GAL4/VP16-100转染到哺乳动物细胞，其已经表明内源性表达γ-分泌酶活性(Haass等人，1992)。为了在哺乳动物细胞中表达，如实施例8中描述的，将SP2-C-GAL4/VP16-100中的信号肽用来源于基底膜蛋白质BM40的信号肽替换，公知BM40高水平表达(SP3；SEQ ID NO.13)。通过定量Aβ向培养基的分泌监视γ-分泌酶的加工。通过夹层ELISA，使用单克隆抗体6E10和生物素化4G8(Senetek PLC，Napa，California，USA；参考Kim等人，1990)分别作为捕获抗体和检测抗体检测分泌的Aβ。
用SP3-C100转化后，观察到与空载体对照相比Aβ分泌增加8倍。用SP3-C100-GAL4/VP16或SP3-C-GAL4/VP16-100转化的细胞分泌相似量的Aβ，表明GAL4/VP16的C-末端和近膜融合都不干扰γ-分泌酶的蛋白水解加工。
实施例12哺乳动物细胞中表达的C-Gal4/VP16-100对GAL4/VP16-独立的报道基因的转录激活通过γ-分泌酶加工C100-GAL4/VP16和C-GAL4/VP16-100导致释放含有GAL4/VP16的多肽和来自C100的侧翼部分的额外氨基酸。用实施例2中描述的哺乳动物报道子-质粒pGL2-MRG5-EGFP(Ikeda等人，1998)共转染SP3-C100-GAL4/VP16和SP3-C-GAL4/VP16-100，质粒pGL2-MRG5-EGFP含有人免疫缺陷病毒(HIV)核心启动子上游的GAL4DNA结合位点和编码EGFP的cDNA。用含有GAL4/VP16的融合共转染pGL2-MRG5-EGFP导致在两种情况中出现GFP-阳性细胞。
实施例13构建哺乳动物表达质粒SP3-C55-GAL4/VP16
含有APP的C100序列和GAL4/VP16的构建体含有γ-分泌酶的切割位点和胱天蛋白酶样蛋白酶的切割位点。为了避免非特异胱天蛋白酶样活性能够在真实的γ-分泌酶位点和GAL4/VP16结构域之间切割SP3-C100-GAL4/VP16而释放GAL4/VP16并激活哺乳动物细胞中的报道子系统，缺失SP3-C100-GAL4/VP16中所含的编码APP的细胞质结构域的C100的45个氨基酸C-末端片段。除去C100的C末端45个氨基酸还消除了APP的C-末端的“内化肽”，其在插入到质膜后指导APP的胞吞。
从而，哺乳动物表达质粒SP3-C55-GAL4/VP16含有BM40信号肽(SeqID No.13)、APP-C100的N-末端55个氨基酸残基(C55；Seq ID No.6)和GAL4/VP16。C55以Aβ肽的N-末端开始并以APP的跨膜结构域结束。在SP3-C55-GAL4/VP16蛋白质中，仅存在γ-分泌酶的切割位点。C55含有γ-分泌酶切割位点并且必须由γ-分泌酶切割以便释放Aβ肽和GAL4/VP16。此外，因为SP3-C55-GAL4/VP16中不存在胞吞内化信号肽，仅质膜结合的C55-GAL4/VP16的γ-分泌酶催化切割将释放Aβ肽和激活报道子系统的GAL4/VP16依赖性转录。
通过在GAL4/VP16序列后导入终止密码子(TAG)后从载体SP3-C-GAL4/VP16-100得到表达质粒。这通过用PCR产生的DNA片段替换SP3-C-GAL4/VP16-100的HpaI-ClaI片段实现，所述PCR用SP3-C-GAL4/VP16-100作为DNA模板，在GAL4/VP16中唯一HapI位点上游的5’引物，和3’引物(5’-CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA-3’；Seq ID No.31)，该PCR在GAL4/VP16可读框C-末端导入TAG终止密码子(下划线)和ClaI限制性位点。
实施例14稳定转染的HEK293细胞用质粒SP3-C55-GAL4/VP16和萤光素酶报道质粒PGL2-MRG5(实施例2中描述)共转染HEK293细胞(人胚胎肾细胞系，(ATCC))。随后，将稳定细胞系与400μg/ml遗传霉素(GibcoBRL)孵育以选择新霉素抗性克隆，之后表征SP3-C55-GAL4/VP16和萤光素酶的稳定表达。
实施例15HEK293细胞的瞬时转染在多孔12板中用SP3-C55-GAL4/VP16载体(0.03μg)和pGL2-MRG5萤光素酶报道子载体(1μg)共转染HEK293细胞。
化合物DPAT(来自Elan Pharmaceuticals；Dovey等人，2001)和L-685，458(来自Merck Pharmaceuticals；Shearman等人，2000)都是公知的γ-分泌酶抑制剂，它们剂量依赖性抑制萤光素酶活性和Aβ产生，并显示出IC50分别为14nM(DAPT)和19nM(L-685，458)。
通过Bright-Glo Luciferase Assay试剂盒(Promega)定量萤光素酶活性。如实施例11中描述，使用抗体4G8和6E10(来自Senetek)通过ELISA定量细胞培养基中的Aβ。这些抗体对Aβ肽的氨基酸17-24(4G8)和1-17(6E10)是特异的。
在瞬时转染实验中，还通过免疫沉淀和免疫印迹定量Aβ。两种方法都鉴定了相应于Aβ肽的4kDa带。
实施例16稳定转染的HEK293细胞的药理学表征根据实施例14鉴定了稳定表达SP3-C55-GAL4/VP16和MRG5-萤光素酶构建体的HEK293细胞的克隆。该细胞克隆用于检查稳定转染的哺乳动物细胞测定系统对DAPT(来自Elan Pharm.；Dovey等人，2001)和L-685，458(来自Merck Pharm.；Shearman等人，2000)的应答。两种化合物都显示出剂量依赖性抑制萤光素酶活性(24小时处理)，IC50分别为230nM(DAPT)和130nM(L-685，458)。
实施例17鉴定γ-分泌酶的抑制剂为了鉴定γ-分泌酶的抑制剂，在Multi-Well 96板中孵育稳定双转染的HEK293细胞(见实施例14)，该测定中存在浓度为10μM或更小的待研究的化合物(例如，化合物文库筛选)，并在24小时后测定萤光素酶活性。使用Luciferase Assay System试剂盒(Promega)、Bright-Glo LuciferaseAssay试剂盒(Promega)，或者用于萤光素酶定量的任意其他方法可以定量萤光素酶活性。萤光素酶活性的下降反映了γ-分泌酶活性的下降。
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SEQ ID No.1(APP片段)GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLSEQ ID No.2(APP片段(第一种部分蛋白质))GAIIGLMVGGVVSEQ ID No.3(APP片段(第二种部分蛋白质))VIVITLVMLSEQ ID No.4(C100片段)LDAEFREDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITLVMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQNSEQ ID No.5(人APP的信号肽(SP))MLPGLALFLL AAWTARASEQ ID No.6(C55片段)LDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVVIA TVIVITLVML KKSEQ ID No.7(GAL4-VP16)
MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLTRAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQDNVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEFPGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFTPHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GGSEQ ID No.8(SP-C100-GAL4-VP16)GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACTTAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGAAGAACAACTG GGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTGACTAGGGCAC ATCTGACAGA AGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA
GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGA CCTTGACATG ATTTTGAAAATGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATT ATTTGTACAAGATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGACTGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCATCGGAAGAGAG TAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGAC CGATGTCAGC CTGGGGGACGAGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGC CGACGCGCTAGACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGGATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACTTCGAGTTTGA GCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAGSEQ ID No.9(人APP)AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAGACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGCGCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCCGCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCTGCTGGCTGAACCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAGTGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAGTATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCAGTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTTGTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGACAAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCACACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTGCTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAAGAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGCGGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAGGAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGTGATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGCATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACAACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAATGAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATGTCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCTGATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCAGCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAATGACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGGCCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAGCACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATC
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GAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCGATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAGGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGACCCCGGGTGCTAGCAAGGCCTTGTGGCCAGCCATGGCAACTAGTGCGGCCGCTAAGTAAGTAAGACGTCGAGCTCTAAGTAAGTAACGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTGTTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCCATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCAGCAATGAGTTGATGAATCTCGGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAGGACAATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGG
TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGASEQ ID No.11(SP-C100-GAL4-VP16融合蛋白)MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQQNGYENPTYK FFEQMQNARG TPAMKLLSSI EQACDICRLK KLKCSKEKPKCAKCLKNNWE CRYSPKTKRS PLTRAHLTEV ESRLERLEQL FLLIFPREDLDMILKMDSLQ DIKALLTGLF VQDNVNKDAV TDRLASVETD MPLTLRQHRISATSSSEESS NKGQRQLTVS PEFPGIWAPP TDVSLGDELH LDGEDVAMAHADALDDFDLD MLGDGDSPGP GFTPHDSAPY GALDMADFEF EQMFTDALGIDEY GGSEQ ID No.12(酵母SUC2基因的信号肽(SP2))MLLRAFLFLLAGFAAKISAALASEQ ID No.13(哺乳动物基底膜蛋白质BM40的信号肽(SP3))MRAWIFFLLCLAGRALASEQ ID No.14(SP-C55-GAL4-VP16)
