专利名称:一种利用欧文氏杆菌提取β-甘露聚糖酶的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及同一发酵液通过分流同时制备菌剂和酶制剂的工艺。菌剂主要用于草本纤维的提取与精制，包括纺织行业的麻类生物脱胶、造纸行业的生物制浆以及酒精生产行业的草本纤维原料生物糖化；β -甘露聚糖酶在食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采及生物技术研究等多方面得到广泛运用。
背景技术：
(一)国内外发展现状与趋势
1、开发草本纤维资源是全球发展趋势
伴随石油和森林资源的短缺以及人类生活质量的提高，国内外纺织和造纸行业正在兴起草本纤维资源开发利用的热潮。草本纤维除了用作纺织原料以外，近年来开发出了建材、高档纸浆、汽车零部件、装饰材料、可降解农膜等多种新产品，开发利用潜力极大。目前，俄罗斯、埃及等亚麻主产国正在加紧亚麻产业的发展；美国、日本、法国、比利时、意大利等发达国家正在发展红麻产业；印度尼西亚、马来西亚等国纷纷引种苎麻；菲律宾、巴西、 新西兰等热带国家正在大力开发龙舌兰麻、菠萝麻等麻类纤维的新用途；印度、孟加拉正在加紧黄麻服饰的研制，基本形成了 “以麻补棉”和“以草代木”的态势。
2、微生物发酵是草本纤维提取与精制的发展方向
国际上正在或可能开发的草本纤维植物涉及19科37属200多个种，其纤维多包裹在植株的茎杆或叶片中。这些天然草本纤维原料不仅包括大量含糖量极低的非键合型物质，如角质化程度很高的表皮，而且含有20% -30%的成分复杂并与纤维素键合的非糖类物质，如果胶、木质素等，很难采用简单方法糖化。在提取草本纤维素方面，传统的天然水怄制方法存在周期长、不适宜大规模生产、污染空气、影响水产业发展等问题，常规化学脱胶或制浆方法存在消耗大量化工原料和能源、损伤纤维产量与品质、严重污染环境等问题，制约了草本纤维开发利用产业的发展。为此，国内外正在广泛开展“生物脱胶”和“生物制浆” 工艺的研究。由于麻类等草本纤维原料中非纤维素物质的成分复杂、结构牢固，而微生物产酶的种类和数量难尽人意，酶制剂的应用成本太高而且因为降解非纤维素的机制不清楚以至于处理效果不理想，菌制剂的功能不强而且发酵周期偏长，所以，尽管开展生物法提取与精制麻类纤维的研究历史长达80年之久，但真正达到生产实用水平的成果，国外的报道还十分罕见。究其原因，就是针对麻类等草本纤维原料非纤维素物质的成分与结构特点而采取基因工程手段定向改良菌种的工作做得太少。
3、甘露聚糖酶的用途日趋广泛
β -甘露聚糖酶(β -1，4-D-mannanohydrolase)，是一类能水解含有 β _1，4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳葡甘聚糖等)的内切酶，属于半纤维素酶类。随着对自然界半纤维素资源的开发和甘露寡糖药用价值的发现， β-甘露聚糖酶的研究和开发已进入了一个新高潮，它已在食品、饲料、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物技术研究等多方面得到广泛运用。微生物是产生甘露聚糖酶的重要来源。已报道提取甘露聚糖酶的常见类群包括细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌， 真菌里的曲霉、木霉、酵母、青霉、梭胞菌、多孔菌、核盘菌和放线菌的链霉菌等。
( 二)本发明形成的技术基础
1、中国率先突破了生物脱胶与生物制浆的技术难关
中国农业科学院麻类研究所连续35年专业从事麻类生物脱胶与生物制浆技术研究，积累了丰富的经验和资料，造就了一大批专业技术人才，选育出100多株具有特殊功能的菌种，研究形成了 14项处于国内外领先水平科技成果，率先突破了麻类生物脱胶和草类生物制浆的技术难关。同时，创建了农业部麻类遗传改良与工程微生物重点开放实验室、国家麻类脱胶与制浆微生物菌种保藏中心、湖南省麻类遗传育种及麻产品生物加工重点实验室、麻类加工生物制剂中试车间等技术创新平台。
2、本发明申请前形成的相关专利技术
