用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基，其解决了常规培养基在培养噬夏孢欧文氏菌中，玉米黄素二葡萄糖苷产量较低的技术问题，其重量份组成为：酵母粉22份，氯化钠5份，硝酸钾3份，柠檬酸三钠3份，磷酸氢二钾3份，硫酸锰0.1份，氯化铁0.02份，葡萄糖16份，麦芽糖7份，烟酸0.0006份，维生素B60.0005份，环磷酸腺苷0.0001份，蒸馏水1000份。本发明可用于噬夏孢欧文氏菌的培养中。
【专利说明】用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培养基，具体说是一种用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄 糖苷的培养基。
【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素是一类重要天然色素的总称，目前已经发现了 750多种天然类胡萝卜 素，呈现红色、橙红色和黄色等各种颜色。动物不能合成类胡萝卜素，类胡萝卜素在预防人 体心血管疾病、预防眼睛疾病、预防骨质疏松、防癌抗癌、抗氧化以及增强免疫力等方面起 着非常重要的作用。但类胡萝卜素的脂溶性使其在水溶性饮料、食品中着色效果差，人体的 吸收率也低，从而限制了其在饮料、食品中的应用。
[0003] 玉米黄素二葡萄糖苷是一种稀有类胡萝卜素，在自然界的含量很低。由玉米黄素 与两个葡萄糖分子缩合而成。葡萄糖分子是极性分子，从而使玉米黄素二葡萄糖苷分子的 极性增强，疏水性降低。玉米黄素二葡萄糖苷是已知的自然界中极性最强的一种类胡萝卜 素，其水溶性比玉米黄素高63倍。玉米黄素二葡萄糖苷呈黄色，可以作为一种天然食用色 素。
[0004] 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora)是一种非光合细菌，可在菌体中累积玉米 黄素二葡萄糖苷，所以菌体呈黄色。大量培养噬夏孢欧文氏菌来发酵生产玉米黄素二葡萄 糖苷，是一种合成这种天然极性类胡萝卜素的方法。
[0005] 但是，使用现有的常用细菌培养基培养噬夏孢欧文氏菌，玉米黄素二葡萄糖苷的 产量较低，如使用LB培养基培养噬夏孢欧文氏菌48h，玉米黄素二葡萄糖苷的产量只有 0. 67mg/L 左右。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决现有培养基在培养噬夏孢欧文氏菌中，玉米黄素二葡萄 糖苷产量较低的技术问题，提供一种可使玉米黄素二葡萄糖苷的产量比常规培养基高出 197 %左右的培养基。
[0007] 为此，本发明提供一种用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基， 其重量份组成为：酵母粉18-26份，氯化钠3-8份，硝酸钾1-5份，柠檬酸三钠1-5份，磷酸 氢二钾2-4份，硫酸锰0. 05-0. 2份，氯化铁0. 01-0. 03份，葡萄糖14-18份，麦芽糖5-8份， 烟酸0. 0001-0. 001份，维生素 B60. 0001-0. 001份，环磷酸腺苷0. 00005-0. 0002份，蒸馏水 1000 份。
[0008] 优选地，用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基，其重量份组成 为：酵母粉22份，氯化钠5份，硝酸钾3份，柠檬酸三钠3份，磷酸氢二钾3份，硫酸锰0. 1 份，氯化铁0. 02份，葡萄糖16份，麦芽糖7份，烟酸0. 0006份，维生素 B60. 0005份，环磷酸 腺苷0. 0001份，蒸馏水1000份。
[0009] 将噬夏孢欧文氏菌培养于100mL上述培养基中，30°C下，150r/min摇床培养48h ; 培养液5000r/min离心lOmin，弃上清，加入25mL丙酮，冰浴条件下超声波破碎菌体细胞10 次，每次l〇s,每次间隔90s ;细胞裂解液8000r/min离心15min，取上清液。
[0010] 上清液中玉米黄素二葡萄糖苷的含量经HPLC分析，流动相A :甲醇/水（95:5, v/ V)，流动相B :甲醇/四氢呋喃（7:3, v/v);采用线性洗脱，流动相A洗脱5min，第5-10min流 动相B从0上升到100%，之后流动相B洗脱保持8min ;流速为1. OmL/min ;进样量为20 μ L。 根据玉米黄素二葡萄糖苷标准品绘制的标准曲线，以色谱图中玉米黄素二葡萄糖苷吸收峰 的峰面积推算出玉米黄素二葡萄糖苷的量。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0012] 实施例中所用酵母粉（Yeast Extract)为英国0X0ID公司产品，噬夏孢欧文氏菌 Erwinia uredovora 20D3(ATCC 19321)购自美国模式菌种收集中心（ATCC)。
[0013] 实施例1
[0014] 准确称取18g酵母粉，3g氯化钠，lg硝酸钾，lg柠檬酸三钠，2g磷酸氢二钾，0. 05g 硫酸锰，0. 〇lg氯化铁，14g葡萄糖，5g麦芽糖，溶于995mL蒸馏水中，混匀，使所加的物质均 溶于水，调节pH至6. 0,然后装入三角瓶中，121 °C灭菌20min，冷却至室温，得到培养基A。
[0015] 准确称取O.OOlg烟酸，O.OOlg维生素 B6，(X 0005g环磷酸腺苷（cAMP)，溶解于 50mL蒸馏水中，用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，得滤液。
[0016] 按照无菌操作要求，在超净工作台中取5mL经微孔滤膜过滤除菌的滤液加入培养 基A中，混合均匀，得噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基。