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKGRSGKLL SSIEQACDIC RLKKLKCSKEKPKCAKCLKN NWECRYSPKT KRSPLTRAHL TEVESRLERL EQLFLLIFPREDLDMILKMD SLQDIKALLT GLFVQDNVNK DAVTDRLASV ETDMPLTLRQHRISATSSSE ESSNKGQRQL TVSPEFPGIW APPTDVSLGD ELHLDGEDVAMAHADALDDF DLDMLGDGDS PGPGFTPHDS APYGALDMAD FEFEQMFTDALGIDEYGGSEQ ID No.15(SP-C55-GAL4/VP16-TAG)1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc421 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca841 ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc901 tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc961 tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaattccgacatg1021 actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa1081 acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca1141 tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac1201 aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaaccgaagtgcg1261 ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaaaggtctccgc
1321 tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc1381 tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata1441 taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag1501 atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg1561 cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg1621 aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag1681 acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt1741 tgggggacgg ggattccccg ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg1801 ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg1861 agtacggtgg gggttagaaa atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg1921 ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc1981 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc2041 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg2101 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa2161 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat2221 ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg2281 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc2341 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga2401 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt2461 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat2521 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat2581 ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa2641 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc2701 ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt2761 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg2821 caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca2881 ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact2941 ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta3001 atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag3061 tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc3121 attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga3181 ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa3241 cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt3301 ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg3361 ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa3421 gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac3481 cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt3541 gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact3601 cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg
3661 ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg3721 acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc3781 atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt3841 gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc3901 gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg3961 ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg4021 attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct4081 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta4141 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat4201 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct4261 ggatcccgtc gacctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa4321 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg4381 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca4441 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg4501 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg4561 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg4621 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa4681 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg4741 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc4801 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc4861 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc4921 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg4981 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc5041 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga5101 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc5161 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac5221 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg5281 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc5341 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa5401 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta5461 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt5521 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag5581 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca5641 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc5701 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt5761 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag5821 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt5881 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat5941 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt
6001 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc6061 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat6121 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag6181 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt6241 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg6301 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta6361 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc6421 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtcSEQ ID No.16(重组质粒pDBTrp-MET25-SP-C-Ga14/VP16-100)1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt61 cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata121 atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt181 aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa241 atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata301 gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct361 tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata421 aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact481 attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa541 atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg601 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg661 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca721 aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc781 tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg841 ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg901 cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc961 agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt1021 cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac1081 tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt1141 agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg1201 gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc1261 tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg1321 taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc1381 ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa1441 attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc1501 catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa
1561 atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt1621 tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg1681 ggactgcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc1741 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg1801 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact1861 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg1921 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg1981 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac2041 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca2101 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga2161 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc2221 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct2281 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg2341 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct2401 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc2461 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc2521 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat2581 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt2641 aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct2701 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat2761 tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc2821 tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat2881 gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt2941 tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac3001 tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac3061 taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta3121 ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact3181 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt3241 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt3301 gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat3361 gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact3421 tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga3481 tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt3541 tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga3601 ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat3661 aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc3721 taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc3781 tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg3841 ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta
3901 aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg3961 aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata4021 ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg4081 tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca4141 aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt4201 ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct4261 ggggatcccc cctcgacgga tgcaagggtt cgaatccctt agctctcatt attttttgct4321 ttttctcttg aggtcacatg atcgcaaaat ggcaaatggc acgtgaagct gtcgatattg4381 gggaactgtg gtggttggca aatgactaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa4441 actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct4501 cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt4561 tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt4621 cagatacata gatacaattc tattaccccc atccatactc tagaatgctt ttgcgagctt4681 tccttttcct cttggctggt tttgcagcca aaatatctgc agcgctagct gatgcagaat4741 tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg4801 tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag4861 tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaaggtag atctggcaag ctactgtctt4921 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac4981 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa5041 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac5101 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt5161 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg5221 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata5281 gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg5341 tatcgccgga attcccgggg atctgggccc ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc5401 tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc5461 tggacatgtt gggggacggg gattccccgg gtccgggatt taccccccac gactccgccc5521 cctacggcgc tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc gatgcccttg5581 gaattgacga gtacggtggg ggtactagtg gccagtacac atccattcat catggtgtgg5641 tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg cagcagaacg5701 gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaacggcgcc tagggatccc5761 ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgaccccggg tgctagcaag5821 gccttgtggc cagccatggc aactagtgcg gccgctaagt aagtaagacg tcgagctcta5881 agtaagtaac ggccgccacc gcggtggagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa5941 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa6001 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt6061 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga6121 ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcttgtt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt6181 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccgag
6241 caaatgcctg caaatcgctc cccatttcac ccaattgtag atatgctaac tccagcaatg6301 agttgatgaa tctcggtgtg tattttatgt cctcagagga caatacctgt tgtaatcgtt6361 cttccacacg gatcccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt6421 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca6481 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca6541 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt6601 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc6661 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg6721 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat6781 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg6841 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct6901 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa6961 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt7021 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc aggcaagtgc7081 acaaacaata cttaaataaa tactactcag taataaccta tttcttagca tttttgacga7141 aatttgctat tttgttagag tcttttacac catttgtctc cacacctccg cttacatcaa7201 caccaataac gccatttaat ctaagcgcat caccaacatt ttctggcgtc agtccaccag7261 ctaacataaa atgtaagctt tcggggctct cttgccttcc aacccagtca gaaatcgagt7321 tccaatccaa aagttcacct gtcccacctg cttctgaatc aaacaaggga ataaacgaat7381 gaggtttctg tgaagctgca ctgagtagta tgttgcagtc ttttggaaat acgagtcttt7441 taataactgg caaaccgagg aactcttggt attcttgcca cgactcatct ccatgcagtt7501 ggacgatatc aatgccgtaa tcattgacca gagccaaaac atcctcctta ggttgattac7561 gaaacacgcc aaccaagtat ttcggagtgc ctgaactatt tttatatgct tttacaagac7621 ttgaaatttt ccttgcaata accgggtcaa ttgttctctt tctattgggc acacatataa7681 tacccagcaa gtcagcatcg gaatctagag cacattctgc ggcctctgtg ctctgcaagc7741 cgcaaacttt caccaatgga ccagaactac ctgtgaaatt aataacagac atactccaag7801 ctgcctttgt gtgcttaatc acgtatactc acgtgctcaa tagtcaccaa tgccctccct7861 cttggccctc tccttttctt ttttcgaccg aattaattct taatcggcaa aaaaagaaaa7921 gctccggatc aagattgtac gtaaggtgac aagctatttt tcaataaaga atatcttcca7981 ctactgccat ctggcgtcat aactgcaaag tacacatata ttacgatgct gtctattaaa8041 tgcttcctat attatatata tagtaatgtc gtttatggtg cactctcagt acaatctgct8101 ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac8161 gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca8221 tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgaSEQ ID No.17(SP2-C-GAL4/VP16-100)atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgc
agaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctagSEQ ID No.18(SP2-C-GAL4/VP16-100)mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkgrsgkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygggtsgqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnga*SEQ ID No.19(SP2-C100-GAL4/VP16)atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctcca
aagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtagSEQ ID No.20(SP2-C100-GAL4/VP16)mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideyggSEQ ID No.21(SP3-C100-GAL4/VP16)atgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggg
SEQ ID No.22(SP3-C100-GAL4/VP16)mrawiffllclagralaapladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamk11ssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmplt1rqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideyggSEQ ID No.23(引物EH47)GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC AGCCAAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGACSEQ ID No.24(引物EH49)CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAACSEQ ID No.25(引物EH53)ACTATATCTAGAATGCTTTTGCSEQ ID No.26(引物EH54)TCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAASEQ ID No.27(引物EH55)TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAASEQ ID No.28(引物EH56)ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATTSEQ ID No.29(引物EH57)AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCATSEQ ID No.30(引物EH59)CGATAAGCTTGATATCGAATTCSEQ ID No.31(引物C55-3’)CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA
SEQ ID No.32(质粒SP3-C-GAL4/VP16-100)gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttaactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttctgcctgccgcctgcctgcctgccactgagggttcccagcaccatgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaa
cattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctagggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgaggccgctcgagcatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggaaccagctggggctcgaggggggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatcttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtgggtaccgagctcgaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttggatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc
ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcccgtcgacctcgagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccag
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序列表<110>塞诺菲-安万特德国有限公司<120>筛选γ-分泌酶抑制剂的方法<130>DEAV2003/0046<140>
<141>
<160>32<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述APP片段<400>1Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val15 10 15Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu20<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述APP片段<400>2Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val15 10
<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述APP片段<400>3Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leul5<210>4<211>100<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述C100片段<400>4Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln15 10 15Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly A1a Ile20 25 30Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile35 40 45Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly50 55 60Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser65 70 75 80Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu85 90 95
Gln Met Gln Asn100<210>5<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg15 10 15Ala<210>6<211>55<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述C55片段<400>6Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln1 5 1015Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile20 25 30Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile35 40 45Thr Leu Val Met Leu Lys Lys50 55<210>7<211>232
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述GAL4-VP16<400>7Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu15 10 15Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu20 25 30Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro35 40 45Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu50 55 60Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile65 70 7580Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu85 90 95Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala100 105 110Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser115 120 125Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu130 135 140Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val145 150 155 160Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala165 170 175His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly180 185 190Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly
195 200 205Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala210 215220Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly225 230<210>8<211>1813<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变基因<400>8ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc 60ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 120aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 180cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 240cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt 300tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 360ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 420actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 480tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 540accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccgcgt gtacggtggg aggtctatat 600aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac 660gactcactat agggagaccc aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttca cagctagcgc 720actcggtgcc ccgcgcaggg tcgcgatgct gcccggtttg gcactgttcc tgctggccgc 780ctggacggct cgggcgctgg atgcagaatt ccgacatgac tcaggatatg aagttcatca 840tcaaaaattg gtgttctttg cagaagatgt gggttcaaac aaaggtgcaa tcattggact 900catggtgggc ggtgttgtca tagcgacagt gatcgtcatc accttggtga tgctgaagaa 960gaaacagtac acatccattc atcatggtgt ggtggaggtt gacgccgctg tcaccccaga 1020ggagcgccac ctgtccaaga tgcagcagaa cggctacgaa aatccaacct acaagttctt 1080tgagcagatg cagaacgcgc ggggtacccc ggcgatgaag ctactgtctt ctatcgaaca 1140agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac cgaagtgcgc 1200caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa ggtctccgct 1260gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac agctatttct 1320actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt tacaggatat 1380aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg ccgtcacaga 1440tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata gaataagtgc 1500
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<223>人工序列描述重组质粒<400>10acgaaagggc ctcgtgatsc gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 60ttaggacgga tcgcttgcct gtaacttaca cgcgcctcgt atcttttaat gatggaataa 120tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt ttatgttttg tatttggatt ttagaaagta 180aataaagaag gtagaagagt tacggaatga agaaaaaaaa ataaacaaag gtttaaaaaa 240tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata tttattagac aagaaaagca gattaaatag 300atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca ggattttcgt gtgtggtctt 360ctacacagac aagatgaaac aattcggcat taatacctga gagcaggaag agcaagataa 420
aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca tcttcggaaa acaaaaacta 480ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt tatatattta tattaaaaaa 540tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg 600gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 660tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatctgc agctctggcc cgtgtctcaa 720aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct 780gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc 840tggaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 900gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tttcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 960gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 1020agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 1080cctgatgatg catggttact caccactgcg atccgcggga aaacagcatt ccaggtatta 1140gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 1200ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 1260caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 1320aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata cgcttttgcc attctcaccg 1380gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 1440ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 1500atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 1560tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 1620ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 1680gacggcgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1740tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1800aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1860tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1920agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1980taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 2040caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 2100agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag 2160aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 2220gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag gggggaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2280tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggccga 2340gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2400ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 2460ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 2520aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 2580aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2640atgtgagtta cctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctccta 2700tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2760acgccaagct cggaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggtaccg atcccgagct 2820ttgcaaatta aagccttcga gcgtcccaaa accttctcaa gcaaggtttt cagtataatg 2880ttacatgcgt acacgcgtct gtacagaaaa aaaagaaaaa tttgaaatat aaataacgtt 2940cttaatacta acataactat aaaaaaataa atagggacct agacttcagg ttgtctaact 3000ccttcctttt cggttagagc ggatgtgggg ggagggcgtg aatgtaagcg tgacataact 3060
aattacatga tatcgacaaa ggaaaagggg cctgtttact cacaggcttt tttcaagtag 3120gtaattaagt cgtttctgtc tttttccttc ttcaacccac caaaggccat cttggtactt 3180tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcatagaaa taatacagaa gtagatgttg 3300aattagatta aactgaagat atataattta ttggaaaata catagagctt tttgttgatg 3360cgcttaagcg atcaattcaa caacaccacc agcagctctg attttttctt cagccaactt 3420ggagacgaat ctagctttga cgataactgg aacatttgga attctaccct tacccaagat 3480cttaccgtaa ccggctgcca aagtgtcaat aactggagca gtttccttag aagcagattt 3540caagtattgg tctctcttgt cttctgggat caatgtccac aatttgtcca agttcaagac 3600tggcttccag aaatgagctt gttgcttgtg gaagtatctc ataccaacct taccgaaata 3660acctggatgg tatttatcca tgttaattct gtggtgatgt tgaccaccgg ccatacctct 3720accaccgggg tgctttctgt gcttaccgat acgaccttta ccggctgaga cgtgacctct 3780gtgctttcta gtcttagtga atctggaagg cattcttgat tagttggatg attgttctgg 3840gatttaatgc aaaaatcact taagaaggaa aatcaacgga gaaagcaaac gccatcttaa 3900atatacggga tacagatgaa agggtttgaa cctatctgga aaatagcatt aaacaagcga 3960aaaactgcga ggaaaattgt ttgcgtctct gcgggctatt cacgcgccag aggaaaatag 4020gaaaaataac agggcattag aaaaataatt ttgattttgg taatgtgtgg gtcctggtgt 4080acagatgtta cattggttac agtactcttg tttttgctgt gtttttcgat gaatctccaa 4140aatggttgtt agcacatgga agagtcaccg atgctaagtt atctctatgt aagctacgtg 4200gcgtgacttt tgatgaagcc gcacaagaga tacaggattg gcaactgcaa atagaatctg 4260gggatccccc ctcgacggat gcaagggttc gaatccctta gctctcatta ttttttgctt 4320tttctcttga ggtsgtcaca tgatcgcaaa atggcaaatg gcacgtgaag ctgtcgatat 4380tggggaactg tggtggttgg caaatgacta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga 4440aaactgtgta acataataac cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg 4500ctcgatgaaa aaaataagat atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt 4560tttccttttt cttgctctct tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc 4620gtcagataca tagatacaat tctattaccc ccatccatac atctagaact agtggatccc 4680ccgggctgca ggaattcgat atcaagcttc acagctagcg cactcggtgc cccgcgcagg 4740gtcgcgatgc tgcccggttt ggcactgttc ctgctggccg cctggacggc tcgggcgctg 4800gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 4860gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 4920atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 4980catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 5040atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaacgcg 5100cggggtaccc cggcgatgaa gctactgtct tctatcgaac aagcatgcga tatttgccga 5160cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg ccaagtgtct gaagaacaac 5220tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc tgactagggc acatctgaca 5280gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc tactgatttt tcctcgagaa 5340gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata taaaagcatt gttaacagga 5400ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag atagattggc ttcagtggag 5460actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg cgacatcatc atcggaagag 5520agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg aattcccggg gatctgggcc 5580cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg 5640gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgg ggattccccg 5700
gggccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg ctctggatat ggccgacttc 5760gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg agtacggtgg gtagggatcc 5820actagtccag tgtggtggaa ttctgcagat atccagcaca gtggcggccg ctcgaccccg 5880ggtgctagca aggccttgtg gccagccatg gcaactagtg cggccgctaa gtaagtaaga 5940cgtcgagctc taagtaagta acggccgcca ccgcggtgga gctttggact tcttcgccag 6000aggtttggtc aagtctccaa tcaaggttgt cggcttgtct accttgccag aaatttacga 6060aaagatggaa aagggtcaaa tcgttggtag atacgttgtt gacacttcta aataagcgaa 6120tttcttatga tttatgattt ttattattaa ataagttata aaaaaaataa gtgtatacaa 6180attttaaagt gactcttagg ttttaaaacg aaaattcttg ttcttgagta actctttcct 6240gtaggtcagg ttgctttctc aggtatagca tgaggtcgct cttattgacc acacctctac 6300cggcatgccg agcaaatgcc tgcaaatcgc tccccatttc acccaattgt agatatgcta 6360actccagcaa tgagttgatg aatctcggtg tgtattttat gtcctcagag gacaatacct 6420gttgtaatcg ttcttccaca cggatcccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacaattc 6480actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 6540ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 6600cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggacg cgccctgtag cggcgcatta 6660agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 6720cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 6780gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 6840aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 6900cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 6960acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 7020tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 7080acgtttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 7140gcaggcaagt