中国农业科学院麻类研究所作为专利权人，已经获得授权的发明专利包括(1) 苎麻细菌化学联合脱胶技术，专利号ZL85103481 ;(2)苎麻生物脱胶工艺综合治废方法与设备，专利号:ZL90105510. 7 ； (3)苎麻生物脱胶工艺技术与设备，专利号ZL95112564. 8 ； (4)草本纤维工厂化脱胶或制浆用高效菌剂制备工艺，专利号ZL02108820.9。已经申请的发明专利(含在审专利)包括(1) 一种红麻脱胶生物制剂制备工艺，申请号01145354. 0 ； (2) —种高效节能清洁性红麻韧皮生物制浆工艺，申请中国发明专利并已公布，公开号 CN1451815A ;(3)工厂化条件下龙须草/红麻韧皮生物制浆工艺，申请中国发明专利并已公布，公开号CN1517486A;(4)高效低耗清洁型麦草生物制浆工艺，申请中国发明专利并已进入实审阶段，申请号200410046963. 1。
3、基因工程手段改良欧文氏杆菌取得显著进展
在已经获得国家发明专利一苎麻生物脱胶工艺技术与设备的基础上，采用基因工程手段对T85-260菌株进行改良，获得了一个对草本纤维原料中非纤维素降解具有高效性和广谱性的欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198。
近期研究结果表明，将该菌株制成液态菌剂替代已有专利技术制备的高效菌剂在工厂使用的效果十分理想；测定7. 5h发酵液中β-甘露聚糖酶酶活达到99. 4U/ml，将提取 CXJZ菌剂时分流出来的发酵液经过超滤一盐析一有机溶剂分离一柱层析纯化等程序处理， 获得甘露聚糖酶样品，纯化甘露聚糖酶样品的活性达到1490U/ml，因此，形成了采用国际先进的关键性工艺设备将CXJZ菌株发酵液分流，同时制备脱胶与制浆高效菌剂及 β-甘露聚糖酶的工艺。该工艺不仅降低了草本纤维原料工厂化脱胶与制浆菌剂的生产成本，而且表明利用同一发酵液制备甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。
4、与国内外同类技术产品的质量性能比较
(1)草本纤维原料脱胶或制浆高效液态菌剂
国内外关于麻类脱胶生物制剂的研究报道很少，印度Bhattacharyya S. K. (1992) 报道了用4种细菌混合培养物处理黄麻7天，孟加拉Mohiuddin G. Shamsul Haque (1998)报道了利用真菌过培养物(粗酶液)处理hard bark(脱胶不完全的基部)5天可以达到脱胶的目的。草本纤维原料脱胶或制浆高效菌剂只需处理7h即可达到脱胶或制浆的目的，不仅时间短得多，而且处理原料种类也多得多，即本项目产品具有明显的“高效性”和“广谱性”
4优势。
(2)甘露聚糖酶制剂
国内外关于甘露聚糖酶的研究报道远不及淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶多，尤其是投入工业化生产的报道更少。
表1本项目甘露聚糖酶制剂性能与国内外代表性报道结果比较
序号甘露聚糖酶来源发酵周期发酵液酶活精制酶活1欧文氏杆菌7h170u / ml2000u / mlck-1毕赤酵母基因工程菌(HBM047)62h1 OOOu / mlck-2嗜碱芽孢杆菌46h500u / mlck-3Aspergillus niger96h150u / mlck-4BaciIluss. Iicheniformis36h260u / ml
本项目研制出的甘露聚糖酶制剂不仅活力高，而且发酵周期极短，即生产成本大幅度降低。
5、拟解决的实际问题
(1)集中制备菌剂以降低实施生物脱胶与生物制浆工艺的技术难度
1985年研究形成第一代苎麻生物脱胶技术一一苎麻细菌化学联合脱胶技术曾经在5家企业得到推广应用。导致后来停产的原因之一是因为企业难以掌握菌种制备技术， 尤其是菌种退化或变异的技术问题难以解决。事实上，国外没有生物脱胶技术用于大规模生产的成功先例可借鉴，国内麻类脱胶与草类制浆企业大多还是采用化学方法，因此，要实施生物脱胶与生物制浆工艺，菌种制备难免不是一个制约因子。本发明采用集中制备菌剂提供给企业应用可以大幅度降低企业实施生物脱胶与生物制浆工艺的技术难度。
(2)同一发酵液提取菌体及其分泌物以降低产品加工成本
国内外选育甘露聚糖酶高产菌株的研究起步比较晚、成效比较少，所以，尽管甘露聚糖酶的市场前景很好，但是由于加工成本比较高以至于产业发展比较慢。同时，相对于纺织、造纸等行业来说，麻类脱胶与草类制浆只是一个从草本纤维原料中提取纤维的初步加工过程，如果高效菌剂生产成本过高，必然导致终产品缺乏市场价格方面的竞争力。本发明根据市场需求和已有珍稀资源，采用国际先进的关键性工艺设备分流同一发酵液提取菌体及其分泌物，可以大幅度降低麻类脱胶与草类制浆专用菌剂和甘露聚糖酶的加工成本。