[0017] 将活化好的噬夏孢欧文氏菌按5% (v/v)的接种量接入上述培养基中，30°C， 150r/min摇床培养48h，测算玉米黄素二葡萄糖苷的产量为1. 47mg/L。
[0018] 实施例2
[0019] 准确称取22g酵母粉，5g氯化钠，3g硝酸钾，3g柠檬酸三钠，3g磷酸氢二钾，0. lg 硫酸锰，0. 02g氯化铁，16g葡萄糖，7g麦芽糖，溶于995mL蒸馏水中，混匀，使所加的物质均 溶于水，调节pH至6. 0,然后装入三角瓶中，121 °C灭菌20min，冷却至室温，得到培养基A。
[0020] 准确称取0· 006g烟酸，0· 005g维生素 B6,0. 001g环磷酸腺苷（cAMP)，溶解于50mL 蒸馏水中，用〇. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，得滤液。
[0021] 按照无菌操作要求，在超净工作台中取5mL经微孔滤膜过滤除菌的滤液加入培养 基A中，混合均匀，得噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基。
[0022] 将活化好的噬夏孢欧文氏菌按5% (v/v)的接种量接入上述培养基中，30°C， 150r/min摇床培养48h，测算玉米黄素二葡萄糖苷的产量为1. 98mg/L。
[0023] 实施例3
[0024] 准确称取26g酵母粉，8g氯化钠，5g硝酸钾，5g柠檬酸三钠，4g磷酸氢二钾，0. 2g 硫酸锰，0. 03g氯化铁，18g葡萄糖，8g麦芽糖，溶于995mL蒸馏水中，混匀，使所加的物质均 溶于水，调节pH至6. 0,然后装入三角瓶中，121 °C灭菌20min，冷却至室温，得到培养基A。
[0025] 准确称取0· 01g烟酸，维生素0· 01g B6, (λ 002g环磷酸腺苷（cAMP)，溶解于50mL 蒸馏水中，用〇. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，得滤液。
[0026] 按照无菌操作要求，在超净工作台中取5mL经微孔滤膜过滤除菌的滤液加入培养 基A中，混合均匀，得噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基。
[0027] 将活化好的噬夏孢欧文氏菌按5% (v/v)的接种量接入上述培养基中，30°C， 150r/min摇床培养48h，测算玉米黄素二葡萄糖苷的产量为1. 55mg/L。
[0028] 实施例4
[0029] 准确称取10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，溶于1000mL蒸馈水中，混勻，使所 加的物质均溶于水，调节pH至7. 0,然后装入三角瓶中，121 °C灭菌20min，冷却至室温，得到 LB培养基。
[0030] 将活化好的噬夏孢欧文氏菌按5 % (v/v)的接种量接入上述LB培养基中，30°C， 150r/min摇床培养48h，测算出噬夏孢欧文氏菌在LB培养基中培养48h后的玉米黄素二葡 萄糖苷的产量为〇. 67mg/L。
[0031] 本发明中，培养基的制备方法，包括以下步骤：向995mL蒸馏水中加入按量称取的 酵母粉、氯化钠、硝酸钾、柠檬酸三钠、磷酸氢二钾、硫酸锰、氯化铁、葡萄糖、麦芽糖，混匀， 使所加的物质均溶于水，调节pH至6. 0,装入三角瓶中，121°C灭菌20min，得到培养基A。
[0032] 受分析天平分辨率的限制，按10倍量称取烟酸、维生素 B6、环磷酸腺苷（cAMP)，溶 于50mL蒸馏水中，用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，得滤液。
[0033] 按照无菌操作要求，在超净工作台中取5mL经微孔滤膜过滤除菌的滤液加入培养 基A中，混合均匀，得噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基。
[0034] 将噬夏孢欧文氏菌培养于上述培养基中，30°C，150r/min摇床培养。
[0035] 实施例1、2、3是用本发明提供的培养基培养噬夏孢欧文氏菌的结果，实施例4是 用常规细菌培养基LB培养基培养噬夏孢欧文氏菌的结果，实施例1、2、3中玉米黄素二葡萄 糖苷的产量分别比实施例4的产量多121 %、197%、133%。
【权利要求】
1. 一种用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基，其特征是所述培养基 的重量份组成为：酵母粉18-26份，氯化钠3-8份，硝酸钾1-5份，柠檬酸三钠1-5份，磷酸 氢二钾2-4份，硫酸锰0. 05-0. 2份，氯化铁0. 01-0. 03份，葡萄糖14-18份，麦芽糖5-8份， 烟酸0. 0001-0. 001份，维生素 B60. 0001-0. 001份，环磷酸腺苷0. 00005-0. 0002份，蒸馏水 1000 份。
2. 根据权利要求书1所述的用于噬夏孢欧文氏菌发酵玉米黄素二葡萄糖苷的培养基， 其特征在于：酵母粉22份，氯化钠5份，硝酸钾3份，柠檬酸三钠3份，磷酸氢二钾3份，硫 酸锰0. 1份，氯化铁0. 02份，葡萄糖16份，麦芽糖7份，烟酸0. 0006份，维生素 B60. 0005 份，环磷酸腺苷〇. 0001份，蒸馏水1000份。
【文档编号】C12P19/44GK104195208SQ201410440726
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】汪靖超, 李荣贵, 杜桂彩 申请人:青岛大学