gcacaaacaa tacttaaata aatactactc agtaataacc tatttcttag 7200catttttgac gaaatttgct attttgttag agtcttttac accatttgtc tccacacctc 7260cgcttacatc aacaccaata acgccattta atctaagcgc atcaccaaca ttttctggcg 7320tcagtccacc agctaacata aaatgtaagc tttcggggct ctcttgcctt ccaacccagt 7380cagaaatcga gttccaatcc aaaagttcac ctgtcccacc tgcttctgaa tcaaacaagg 7440gaataaacga atgaggtttc tgtgaagctg cactgagtag tatgttgcag tcttttggaa 7500atacgagtct tttaataact ggcaaaccga ggaactcttg gtattcttgc cacgactcat 7560ctccatgcag ttggacgata tcaatgccgt aatcattgac cagagccaaa acatcctcct 7620taggttgatt acgaaacacg ccaaccaagt atttcggagt gcctgaacta tttttatatg 7680cttttacaag acttgaaatt ttccttgcaa taaccgggtc aattgttctc tttctattgg 7740gcacacatat aatacccagc aagtcagcat cggaatctag agcacattct gcggcctctg 7800tgctctgcaa gccgcaaact ttcaccaatg gaccagaact acctgtgaaa ttaataacag 7860acatactcca agctgccttt gtgtgcttaa tcacgtatac tcacgtgctc aatagtcacc 7920aatgccctcc ctcttggccc tctccttttc ttttttcgac cgaattaatt cttaatcggc 7980aaaaaaagaa aagctccgga tcaagattgt acgtaaggtg acaagctatt tttcaataaa 8040gaatatcttc cactactgcc atctggcgtc ataactgcaa agtacacata tattacgatg 8100ctgtctatta aatgcttcct atattatata tatagtaatg tcgtttatgg tgcactctca 8160gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 8220acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 8280ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 8331
<210>11<211>355<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变蛋白质<400>11Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg15 10 15Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His20 25 30Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala3540 45Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val50 55 60Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His65 70 75 80Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu85 90 95Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe100 105 110Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met Lys Leu Leu Ser115 120 125Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys130 135 140Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu145 150 155 160Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His165 170 175
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu180 185 190Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser195 200 205Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn210 215 220Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp225 230 235 240Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser245 250 255Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu260 265 270Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu275 280 285Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu290 295 300Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro305 310 315 320Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala325 330 335Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu340 345 350Tyr Gly Gly355<210>12<211>22<212>PRT<213>酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)<400>12
Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys1 5 10 15Ile Ser Ala Ala Leu Ala20<210>13<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述信号肽<400>13Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu15 10 15Ala<210>14<211>308<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变蛋白质<400>14Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg15 10 15Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His20 25 30Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala35 40 45Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val
50 55 60Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gly Arg Ser Gly Lys Leu Leu65 70 75 80Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys85 90 95Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp100 105 110Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala115 120 125His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe130 135 140Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp145 150 155 160Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp165 170 175Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr180 185 190Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser195 200 205Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Pro210 215 220Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp225 230 235 240Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala245 250 255Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly260 265 270Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met275 280 285
Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp290 295 300Glu Tyr Gly Gly305<210>15<211>6454<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变基因<400>15gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc 900tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc 960tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg 1020actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa 1080acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca 1140tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac 1200aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg 1260ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc 1320tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc 1380tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata 1440taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag 1500atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg 1560cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg 1620
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<223>人工序列描述重组质粒<400>16gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 600ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 660ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca 720aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc 780tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg 840ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 900cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc 960agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 1020cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 1080tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt 1140agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 1200gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 1260tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 1320taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc 1380ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 1440attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 1500catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 1560atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 1620tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg 1680ggacggcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1740gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1800caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1860ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1920tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 1980ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2040tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2100cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 2160gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2220ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct 2280gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg 2340agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2400