发明内容
(一 )整体技术方案
本发明采用国际先进的关键性工艺设备，如自动控制发酵罐、超滤、柱层析装置等，对欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198的发酵液进行分流后，分别精制成高效液态菌剂和甘露聚糖酶。技术方案包括原种活化、一级种子、二级种子、发酵、蛋白酶抑制、粗分离、微滤、超滤、盐析、溶析、层析、洗涤、配方、真空包装工序以及浓缩高效液态菌剂和甘露聚糖酶
产品ο
(二)具体
发明内容
1、原种活化
原种活化，取CXJZ95-198典型菌落接种到普通葡萄糖营养肉汤培养基，在120r/ min-180r/min、33°C _:35°C下振荡培养5. Oh-5. 5h获得种子菌液。
2、一级种子培养
将活化CXJZ95-198种子菌液接种到实验室用通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的浓度依次为0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接种量 2 %，温度 31 °C -35 °C，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5_7h。
3、二级种子培养
将一级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然 ρΗ 值，接种量 2 %，温度 31°C -35 V，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L,搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5H
4、发酵
将二级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，温度31 V -35 V，通气量为0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,搅拌速率为 180r/min-220r/min，接种量5%，发酵7_8h，发酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
5、蛋白酶抑制
发酵结束时向发酵液里添加适量蛋白酶抑制剂，以终止发酵并保护胞外酶活性。
6、粗分离
成熟的发酵液采用5 μ m粗滤膜进行固液分离，弃去大于5 μ m的固形物。
7、微滤
以0. 2 μ m微滤膜对小于5 μ m的液相分流物进一步分离，并浓缩大于0. 2 μ m分流物10-15倍。
8、洗涤
采用适量8. 5g/L的生理盐水对大于0. 2 μ m固形物进行反复洗涤，直至无可溶性糖类物质，获得浓缩高效菌液。
(以上7-8合称“浓缩高效菌液精制”)
9、超滤
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包对小于0. 2 μ m的液相分流物进行超滤浓缩， 浓缩倍数为15-25倍。
10、盐析
采用硫酸铵分级沉淀法对分子量在IOOkD-IOkD的蛋白质进行分离获得甘露聚糖酶液，硫酸铵饱和度的范围是45^-70 ^
11、溶析[0055]采用丙酮沉淀法进一步纯化硫酸铵沉淀物，丙酮对甘露聚糖酶液的比例范围是 1. 2 1-1.8 1。
12、层析
采用kphadex G_100凝胶层析柱进一步纯化丙酮沉淀法获得的甘露聚糖酶液，最终获得层析纯甘露聚糖酶液。
(以上9-12合称“甘露聚糖酶液精制”)
13、配方
添加适量常规防腐剂、添加剂对浓缩高效菌液以及层析纯甘露聚糖酶液予以保护。
14、真空包装
将配方后的浓缩高效菌液以及层析纯甘露聚糖酶液分装于相应容器，加盖并装入塑料真空包装袋，采用真空包装机抽气、密封。
15、浓缩高效液态菌剂
浓缩高效液态菌剂呈淡黄绿色液体，无味，活菌量达到KTcfu/ml，适用于苎麻、红麻、亚麻、罗布麻、黄麻进行生物脱胶和龙须草、红麻韧皮、麦草、烟梗进行生物制浆以及草本纤维原料生产酒精的生物糖化加工工艺。
16、甘露聚糖酶
浓缩液态甘露聚糖酶呈褐色或棕褐色的液体，具有酸的特殊气味，酶活力在 2000U/ml以上，含菌量彡lOOOOcfu/ml，广泛用于食品、医药、饲料、造纸、纺织、石油开采等工业领域。
(三)本发明创新点
