专利名称：欧文氏菌发酵生产门冬酰胺酶方法
技术领域：
本发明是一种欧文氏菌(Erwinia carotovora)发酵生产门冬酰胺酶方法，它属于抗癌药物技术领域。
背景技术：
门冬酰胺酶是一种重要的抗癌药物，临床上主要用于急性白血病、慢性白血病的急性转化例及恶性淋巴瘤等的治疗。
曾有研究报导运用欧文氏菌(Erwinia carotovora)能生产出门冬酰胺酶。不过产出量不大，成本较高。
经试验，我们从土壤分离、纯化培养、诱变育种中获取欧文氏菌菌株。利用这些菌株，经生物技术方法选定的发酵培养基配方及工艺条件能高效产出门冬酰胺酶。
发明内容
本发明可以通过以下技术措施实现高效低成本的目的。一种欧文氏菌(Erwiniacarotovora)发酵生产门冬酰胺酶方法，它包括发酵培养基配方和工艺条件。
A.发酵培养基配方，按重量百分比为玉米浆0.5～10％酵母膏0.1～10％谷胺酸0.1～10％K2HPO40.01～0.5％
Na2SO40.01～0.5％固体培养基时，上配方中须加入琼脂1.0～2.0％。
B.发酵工艺条件(1)摇瓶培养试管菌种接入摇瓶中，每瓶接入菌种2环，培养温度32～42℃，摇床转速100～300rpm，培养时间5～48h，PH值5.0～9.0。
(2)种子罐培养接种量0.1～30％，培养温度32～42℃，搅拌速度80～500rpm，罐压0.02～0.14Mpa，通风量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培养时间5～48h，PH值5.0～9.0。
(3)发酵罐培养接种量1～30％，发酵温度32～42℃，搅拌速度80～450rpm，罐压0.015～0.14Mpa，通风量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培养时间5～48h，发酵液PH值5.0～9.0。
本发明具有如下优点a.可进行大规模生产门冬酰胺酶，生产成本低，具有较高的开发价值。
b.能高效表达门冬酰胺酶，发酵效价≥40IU/ml，最高可达120IU/ml。
具体实施例方式
本发明下面将结合实施例作进一步详述。
例1设定发酵罐500升、种子罐培养接种量为3.0％，发酵罐培养接种量为10％。
A.发酵培养基配方按重量百分比如下玉米浆4％
酵母膏0.2％谷胺酸0.4％K2HPO40.05％Na2SO40.02％B.发酵工艺条件(1)摇瓶培养设定500升发酵罐的装量为300升，种子罐种量300×10％＝30升，摇瓶种量为30×3.0％＝0.9升。按上述配方配0.9升培养液，分装在500ml三角瓶中，每瓶量为100ml，装好后用蒸汽灭菌，冷却至33℃，接入试管菌种，每瓶菌种为2环。摇床转速150rpm，温度控制在33℃，经30h培养后，合并摇瓶种子。
(2)种子罐培养设定用50升的种子罐中，按上面配方配备30-0.9＝29.1升培养基(实际只加水至26升，因为预计灭菌时有3升的蒸汽冷凝水)，培养基灭菌后，待温度降至33℃时，用火焰封口法接入已摇好的摇瓶种子于50升种子罐中，控制种子罐的温度为33℃，搅拌速度为200rpm，通风量为1∶0.5(V/V/min)，罐压为0.03～0.05Mpa，培养24h。
(3)发酵罐培养500升的发酵罐中，实际装量为300-30＝270升。按上面的配方配270升的培养基于500升发酵罐中(实际只加水至250升，因为预计灭菌时有20升的蒸汽冷凝水)，蒸汽灭菌，待温度降至33℃时，种子罐中已培养好的种子经无菌管道接入发酵罐中，控制罐中温度为33℃，搅拌转度为120rpm，风量为1∶0.4(V/V/min)，罐压为0.03～0.06Mpa，培养46h后，离心收集菌体，菌体经提取纯化、冻干后即得门冬酰胺酶。
例2设定发酵罐5000升，种子罐培养接种量为0.3％，发酵罐培养接种量为2％。
A.发酵培养基配方按重量百分比如下玉米浆6％酵母膏8％谷胺酸9％K2HPO40.4％Na2SO40.08％B.发酵工艺条件(1)摇瓶培养设定5000升发酵罐的装量为3500升，则种子罐种量3500×2％＝70升，摇瓶种量为70×0.3％＝0.21升。按上面配方配备0.21升培养基，分别装在500ml三角瓶中，每瓶量为105ml，装好后灭菌，冷却至33℃，接入试管菌种，每瓶菌种为2环。摇床转速250rpm，控制温度为40℃，经15h培养后，合并摇瓶种子。
(2)种子罐培养设定用100升种子罐，按上述配方配备70-0.21＝69.79升培养基(实际只加水至65升，预计灭菌时约有5升的蒸汽冷凝水)，培养基灭菌后，待温度降至40℃时，用火焰封口法接入已摇好的摇瓶种子，控制种子罐的温度为40℃，搅拌转度为180rpm，通风量为1∶0.8(V/V/min)，罐压为0.06～0.09Mpa，培养12h。
(3)发酵罐培养
5000升的发酵罐中，实际装量为3500-70＝3430升。按上述配方配备3430升的培养基于5000升发酵罐中(实际只加水至3380升，预计灭菌时约有50升的蒸汽冷凝水)，灭菌，待温度降至40℃时，把种子罐中已培养好的种子经无菌管道接入发酵罐中，控制罐中温度为40℃，搅拌转度为100rpm，风量为1∶0.3(V/V/min)，罐压为0.03～0.04Mpa，培养18h后，离心收集菌体，菌体经提取纯化、冻干后即得门冬酰胺酶产品。
权利要求
1.一种欧文氏菌(Erwinia carotovora)发酵生产门冬酰胺酶方法，其特征在于A.发酵培养基配方，按重量百分比为玉米浆 0.5～10％酵母膏 0.1～10％谷胺酸 0.1～10％K2HPO40.01～0.5％Na2SO40.01～0.5％固体培养基时，上配方中须加入琼脂1.0～2.0％；B.发酵工艺条件(1)摇瓶培养试管菌种接入摇瓶中，每瓶接入菌种2环，培养温度32～42℃，摇床转速100～300rpm，培养时间5～48h，PH值5.0～9.0；(2)种子罐培养接种量0.1～20％，培养温度32～42℃，搅拌速度80～500rpm，罐压0.02～0.14Mpa，通风量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培养时间5～48h，PH值5.0～9.0；(3)发酵罐培养接种量1～30％，发酵温度32～42℃，搅拌速度80～450rpm，罐压0.015～0.14Mpa，通风量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培养时间5～48h，发酵液PH值5.0～9.0。
全文摘要
本发明是一种欧文氏菌(Erwinia carotovora)发酵生产门冬酰胺酶方法。它采用生物技术从土壤分离、纯化培养、诱变育种中获取欧文氏菌菌株。利用这些菌株，经选定的发酵培养基配方及工艺条件，能高效产出门冬酰胺酶。本发明具有如下优点可进行大规模生产，因此成本较低；能高效表达门冬酰胺酶，发酵效价≥40IU/ml，最高可达120IU/ml。
文档编号C12N1/20GK1891819SQ20051003558
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者梁淑娃, 彭中健, 夏枫耿, 杜少平, 蓝碧锋, 谭颖嫦, 杨冠东, 张学智 申请人:广州市微生物研究所