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<223>人工序列描述突变基因<400>17atgcttttgc gagctttcct tttcctcttg gctggttttg cagccaaaat atctgcagcg 60ctagctgatg cagaattccg acatgactca ggatatgaag ttcatcatca aaaattggtg 120ttctttgcag aagatgtggg ttcaaacaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggcggt 180gttgtcatag cgacagtgat cgtcatcacc ttggtgatgc tgaagaagaa aggtagatct 240ggcaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 300tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 360tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 420ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 480ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 540aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 600acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 660caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccggggatct gggccccccc gaccgatgtc 720agcctggggg acgagctcca cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg 780ctagacgatt tcgatctgga catgttgggg gacggggatt ccccggggcc gggatttacc 840ccccacgact ccgcccccta cggcgctctg gatatggccg acttcgagtt tgagcagatg 900tttaccgatg cccttggaat tgacgagtac ggtgggggta ctagtggcca gtacacatcc 960attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc 1020aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac 1080ggcgcctag 1089<210>18<211>362
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变蛋白质<400>18Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys15 10 15Ile Ser Ala Ala Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr20 25 30Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser35 40 45Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala50 55 60Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gly Arg Ser65 70 75 80Gly Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu85 90 95Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu100 105 110Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro115 120 125Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu130 135 140Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile145 150 155 160Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu165 170 175Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala180 185 190Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
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<223>人工序列描述突变基因<400>19atgcttttgc gagctttcct tttcctcttg gctggttttg cagccaaaat atctgcagcg 60
ctagctgatg cagaattccg acatgactca ggatatgaag ttcatcatca aaaattggtg 120ttctttgcag aagatgtggg ttcaaacaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggcggt 180gttgtcatag cgacagtgat cgtcatcacc ttggtgatgc tgaagaagaa acagtacaca 240tccattcatc atggtgtggt ggaggttgac gccgctgtca ccccagagga gcgccacctg 300tccaagatgc agcagaacgg ctacgaaaat ccaacctaca agttctttga gcagatgcag 360aacgcgcggg gtaccccggc gatgaagcta ctgtcttcta tcgaacaagc atgcgatatt 420tgccgactta aaaagctcaa gtgctccaaa gaaaaaccga agtgcgccaa gtgtctgaag 480aacaactggg agtgtcgcta ctctcccaaa accaaaaggt ctccgctgac tagggcacat 540ctgacagaag tggaatcaag gctagaaaga ctggaacagc tatttctact gatttttcct 600cgagaagacc ttgacatgat tttgaaaatg gattctttac aggatataaa agcattgtta 660acaggattat ttgtacaaga taatgtgaat aaagatgccg tcacagatag attggcttca 720gtggagactg atatgcctct aacattgaga cagcatagaa taagtgcgac atcatcatcg 780gaagagagta gtaacaaagg tcaaagacag ttgactgtat cgccggaatt cccggggatc 840tgggcccccc cgaccgatgt cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg 900gcgatggcgc atgccgacgc gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat 960tccccgggtc cgggatttac cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc 1020gacttcgagt ttgagcagat gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtgggtag 1080<210>20<211>359<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变蛋白质<400>20Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys15 10 15Ile Ser Ala Ala Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr20 25 30Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser35 40 45Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala50 55 60Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr65 70 75 80Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu
85 90 95Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr100 105 110Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met115 120 125Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys130 135 140Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys145 150 155 160Asn Ash Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu165 170 175Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu180 185 190Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu195 200 205Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe210 215 220Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser225 230 235 240Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala245 250 255Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr260 265 270Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser275 280 285Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His290 295 300Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp305 310 315 320
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<223>人工序列描述突变基因<400>21atgagggcct ggatcttctt tctcctttgc ctggccggga gggctctggc agccccgcta 60gctgatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc 120tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt 180gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc 240attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc 300aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac 360gcgcggggta ccccggcgat gaagctactg tcttctatcg aacaagcatg cgatatttgc 420cgacttaaaa agctcaagtg ctccaaagaa aaaccgaagt gcgccaagtg tctgaagaac 480aactgggagt gtcgctactc tcccaaaacc aaaaggtctc cgctgactag ggcacatctg 540acagaagtgg aatcaaggct agaaagactg gaacagctat ttctactgat ttttcctcga 600gaagaccttg acatgatttt gaaaatggat tctttacagg atataaaagc attgttaaca 660ggattatttg tacaagataa tgtgaataaa gatgccgtca cagatagatt ggcttcagtg 720gagactgata tgcctctaac attgagacag catagaataa gtgcgacatc atcatcggaa 780gagagtagta acaaaggtca aagacagttg actgtatcgc cggaattccc ggggatctgg 840gcccccccga ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg 900atggcgcatg ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc 960ccgggtccgg gatttacccc ccacgactcc gccccctacg gcgctctgga tatggccgac 1020ttcgagtttg agcagatgtt taccgatgcc cttggaattg acgagtacgg tggg 1074<210>22<211>358<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述突变蛋白质<400>22Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu15 10 15Ala Ala Pro Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu20 25 30Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn35 40 45Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr50 55 60Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser65 70 75 80Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu85 90 95Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr100 105 110Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met Lys115 120 125Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys130 135 140Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn145 150 155 160Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr165 170 175Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln180 185 190Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys195 200 205
Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val210 215 220Gln Asp Ash Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val225 230 235 240Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr245 250 255Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val260 265 270Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu275 280 285Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala290 295 300Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser305 310 315 320Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu325 330 335Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly340 345 350Ile Asp Glu Tyr Gly Gly355<210>23<211>95<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物
<400>27ttggtgatgc tgaagaagaa aggtagatct ggcaagctac tgtcttctat cgaa 54<210>28<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>29aattgacgag tacggtgggg gtactagtgg ccagtacaca tccattcatc at52<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>31ccatcgattt tctaaccccc accgta26<210>32<211>6634<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述重组质粒<400>32gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc 900tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc 960tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg 1020actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa 1080acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca 1140tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac 1200aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg 1260ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc 1320tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc 1380tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata 1440taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag 1500atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg 1560
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1.检测γ-分泌酶活性的方法，其中A.使用编码融合蛋白质的转基因，其含有a)第一种核苷酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；B.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白质；C.融和蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.1内部通过细胞中存在的γ-分泌酶切割，从而形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，D.检测所述第一种部分蛋白质和/或第二种部分蛋白质，所述方法的特征在于除了SEQ ID NO.1外所述融合蛋白质不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点信号的一种或多种肽。
2.检测γ-分泌酶活性的方法，其中A.使用转基因，其编码融合蛋白质并且含有下面的成分a)第一种核苷酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；B.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白质；C.融和蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.1内部通过细胞中存在的γ-分泌酶切割，从而形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，D.测定第二种部分蛋白质的量并且从所形成的第二种部分蛋白质的量确定γ-分泌酶的活性，所述方法的特征在于除了SEQ ID NO.1外所述融合蛋白质不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点信号的一种或多种肽。
3.权利要求1和权利要求2之一要求保护的方法，其中肽基序是胱天蛋白酶切割位点。
4.权利要求1到3之一要求保护的方法，其中第一种核苷酸序列编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)或者其部分，其中所述肽是NPTY和/或VEVD。
5.权利要求1到4之一要求保护的方法，其中第一种核苷酸序列编码从氨基酸序列SEQ ID NO.4衍生的蛋白质。
6.权利要求1到4之一要求保护的方法，其中第二种核苷酸序列编码人APP(SEQ ID NO.5)、SUC2(SEQ ID NO.12)或者BM40(SEQ ID NO.13)的信号肽。
7.权利要求1到6之一要求保护的方法，其中信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.5。
8.权利要求1到7之一要求保护的方法，其中启动子是用于在哺乳动物细胞、秀丽隐杆线虫、酵母或者果蝇中表达的启动子。
9.权利要求1到8之一要求保护的方法，其中启动子是CMV、HSVTK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16-2、G0A1、sel-12、ADH1、GAL1、MET3、MET25、MT、Ac5或者Ds47启动子。
10.权利要求1到9之一要求保护的方法，其中细胞是真核细胞。
11.权利要求1到10之一要求保护的方法，其中细胞是人细胞。
12.权利要求1到10之一要求保护的方法，其中细胞是非人细胞。
13.权利要求12中要求保护的方法，其中细胞是HeLa、293、H4、SH-SY5Y、H9、Cos、CHO、N2A、SL-2或者酵母细胞。
14.权利要求12中要求保护的方法，其中细胞是秀丽隐杆线虫细胞。
15.权利要求13中要求保护的方法，其中细胞是转基因秀丽隐杆线虫的成分。
16.权利要求13中要求保护的方法，其中细胞是酿酒酵母细胞。
17.权利要求1到16一项或多项中要求保护的方法，其中融合蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO.6。
18.权利要求1到17一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列位于第一种核苷酸序列的3’末端。
19.权利要求1到18一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码表达为与第一种部分蛋白质和第二种部分蛋白质的融合蛋白质并且可以用于检测第二种部分蛋白质的蛋白质。
20.权利要求1到19一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码含有DNA结合结构域和转录激活结构域的蛋白质。
21.权利要求1到20一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码由GAL4-结合结构域和VP16(GAL4-VP16)的转录激活结构域组成的蛋白质。
22.权利要求1到21一项或多项中要求保护的方法，其中细胞用报道质粒共转染，其中所述报道质粒含有处于可调节启动子控制下的报道子基因。
23.权利要求22中要求保护的方法，其中可调节启动子可通过转录激活结构域激活。
24.权利要求23中要求保护的方法，其中报道质粒编码EGFP(增强的绿色荧光蛋白质)、Ura 3、His 3或Lac Z的报道子基因并且可调节启动子含有GAL4结合位点和HIV的最小启动子。
25.权利要求1到24一项或多项中要求保护的方法，其中转基因含有编码SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.22的核苷酸序列。
26.权利要求1到25一项或多项中要求保护的方法，其中转基因存在于载体中。
27.权利要求1到26一项或多项中要求保护的方法，其中重组载体是pcDNA 3.1+。
28.权利要求1到27一项或多项中要求保护的方法，其中在细胞中未检测到内源γ-分泌酶活性。
29.权利要求1到28一项或多项中要求保护的方法，其中使用cDNA文库共转染细胞。
30.权利要求29中要求保护的方法，其中cDNA文库中存在从人或者非人组织或者人或者非人细胞制备的cDNA。
31.权利要求28到30一项或多项中要求保护的方法的用途，用于鉴定编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，其中a)鉴定其中可以检测到γ-分泌酶活性的细胞和b)从该细胞分离编码γ-分泌酶的cDNA。
32.转基因，其含有a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)第一种核苷酸序列的3’末端的至少一种其他核苷酸序列，其编码DNA结合结构域和转录激活结构域。
33.权利要求32中要求保护的转基因，其中第一种核苷酸序列编码APP或者APP的部分。
34.权利要求32到33一项或多项中要求保护的转基因，其中转基因具有编码SEQ ID NO.14的核苷酸序列。
35.载体，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
36.权利要求35中要求保护的载体，其中载体是载体pDBTrp或pcDNA 3.1+。
37.产生转基因细胞的方法，其中用权利要求35到36一项或多项中要求保护的载体转染细胞。
38.产生转基因秀丽隐杆线虫的方法，其中将权利要求31到33一项或多项中要求保护的转基因微注射到秀丽隐杆线虫的生殖腺。
39.细胞，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
40.转基因秀丽隐杆线虫，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
41.酵母细胞，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
42.细胞，其含有a)权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因；b)cDNA文库，和c)报道质粒。
43.权利要求42中要求保护的细胞的用途，用于鉴定cDNA，所述cDNA编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶。
44.鉴定编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA的方法，其中1)产生权利要求42中要求保护的细胞和2)确定是否形成第二种部分蛋白质。
45.权利要求42中要求保护的细胞的用途，用于鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂的方法中。
46.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中该方法包括下面的方法步骤A.产生转基因非人生物体或者转基因细胞，其中转基因非人生物体或者转基因细胞含有转基因，该转基因含有下面的成分a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；转基因非人生物体或者转基因细胞还含有报道质粒，其携带蛋白质结合位点、最小启动子和报道子基因和，如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，其中转基因非人生物体或者转基因细胞表达转基因和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶；B.将转基因非人生物体或者转基因细胞与待研究的物质孵育和C.测定第二种部分蛋白质的量。
47.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中A.使用转基因，其含有下面的成分a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，c)启动子和，d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；B.该转基因和报道质粒和，如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA掺入到细胞并且在待研究的物质存在下表达所述转基因编码的融合蛋白质和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶，C.融合蛋白质a)经切割，结果形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，或者b)不经细胞中存在的γ-分泌酶切割，结果形成不可检测量的第一和/或第二种部分蛋白质。D.测定第二种部分蛋白质的量。
48.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中在待研究的物质存在下表达编码含有信号肽和SEQ ID NO.1的融合蛋白质的转基因并确定待研究的物质对所形成的第二种部分蛋白质的量的影响，所述第二种部分蛋白质含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
49.γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂，其通过权利要求46-48之一中要求保护的方法鉴定。
50.药物组合物，其含有药学活性化合物，所述药学活性化合物抑制权利要求46-48之一中要求保护的方法中的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
51.制备药物组合物的方法，其包括权利要求46-48之一中要求保护的方法和配制所鉴定的药学活性化合物。
52.制备药物的方法，其包括a)权利要求46-48中一项或多项要求保护的方法和b)将所鉴定的药学活性化合物与药学惰性有机和/或无机赋形剂混合。
53.测试试剂盒，其用于检测γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性，所述试剂盒含有根据前面权利要求任一项的转基因、载体或者细胞。
全文摘要
本发明涉及用于测定γ－分泌酶活性的改进方法，该方法的各自组分和所述方法的用途。本发明涉及测定γ－分泌酶活性和检测γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的改进方法；所述方法的具体实施方案一方面涉及鉴定γ－分泌酶和编码γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的cDNA的方法，另一方面涉及鉴定可以抑制γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法。此类物质尤其重要，因为它们可以用于例如，作为药学活性化合物，例如，用于治疗阿尔茨海默氏病。
文档编号C12Q1/37GK1795203SQ200480014284
公开日2006年6月28日 申请日期2004年4月29日 优先权日2003年5月26日
发明者E·霍佩, G·佩劳斯, J·罗思布拉特, E·莱伯尔, L·默尔肯, S·德赖斯勒 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司