在国内外率先选育出对草本纤维原料非纤维素物质降解具有高效性和广谱性的欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198，由此深入研究形成了一系列处国际领先水平的发明专利和鉴定成果。本项目进一步利用该菌株生产甘露聚糖酶制剂，在国内外均未见报道。甘露聚糖酶制剂的活力比来源于基因工程菌株并投入规模化生产的产品提高1倍。同时，所用菌株产酶的发酵周期仅需几左右，这在国内外都未见报道。采用国际先进的关键性工艺设备对同一发酵液进行分流后分别精制出菌剂和酶制剂，不仅在微生物工业史上开创了同一发酵液提取菌体及其分泌物两类产品的先例，而且大幅度提升了微生物产品在生产成本方面的竞争力。本发明的主要创新点包括一级种子培养、二级种子培养、发酵、粗分离、浓缩高效菌液精制、甘露聚糖酶液精制工艺环节以及浓缩高效液态菌剂和甘露聚糖酶产品，具体内涵是
1、一级种子培养
将活化CXJZ95-198种子菌液接种到实验室用通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的浓度依次为0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接种量 2 %，温度 31 °C -35 °C，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5_7h。
2、二级种子培养
将一级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、0. 05 %、0. 05 %，自然 pH 值，接种量 2 %，温度 31°C -35 V，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L,搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5H
3、发酵
将二级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，温度31 V -35 V，通气量为0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,搅拌速率为 180r/min-220r/min，接种量5%，发酵7_8h，发酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
4、粗分离
成熟的发酵液采用5u粗虑膜进行固液分离，弃去大于5u的固形物。
5、浓缩高效菌液精制
以0. 2 μ m微滤膜对小于5 μ m的液相分流物进一步分离，并浓缩大于0. 2 μ m分流物10-15倍；采用适量8. 5g/L的生理盐水对大于0. 2 μ m固形物进行反复洗涤，直至无可溶性糖类物质，获得浓缩高效菌液。
6、甘露聚糖酶液精制
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包对小于0. 2 μ m的液相分流物进行超滤浓缩， 浓缩倍数为15-25倍；采用硫酸铵分级沉淀法对分子量在IOOkD-IOkD的蛋白质进行分离获得甘露聚糖酶液，硫酸铵饱和度的范围是45% -70% ；采用丙酮沉淀法进一步纯化硫酸铵沉淀物，丙酮对甘露聚糖酶液的比例范围是1. 2 1-1.8 1采用kphadex G-100凝胶层析柱进一步纯化丙酮沉淀法获得的甘露聚糖酶液，最终获得层析纯甘露聚糖酶液。
7、浓缩高效液态菌剂
浓缩高效液态菌剂呈淡黄绿色液体，无味，活菌量达到KTcfu/ml，适用于苎麻、红麻、亚麻、罗布麻、黄麻进行生物脱胶和龙须草、红麻韧皮、麦草、烟梗进行生物制浆以及草本纤维原料生产酒精的生物糖化加工工艺。
8、甘露聚糖酶
浓缩液态甘露聚糖酶呈褐色或棕褐色的液体，具有酸的特殊气味，酶活力在 2000U/ml以上，含菌量彡lOOOOcfu/ml，广泛用于食品、医药、饲料、造纸、纺织、石油开采等工业领域。
四、
1-原种；2—活化；3— —级种子；4— 二级种子；5—发酵；6—蛋白酶抑制； 7—粗分离；8-微滤；9-超滤；10-盐析；11-溶析；12-层析；13-洗涤；14-配方； 15-真空包装；16-菌剂；17-甘露聚糖酶。
五具体实施方式
(一 )技术方案
本发明涉及的技术方案包括原种活化、种子培养、发酵、蛋白酶抑制、粗分离、微滤、超滤、盐析、溶析、柱层析、配方、包装等工艺步骤(工序)。
1、原种活化
原种活化，取CXJZ95-198典型菌落接种到普通葡萄糖营养肉汤培养基，在120r/
8min-180r/min、33°C _:35°C下振荡培养5. Oh-5. 5h获得种子菌液。
2、一级种子培养
将活化CXJZ95-198种子菌液接种到实验室用通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的浓度依次为0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接种量 2 %，温度 31 °C -35 °C，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5_7h。
3、二级种子培养
将一级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、 0. 05%、0. 05%，自然 ρΗ 值，接种量 2%，温度 31°C _:35°C，通气量为 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L，搅拌速率为180r/min-260r/min，培养时间5H
4、发酵
将二级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的浓度依次为 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、
0.05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，温度31 V -35 V，通气量为0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,搅拌速率为 180r/min-220r/min，接种量5%，发酵7_8h，发酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
5、蛋白酶抑制
发酵结束时向发酵液里添加适量蛋白酶抑制剂，以终止发酵并保护胞外酶活性。
6、粗分离
成熟的发酵液采用5 μ m粗滤膜进行固液分离，弃去大于5 μ m的固形物。
7、微滤
以0. 2 μ m微滤膜对小于5 μ m的液相分流物进一步分离，并浓缩大于0. 2 μ m分流物10-15倍。
8、洗涤
采用适量8. 5g/L的生理盐水对大于0. 2 μ m固形物进行反复洗涤，直至无可溶性糖类物质，获得浓缩高效菌液。
9、超滤
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包对小于0. 2 μ m的液相分流物进行超滤浓缩， 浓缩倍数为15-25倍。
10、盐析
采用硫酸铵分级沉淀法对分子量在IOOkD-IOkD的蛋白质进行分离获得甘露聚糖酶液，硫酸铵饱和度的范围是45^-70 ^
11、溶析
采用丙酮沉淀法进一步纯化硫酸铵沉淀物，丙酮对甘露聚糖酶液的比例范围是
1.2 1-1.8 1。
12、层析
采用kphadex G_100凝胶层析柱进一步纯化丙酮沉淀法获得的甘露聚糖酶液，最终获得层析纯甘露聚糖酶液。
13、配方[0113]添加适量常规防腐剂、添加剂对浓缩高效菌液以及层析纯甘露聚糖酶液予以保护。
14、真空包装
将配方后的浓缩高效菌液以及层析纯甘露聚糖酶液分装于相应容器，加盖并装入塑料真空包装袋，采用真空包装机抽气、密封。
(二)实验规模与地点
本实施例在实验室条件下进行，发酵批量为12L/罐；实验地点中国农业科学院麻类研究所。
(三)实施效果
1、草本纤维原料脱胶或制浆浓缩高效液态菌剂
采用16L自动控制发酵罐以及上述技术方案试验200多次，生产高效液态菌剂将近200kg，即每罐发酵液(12L)可生产高效液态菌剂lkg。产品主要技术规格如表2所示。这些菌剂除了在实验室用于红麻韧皮、麦草的生物制浆技术研究以外，大量用于工厂化条件下苎麻、亚麻、红麻生物脱胶试验。工厂化应用试验结果显示，与常规化学脱胶或制浆工艺比较，①烧碱用量减少70%以上；②动力能耗节省20%以上；③细浆得率提高5个百分点； ④工业综合废水水质单一，直接进入生物氧化处理且易于达标，污水处理成本节省约60%。
表2菌剂的主要技术规格
权利要求
1.一种利用欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工艺，包括以下步骤(1)一级种子培养将欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198活化菌液接种到实验室用通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl，浓度依次为0. 5%,0. 2%,0. 5%,0. 5%,0. 5%,自然pH值，接种量2%，温度31°C 35°C，通气量为0. 2dm3/L 0. 8dm3/L，搅拌速率为180r/min 260r/min，培养时间5 7h ；(2)二级种子培养将一级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置，配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4, MgSO4 · 7H20的浓度依次为1.0%, 0. 2%,0. 05%,0. 05%,0. 05%,自然pH值，接种量2%，温度 31°C 35°C，通气量为 0. 2dm3/ L 0. 8dm3/L，搅拌速率为180r/min 260r/min，培养时间5 7h ；(3)发酵将二级种子培养液接种到普通通气搅拌式发酵罐中，培养基以自来水配置， 配方是豆饼粉、魔芋粉、NH4H2PO4、K2HP04、MgSO4 ·7Η20的浓度依次为1. 5%,0. 3%,0. 05%, 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，温度31 °C 35 °C，通气量为0. 4dm3/L 1 · 2dm3/L，搅拌速率为 180r/min 220r/min，接种量5%，发酵7 8h，发酵液β-甘露聚糖酶活力180U/ml以上；(4)粗分离将成熟的发酵液采用5μ m粗滤膜进行固液分离，弃去大于5 μ m的固形物；(5)浓缩高效菌液精制以0.2 μ m微滤膜对小于5 μ m的液相分流物进一步分离，并浓缩大于0. 2 μ m分流物10 15倍；采用适量8. 5g/L的生理盐水对大于0. 2 μ m固形物进行反复洗涤，直至无可溶性糖类物质，获得浓缩高效菌液；(6)β-甘露聚糖酶液精制采用不同分子量IOOkD IOkD的膜包对小于0.2μπι的液相分流物进行超滤浓缩，浓缩倍数为15 25倍；采用硫酸铵分级沉淀法对分子量在 IOOkD IOkD的蛋白质进行分离获得β-甘露聚糖酶液，硫酸铵饱和度的范围是45% 70% ；采用丙酮沉淀法进一步纯化硫酸铵沉淀物，丙酮对β-甘露聚糖酶液的比例范围是 1.2 1 1.8 1 ；采用S印hadexG-100凝胶层析柱进一步纯化甘露聚糖酶液，最终获得层析纯β-甘露聚糖酶液。
2.如权利要求
1所述的一种利用欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工艺，所述浓缩高效菌液呈淡黄绿色液体，无味，活菌量达到liTcfu/ml。
3.如权利要求
1所述的一种利用欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工艺，所述层析纯β “甘露聚糖酶液呈褐色或棕褐色液体，具有酸的特殊气味，酶活力在 2000U/ml 以上，含菌量< 10000cfu/ml。
专利摘要
本发明涉及生物制剂行业一种利用欧文氏杆菌提取β-甘露聚糖酶的工艺。其技术方案包括原种活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵、蛋白酶抑制、粗分离、浓缩高效菌液精制、甘露聚糖酶液精制、配方、真空包装工艺环节以及浓缩高效液态菌剂和甘露聚糖酶产品。该发明采用集中制备菌剂方案可以降低实施生物脱胶与生物制浆工艺的技术难度，从同一发酵液提取菌体及其分泌物可以降低产品加工成本。采用本发明技术方案生产的浓缩高效液态菌剂适用于麻类生物脱胶和草类生物制浆以及草本纤维原料生产酒精的生物糖化加工工艺；甘露聚糖酶广泛用于食品、医药、饲料、造纸、纺织、石油开采工业领域。
文档编号C12N9/24GKCN1978636 B发布类型授权 专利申请号CN 200510032497
公开日2011年9月21日 申请日期2005年12月5日
发明者冯湘沅, 刘正初, 张运雄, 彭源德, 段盛文, 胡镇修, 郑科 申请人:中国农业科学院麻类研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),